BÁO CÁO THỰC TẬP TẠI PHÒNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT THÀNH PHỐ ĐÀ NẮNG

BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP .4 1.1 Lịch sử, phận chức Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng 1.1.1 Lịch sử Trung tâm .4 1.1.2 Các phận chức Trung tâm .4 1.2 Giới thiệu Phịng cơng nghệ tế bào thực vật 1.2.2 Chức năng, nhiệm vụ Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật 1.3.2 Sơ đồ bố trí thiết bị phịng hóa mơi trường 1.4 Các trang thiết bị, dụng cụ máy móc phịng 1.4.1 Dụng cụ .6 1.4.2.1 Nồi hấp khử trùng 1.4.2.2 Tủ sấy 1.4.2.3 Máy đo pH 1.4.2.4 Máy khuấy từ 10 1.4.2.5 Cân kỹ thuật .11 1.4.2.6 Cân điện tử .12 1.4.2.7 Máy cất nước 12 1.4.2.8 Bếp gas .13 1.4.2.9 Buồng cấy vô trùng 14 1.4.2.9.1 Buồng cấy vô trùng người AC – 312 14 1.4.2.9.2 Buồng cấy vô trùng người AHC-4A1 14 1.4.2.10 Máy hút ẩm 15 1.4.2.11 Kính hiển vi OPTIKA 15 1.4.2.12 Hệ thống nuôi cấy bán ngập chìm Rita 15 1.4.2.13 Máy lắc 17 1.4.2.14 Bếp từ .17 Chương : CÁC KỸ THUẬT TRONG PHỊNG NI CẤY TẾ BÀO 19 2.1 Kỹ thuật pha môi trường 19 2.1.1 Hóa chất 19 Bảng 2.1 THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN CỦA MÔI TRƯỜNG MS 20 2.1.2 Cách tiến hành 21 2.2 Vô trùng nơi thao tác cấy tủ cấy vô trùng 23 2.3 Vô trùng mô nuôi cấy 24 2.4.Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy 25 2.4.1 Dụng cụ thủy tinh 25 2.3.2 Nút đậy 26 Chương :QUY TRÌNH TẠO CÂY CÚC TỪ 27 CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 27 3.1 Kiến thức chung công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật .27 3.1.1 Sơ lược kỹ thuật dùng nuôi cấy mô tế bào thực vật .28 SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng 3.1.1.1 Nuôi cấy phôi 28 3.1.1.2 Nuôi cấy mô quan tách rời .28 3.1.1.3 Nuôi cấy mô phân sinh 29 3.1.1.4 Nuôi cấy bao phấn 29 3.1.1.5 Nuôi cấy tế bào đơn 29 3.1.1.6 Nuôi cấy protoplast 30 3.2 Giới thiệu chung cúc 30 3.2.1 Lịch sử trồng trọt 30 3.2.2 Đặc điểm thực vật học 31 Nhân chồi 32 3.3.2 Thuyết minh qui trình : .32 3.3.2.1Khử trùng mẫu 32 3.3.2.2.Vào mẫu .33 3.3.2.3 Nhân chồi 35 a Nguyên liệu 35 b Dụng cụ 35 c Phương pháp 35 KẾT LUẬN 36 KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 NHẬN XÉT CỦA CƠ QUAN THỰC TẬP 38 SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng MỞ ĐẦU Trên sở lý thuyết học giảng đường, sinh viên cần có thêm hội tiếp xúc công việc thực tế, nhằm rèn luyện kỹ tránh bỡ ngỡ trường, chương trình đào tạo dành cho chuyên nghành Công nghệ Sinh học trường ĐHBK Đà Nẵng, sinh viên có nhiều đợt thực tập, thí nghệm, mà thực tập cơng nhân tập quan trọng Nhận thức tầm quan trọng việc làm quen với phịng thí nghiệm, thực công việc nghiên cứu, đặc biệt mong muốn tìm hiểu sâu Cơng nghệ Nuôi cấy mô tế bào thực vật – hướng phát triển mũi nhọn nghành CNSH, em lựa chọn phân thực tập “Phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật” thuộc Trung Tâm CNSH Thành Phố Đà Nẵng Hơn tháng thực tập ngắn ngủi giúp em có nhìn chi tiết nuôi mô tế bào thực vật, củng cố kiến thức mà em học ghế nhà trường Em xin chân thành cảm ơn Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Đà Nẵng, Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện cho em học hỏi hoàn thành tốt đợt thực tập SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP 1.1 Lịch sử, phận chức Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng 1.1.1 Lịch sử Trung tâm Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng tách từ Trung tâm Công nghệ Sinh học Ứng dụng Khoa học Công nghệ Thành phố Đà Nẵng theo định số 8725/QD-UBND ngày 12 tháng 11 năm 2010, thức thành lập vào ngày tháng năm 2011 1.1.2 Các phận chức Trung tâm + Ban giám đốc + Phịng Tổng hợp Hành + Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật + Phịng Cơng nghệ Vi sinh + Trạm sản xuất kinh doanh 1.2 Giới thiệu Phịng cơng nghệ tế bào thực vật 1.2.1 Giới thiệu Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Hiện khu dân cư Đông Phước, quận Cẩm Lệ 1.2.2 Chức năng, nhiệm vụ Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật - Nghiên cứu ứng dụng công nghệ tế bào thực vật nhằm sản xuất giống trồng chất lượng cao phục vụ vùng trồng trọt, nhà vườn, hộ nông dân địa bàn thành phố Đà Nẵng vùng lân cận - Tham mưu cho Ban lãnh đạo Trung tâm phát triển ngành Công nghệ Tế bào Thực vật phục vụ công tác bảo tồn nhân nhanh giống trồng, nguồn gen thực vật quý, SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng - Đề xuất, nghiên cứu triển khai chương trình ứng dụng khoa học cơng nghệ, đề tài, dự án thuộc cấp - Thực công tác đào tạo, chuyển giao công nghệ tế bào thực vật cho cá nhân, tổ chức có nhu cầu 1.3 Sơ đồ bố trí phịng thiết bị 1.3.1 Sơ đồ bố trí phịng Phịng WC Phịng hóa mơi trường mơi trường Phịng họp Hành lang Phịng ni Phịng cấy vơ Sảnh chung trùng Phịng làm việc Hình 1.1: Sơ đồ bố trí phịng 1.3.2 Sơ đồ bố trí thiết bị phịng hóa mơi trường Máy đo Cân kỹ thuật pH Nơi cân điện tử Tủ sấy Nồi hấp khử trùng đồ dùng vệ sinh chai Bàn lọ trường dụng Tủ pha môi Tủ lạnh cụ pha môi Máy cất Bếp gas nước Lị vi Nồi hấp sóng khử trùng Hình 1.2: Sơ đồ bố trí thiết bị phịng hóa mơi trường SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng 1.4 Các trang thiết bị, dụng cụ máy móc phịng 1.4.1 Dụng cụ a Bình Duran b Bình thủy tinh c Ống đong d Phễu thủy tinh e Panh kẹp f Kéo g Khay đựng dụng cụ h Đèn cồn i Dao cấy Hình 1.3 Dụng cụ thí nghiệm 1.4.2 Trang thiết bị máy móc 1.4.2.1 Nồi hấp khử trùng SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng *Hãng sx: Hirayama – Nhật Bản *Model: HV110A *Công dụng : dùng để hấp trùng môi trường , dụng cụ sấy … Hình 1.4 Nồi hấp Hirayama HV-100 * Hướng dẫn sử dụng - Bật nguồn , mở nắp nồi - Thêm nước cất vào cho ngập ngang mâm - Kiểm tra mức nước bình xả hơi, ln đảm bảo mức LOW - Cho giỏ hấp chứa môi trường,dụng cụ cần hấp vào nồi đóng nắp - Bật nguồn điện - Chọn chế độ hấp khử trùng, có nhiều chế độ hấp: + MODE 1, 2: ( Dùng để tiệt trùng môi trường ) + MODE 3: ( Dùng tiệt trùng dụng cụ ) + MODE 4: ( Dùng để rã đông Agar ) SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng - Bấm START - Nồi bắt đầu hoạt động ( chữ Heat nháy ) - Quá trình hấp kết thúc nhiệt độ hiển thị nhỏ 97ºC, nhấn STOP - Mở nắp lấy giỏ hấp 1.4.2.2 Tủ sấy * Model: OF-22G * Xuất xứ: Jeiotech – Hàn Quốc * Công dụng: dùng để sấy thiết bị, dụng cụ ni cấy… Hình 1.5 Tủ sấy * Hướng dẫn sử dụng - Ấn nút Power - Cài đặt nhiệt độ + Ấn nút Temp + Ấn nút ↓↑ để điều chỉnh giá trị nhiệt độ cần cài đặt ấn nút □ để lưu giá trị cài đặt - Cài đặt thời gian SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng + Ấn nút Time + Ấn nút ↓↑ để chọn chế độ thời gian cài đặt ấn nút □ để lưu giá trị thời gian cài đặt - Ấn nút Start để bắt đầu hoạt động - Ấn nút Stop để máy ngưng hoạt động trước mở cửa máy * Chú ý: Trong trình sấy ý đến nhiệt độ vật dụng cần sấy, tránh xảy cháy nổ 1.4.2.3 Máy đo pH * Model : HI-2211 * Xuất xứ : HANNA – Ý * Công dụng : dùng để đo pH mơi trường ni cấy Hình 1.6 Máy đo pH * Hướng dẫn sử dụng - Bật máy - Tháo nắp đậy bảo quản điện cực pH - Rửa đầu điện cực đo pH nước cất, thấm khô giấy mềm - Nhúng điện cực đo pH điện cực đo nhiệt độ vào dung dịch cần đo (ngập cm) khấy SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng - Điều chỉnh pH dung dịch HCl NaOH giá trị cần đo - Khi giá trị đo ổn định, đọc giá trị hiển thị hình - Sau đo, rửa điện cực nước cất, thấm khô điện cực giấy mềm, đậy nắp bảo quản lại - Tắt nguồn - Vệ sinh thiết bị sau sử dụng * Chú ý: Nếu thiết bị yêu cầu hiệu chuẩn, phải hiệu chuẩn lại thiết bị cho kết quả đo xác 1.4.2.4 Máy khuấy từ * Model: IKA- RH basic *Hãng: IKA-Đức *Xuất xứ: Malaysia *Công dụng: dùng để khuấy mơi trường ni cấy Hình 1.7 Máy Khấy Từ * Hướng dẫn sử dụng - Bật nguồn - Đặt môi trường lên máy - Dùng cá từ rửa nước cất bỏ vào môi trường SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 10 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng Các dụng cụ mang vào buồng cấy vô trùng trước: từ áo choàng, mũ vải, trang người cấy, đến dao, kéo, forceps, giấy lọc, bình đựng nước cất Trên bàn cấy thường xuyên có đèn cồn (hoặc đèn gas) để sử dụng cấy cốc đựng cồn 90% để nhúng dụng cụ làm việc Trước cấy, kỹ thuật viên cần rửa tay xà phòng lau kỹ đến khuỷu tay cồn 90% Để đảm bảo mức độ vô trùng cao phịng cấy cần có đèn tử ngoại 40W treo trần Chỉ cho đèn làm việc khơng có người phịng cấy Nên bật đèn tử ngoại 30 phút trước cấy Cần giảm chuyển động khơng khí buồng cấy đến mức tối thiểu, tất cả dụng cụ phục vụ việc cấy phải chuẩn bị đầy đủ để cấy tránh lại, vào buồng cấy nhiều lần 2.3 Vô trùng mô nuôi cấy Mô nuôi cấy hầu hết phận khác thực vật như: hạt giống, phơi, nỗn sào, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân củ Tùy theo tiếp xúc với điều kiện môi trường bên ngồi, phận chứa hay nhiều vi khuẩn nấm Hầu vô trùng mô nuôi cấy nấm khuẩn nằm sâu tế bào bên không hạn chế bề mặt Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng dùng hóa chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn Hiệu lực diệt nấm khuẩn chất phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ khả xâm nhập chúng vào kẻ ngách lồi lõm bề mặt mô ni cấy, khả đẩy hết bọt khí bám bề mặt mơ ni cấy Để tăng tính linh động khả xâm nhập chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô nuôi cấy vịng 30 giây cồn 70% sau xử lý dung dịch diệt khuẩn Các chất kháng sinh thực tế sử dụng tác dụng khơng triệt để có ảnh hưởng xấu lên sinh trưởng mô cấy Trong thời gian xử lý, mơ cấy phải ngập hồn tồn dung dịch diệt khuẩn Đối với phận thực vật có nhiều bụi đất, trước xử lý nên rửa kỹ xà phòng dòng nước chảy Khi xử lý xong, mô cấy rửa nhiều lần nước cất vô trùng (3-5 lần) Những phần mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng cần phải cắt bỏ trước SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 24 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng đặt mô cấy lên môi trường Để tránh ảnh hưởng trực tiếp tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên ý để lại lớp bọc ngồi ngâm mơ vào dung dịch diệt khuẩn Lớp cuối cắt bỏ bóc trước đặt mô cấy lên môi trường Vô trùng mơ cấy thao tác khó, thành công lần Tuy vậy, kiên trì tìm nồng độ thời gian vơ trùng thích hợp sau vài lần thử, chắn đạt kết quả Thời gian xử lý STT Tác nhân vô trùng Nồng độ Calcium hypochlorite 9-10% 5-30 Rất tốt Sodium hypochlorite 2% 5-30 Rất tốt Nước Bromine 1-2% 2-10 Rất tốt H2O2 10-12% 5-15 Tốt HgCl2 0,1-1% 2-10 Khá Kháng sinh 4-50 mg/L 30-60 Khá (phút) Hiệu quả Bảng 2.1 Nồng độ thời gian sử dụng một số chất diệt khuẩn để xử lý mô cấy thực vật 2.4.Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy 2.4.1 Dụng cụ thủy tinh Dụng cụ thủy tinh dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật phải loại thủy tinh suốt để ánh sáng qua mức tối đa trung tính để tránh kiềm từ thủy tinh gây ảnh hưởng đến phát triển mô nuôi cấy Cần rửa dụng cụ thủy tinh trước đưa vào sử dụng Thông thường, cần xử lý dụng cụ thủy tinh sulfochromate lần đầu đưa vào sử dụng, sau cần rửa xà phòng, tráng nước máy nhiều lần cuối tráng nước cất Sau để nước, dụng cụ thủy tinh (trừ loại dùng để thể tích) cần vơ trùng khơ cách sấy 60-70 oC/2 Sau nguội lấy cất vào chỗ bụi SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 25 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng 2.3.2 Nút đậy Thường dùng nút đậy làm không thấm nước Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị bốc q dễ dàng q trình ni cấy Bông không thấm nước loại nút đơn giản nhất, có nhược điểm sau: + Nếu hấp nút bơng bị ướt dính mơi trường sau bị nhiễm nấm, thí nghiệm nuôi cấy thời gian dài + Thao tác làm nút chậm, không thuận tiện nuôi cấy quy mô lớn + Chỉ dùng vài lần, sau phải bỏ Hiện nay, người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay nút Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm bình tam giác nhựa chịu nhiệt hấp vơ trùng nhiệt độ 121 oC (khoảng atm) mà không bị biến dạng Một số phịng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệm inox cao su thuận tiện cho việc vô trùng khơ ướt Cũng sử dụng giấy nhơm nilon chịu nhiệt để làm nắp đậy.Trong trình tiến hành, sử dụng nilon chịu nhiệt làm nút đậy SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 26 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng Chương :QUY TRÌNH TẠO CÂY CÚC TỪ CƠNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 3.1 Kiến thức chung công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Tế bào có mang tính chất quan trọng – tính tồn “Mỗi tế bào thể đa bào mang đầy đủ thông tin di truyền để kiến tạo thể hồn chỉnh Vì đặt tế bào vào điều kiện thuận lợi, phát triển thành thể mới.” ( Haberlandt, 1952) Đây tiền đề bản công nghệ nuôi cấy mô tế bào Ni cấy tế bào thực vật hay cịn gọi nuôi cấy in vitro việc nuôi cấy nguồn nguyên liệu thực vật hoàn toàn tinh vi sinh vật môi trường dinh dưỡng nhân tạo điều kiện vô trùng tuyệt đối Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, nuôi cấy hạt phấn chuyển gen ứng dụng rộng rãi nhằm : - Nhân nhanh vơ tính giống q - Cải lương giống trồng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bệnh - Tạo dịng đơn bội ni cấy bao phấn nuôi cấy tế bào hạt phấn - Khắc phục lai xa thụ phấn ống nghiệm nhờ kỹ thuật nuôi cấy phôi Yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến q trình ni cấy mơ tế bào thực vật chất điều hòa sinh trưởng Có nhóm : - Auxin - Giberelin - Cytokinin - Acid abcisic - Etylen SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 27 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng 3.1.1 Sơ lược kỹ thuật dùng nuôi cấy mô tế bào thực vật 3.1.1.1 Nuôi cấy phôi Sự ghi nhận nuôi cấy phơi cơng trình Charles Bonnet kỷ XVIII Ơng tách phơi Phascolus Fagopyrum trong đất nhận lùn Từ đầu kỷ XX cơng trình ni cấy phơi dần hồn thiện Từ cơng trình nghiên cứu trước đó, Knudson (1922) ni cấy thành cơng phôi lan môi trường chứa đường khám phá điều thiếu đường phơi phát triển thành protocorm Raghavan (1976 - 1980) công bố phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng tự dưỡng Ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phơi) cần có chất điều hồ sinh trưởng để phát triển Trong giai đoạn tự dưỡng phát triển phơi khơng cần chất điều hồ sinh trưởng Đối với nuôi cấy phôi, biết đường đóng vai trị quan trọng Trong nhiều trường hợp đường sucrose cho kết qủa tốt đường khác Ngoài số chất tự nhiên nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, chất cần ni cấy phơi Các chất kích thích sinh trưởng GA3, auxin, cytokinine thường dùng nhiều nuôi cấy phôi Auxin thường dùng nồng độ thấp Kinetin có vai trị đặc biệt cho phát triển phôi Các yếu tố ngoại cảnh nhiệt độ, ánh sáng ảnh hưởng đến phát triển phôi nuôi cấy in vitro Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ ánh sáng thấp phôi phát triển tự nhiên 3.1.1.2 Nuôi cấy mô quan tách rời Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi nho dại, với số tác giả khác, ông chứng minh phận nuôi cấy gặp điều kiện thuận lợi Lon Ball (1946) với thí nghiệm ni cấy đỉnh chồi măng tây cho thấy nuôi phận lá, thân, hoa khả tạo mô sẹo nhiều Nhu cầu dinh dưỡng nuôi cấy phận khác khác thấy số yêu cầu chung nguồn carbone dạng đường SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 28 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng muối nguyên tố đa lượng (nitơ, phospho, kali, calci) vi lượng (Mg, Fe, Mn, Co, Zn, ) Ngoài cần số chất đặc biệt vitamin (B1, B6, B3, ) chất điều hồ sinh trưởng Muốn trì sinh trưởng phát triển quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường Đối với ni cấy mơ, ngồi thành phần dinh dưỡng nuôi cấy quan tách rời, cần bổ sung thêm chất hữu chứa nitơ dạng acide amine, đường inositol Trong trường hợp ni cấy mơ, chất điều hồ sinh trưởng có vai trị quan trọng mơ tách rời khơng có khả tổng hợp chất 3.1.1.3 Nuôi cấy mô phân sinh Mô phân sinh thường mơ đỉnh chồi cành có kích thước 0,1mm ÷ 1cm Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ mầm non, chồi hình thành cành non Đối với nuôi cấy mô phân sinh cân chất điều hoà sinh trưởng quan trọng Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine tổ hợp cytokinine với auxin Muốn tạo rễ bổ sung auxin NAA, IAA, Nuôi cấy mô phân sinh sử dụng để loại virus tạo virus nhân giống in vitro Ni cấy mơ phân sinh cịn sử dụng để nghiên cứu trình hình thành quan, tạo đa bội qua xử lý colchicin 3.1.1.4 Nuôi cấy bao phấn Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn phát triển hồn thiện nhờ cơng trình nghiên cứu Bourgin Nitsch (1967) thuốc lá, Niizeki Oono (1968) lúa.Từ cuối năm 1970 nhận đơn bội từ nuôi cấy bao phấn 30 loại Kết quả nghiên cứu nhiều tác giả cho thấy hạt phấn ni cấy phát triển thành đơn bội hoàn chỉnh điều kiện nuôi cấy in vitro đường tạo phôi trực tiếp gián tiếp thông qua tạo mô sẹo tạo quan 3.1.1.5 Nuôi cấy tế bào đơn SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 29 BÁO CÁO THỰC TẬP CƠNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng Ngồi khả nuôi cấy quan mô thực vật, tế bào thực vật tách ni riêng rẽ mơi trường phù hợp Những cơng trình nuôi cấy tế bào đơn tiến hành từ năm 50 kỷ XX Tế bào đơn nhận đường nghiền mơ, xử lý enzyme Mỗi loại cây, loại tế bào khác địi hỏi kỹ thuật ni cấy khác Nuôi cấy tế bào đơn sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện khác lên trình sinh trưởng, phát triển phân hoá tế bào Ni cấy tế bào đơn cịn sử dụng chọn dịng tế bào 3.1.1.6 Ni cấy protoplast Ni cấy protoplast phát triển nhờ cơng trình Cocking (1960) Ông người dùng enzyme để thuỷ phân thành tế bào tách protoplast từ tế bào rễ cà chua Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast tái sinh thành tế bào mới, phân chia tái sinh thành hồn chỉnh Do khơng có thành tế bào nên protoplast trở nên đối tượng lý tưởng nghiên cứu biến đổi di truyền thực vật Bằng phương pháp dung hợp hai protoplast tạo lai soma Ngồi cịn sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển bào quan chuyển gene 3.2 Giới thiệu chung cúc 3.2.1 Lịch sử trồng trọt Cây hoa cúc có tên khoa học Chrysanthemum, định nghĩa từ Chiysos (vàng), themum (hoa) Linnde năm 1973 Hoa cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản số nước châu Âu Hoa cúc trồng Trung Quốc cách 3000 năm, có nguồn gốc từ số loài hoang dại thuộc họ cúc, trải qua trình trồng trọt, lai tạo chọn lọc từ biến dị để trở thành giống cúc ngày Ở Nhật Bản, hoa cúc di thực từ Trung Quốc sang, đánh giá cao mệnh danh “ Hoàng thất quốc gia” Năm 1843 , nhà thực vật học người Anh Fortune mang từ Trung Quốc giống cúc Chusan Daisy lai tạo loại hình cầu tán xạ ngày SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 30 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng Năm 1789 nước Pháp nhập từ Trung Quốc loại cúc đại đóa, đến năm 1927 Bemct thành công việc lai tạo giống cúc đẫn đến cải tiến mạnh mẽ giống cúc châu Âu 3.2.2 Đặc điểm thực vật học • Thân : Hoa cúc thuộc loại thân thảo, có khả nhân nhánh mạnh, có nhiều đất giịn, dễ gãy Cây lớn than cứng, cao hay thấp tùy thuộc vào giống Ở Việt Nam cao 30-80cm, điều kiện ngày dài cúc cao đến 1.5-2m • Lá : Thường đơn mọc so le nhau, có xẻ thùy cưa sâu Mặt bao phủ lớp lông tơ, mặt nhẵn, gân hình mạng lưới Từ nách thường phát sinh mầm nhánh phiến to hay nhỏ, dày hay mỏng, màu xanh đậm, xanh nhạt hay xanh vàng phụ thuộc vào giống • Rễ: Rễ hoa cúc rễ phụ phát triển nhiều rễ chùm, rễ ăn sâu mà phát triển theo chiều ngang Rễ có nhiều lông hút nên khả hút nước dinh dưỡng mạnh Những rễ không phát sinh từ mầm rễ hạt mà từ rễ mọc mấu thân gọi mắt phần sát mặt đất • Hoa : Hoa cúc nhiều hoa nhỏ hợp lại cuống hoa, hình thành hoa tự hình đầu trạng Hoa lưỡng tính hay đơn tính Hoa kép nhiều hoa đơn thường mọc nhiều hoa cành phát sinh từ nách Hoa có nhiều màu sắc khác (trắng, vàng, đỏ, tím, xanh…) đường kính hoa từ 1.5-12 cm Những cánh hoa phía ngồi thường có màu sắc đậm xếp thành nhiều tầng, chặt hay lỏng tùy theo giống Cánh có nhiều hình dáng khác nhau, cong thẳng, có loại cánh ngắn đều,có loại dài, ngồi hay vào • Quả Là quả bế khô chứa hạt Hạt có phơi thang khơng có nội nhũ SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 31 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng 3.3 Qui trình tạo cúc hồn chỉnh phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật 3.3.1 Qui trình Lấy phần đế hoa nụ hoa -Ánh sáng 2000-3000 lux, tối thiểu 12h /ngày - Nhiệt độ 20-25oC Khử trùng HgCl2 0,1% phút Khử trùng, vào mẫu Tạo chồi Nhân chồi 3.3.2 Thuyết minh qui trình : 3.3.2.1Khử trùng mẫu a Nguyên liệu Mẫu cấy lấy từ Cúc tươi đủ tiêu chuẩn b Dụng cụ, hóa chất + Dụng cụ: Panh cấy, dao cấy, kéo cắt, ống nghiệm đựng cồn, đèn cồn + Hoá chất: chất tẩy rửa (xà phòng Sunlight chanh), cồn 70 0, xà phịng, HgCl2 0,1%, nước cất vơ trùng c Phương pháp SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 32 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng Thu nhận mẫu đạt yêu cầu kích thước hình thái Làm sơ xà phịng phút, sau rửa lại vịi nước chảy để làm xà phịng rửa trơi tác nhân gây nhiễm bề mặt mẫu Sau làm sơ bộ, chuyển mẫu vào box vô trùng Cho chồi vào bình khác Tiến hành khử trùng mẫu cồn 70° vòng phút, HgCl 0,1% phút, sau rửa lại nước cất vô trùng lần Lưu ý khử trùng mẫu: - Trong thao tác khử mẫu khơng đưa tay qua bình nắp Duran, bình nước cất nước máy mở nắp khơng để bị khuất gió với dụng cụ - Nước cất nước máy hấp tiệt trùng (121 0C, 20 phút) Nước cất, nước máy bình Duran trước lần dùng phải hơ lửa đèn cồn - Khi cho chất diệt nấm khuẩn cồn, nước cất nước máy vào mẫu khử cần phải cho ngập mẫu, để mẫu xử lý tốt - Khi đổ nước bẩn có chứa HgCl phải cẩn thận phải đổ nơi dành riêng cho nước thải độc 3.3.2.2.Vào mẫu a Nguyên liệu Mẫu qua công đoạn khử trùng b Dụng cụ Tủ cấy, panh cấy, dao cấy, kéo cắt, đèn cồn, giấy cấy khử trùng c Phương pháp Đầu tiên, bật đèn cồn, mở lớp báo bọc giấy cấy, lấy tờ giấy sấp giấy cấy Tiếp theo, hơ miệng bình Duran dùng kẹp lấy mẫu đặt giấy cấy đậy nắp bình Duran lại Dùng kẹp lấy mẫu ra, đặt giấy vô trùng Dùng dao kẹp cắt thành mẫu có diện tích khoảng 1cm 2, mẫu phải chứa gân Đối với cành dùng dao kẹp cắt thành đoạn nhỏ, đoạn chứa 2-3 chồi nách Đối với mẫu nụ cắt lấy phần đế hoa nụ SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 33 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng Mở nắp bình mơi trường, hơ miệng bình đèn cồn dùng panh kẹp gắp mẫu cấy vào môi trường với khoảng cách thích hợp, khơng nên cấy q dày sâu mẫu xuống môi trường Sau cấy xong hơ miệng bình đậy nắp lại Đối với mẫu đặt mẫu úp xuống Đối với mẫu cành cấy cho mẫu đứng thẳng Đối với mẫu hoa cấy đế hoa ngữa lên Một bình mơi trường nên cấy từ 5-6 mẫu, khoảng cách cách thành bình khoảng 1cm để tránh nhiễm hàng loạt Tất cả thao tác đảm bảo vô trùng tuyệt đối: tay trước tiến hành phải lau cồn 700, dụng cụ sau thao tác cần đốt cồn 96 0, giấy cấy phải thay sau lần cấy Mẫu sau cấy ni phịng ni với điều kiện nhiệt độ ánh sáng ổn định Nhiệt độ phịng ni nên giữ ổn định khoảng 25 ± 20C máy điều hòa nhiệt độ Cường độ chiếu sáng khoảng từ 2000 - 3000 lux Cần theo dõi mẫu cấy thường xuyên để phát mẫu nhiễm tiến hành xử lý kịp thời Hình 3.1 Mẫu ni cấy SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 34 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng Hình 3.2 Mẫu nuôi cấy đế hoa 3.3.2.3 Nhân chồi a Nguyên liệu Mẫu Cúc in vitro b Dụng cụ Tủ cấy, que cấy, kẹp, dao cấy, đèn cồn, giấy khử trùng c Phương pháp - Chuẩn bị box cấy, khử trùng dụng cụ cấy - Đưa môi trường, mẫu in vitro vào box cấy - Mở nắp bình mẫu in vitro, hơ kỹ miệng bình ngon lửa đèn cồn Dùng kéo cắt bỏ rễ, gắp đoạn thân đĩa cấy Cắt mẫu thành đoạn có chứa chồi nách Dùng panh chuyển mẫu sang môi trường cấy nhân Bố trí khoảng 7-9 mẫu bình đựng mơi trường SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 35 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng KẾT LUẬN Nuôi cấy mô tế bào thực vật kỹ thuật sử dụng phổ biến để tăng nhanh hệ số nhân, tạo lượng lớn giống trồng đáp ứng nhu cầu giống thị trường Tuy nhiên, tùy vào loại đối tượng, phương pháp tiến hành khác mà kết quả mang lại không giống Qua gần tháng thực tập cơng nhân Phịng Công nghệ tế bào thực vật, làm quen sử dụng thơng thạo máy móc thiết bị hiểu rõ thực hành tốt kỹ thuật, thao tác nuôi cấy mô Quan trọng bước đầu nghiên cứu thành công tạo thành mô sẹo cảm ứng tạo phôi hoa cúc KIẾN NGHỊ Trong thời gian tới, tiếp tục theo dõi mẫu sống thử nghiệm thêm nhiều phương án bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, khử trùng mẫu để xác định điều kiện tối ưu cho trình tạo mơ sẹo tạo phơi hoa cúc SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 36 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Văn Hồng (2007), Cơng nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nhà xuất bản Khoa học Kỉ thuật Đào Thanh Vân(2007), Giáo trình hoa , Nhà xuất bản Nơng nghiệp Agudao Santacruz, G.A., J.L Carbrera Ponce, V Olalde Portugal, M.R Sanchez Gonzales, J.M Guzman and L Herrera Estrella 2001 Tissue culture and plant regeneration of blue brama gass, Bouteloua gracilis (H.B.K) lag Ex Steud In vitro Cell Dev Biol Plant, 37(2): 182-189 Altaf, N., A Tabassum, and M.S Ahmad 1985 Plant regeneration by organogenesis and somaticembryogenesis from tissue culture of Citrus reticulata Blanco (Kinnow Mandarin).- In: Plant Tissue Culture (Ed.): Ilahi, I pp 1-7 University of Peshawar Ammirato, P.V 1983 Embryogenesis - In: Handbook of Plant Cell Culture (Eds.): D.A Evans, W.R Sharp, P.V Ammirato, Y Yamada pp 82-123 Macmillan New York Bhattacharya, P., S Dey, D Das and B.C Bhattacharya 1990 Rapid mass propagation of Chrysanthemum morifolium by callus derived from stem and leaf explants Plant Cell Reports, 9(8): 439-442 Brown, D.C.W., K.L Finstad and E.M Watson 1995 Somatic embryogenesis in herbaceousdicots – In: (Eds.): T.A Thorpe In vitro Embryogenesis in Plants, pp 345-415 Kluwer,Academic, Dordrecht Bush, S.R., E.D Earle and R.W Langhans 1976 Plantlets form petal segments, petal epidermis and shoot tips of periclinal chimera Chrysanthemum morifolium "Indianapolis" Amer J Bot.,63: 729-737 SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 37 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng NHẬN XÉT CỦA CƠ QUAN THỰC TẬP ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………… Đà Nẵng, ngày …… tháng… năm 2013 Phịng cơng nghệ tế bào thực vật Cán hướng dẫn Trung tâm công nghệ sinh học Đà Nẵng SVTH:Nguyễn Đại Tùng Lớp:09SH Trang 38 ... Cơng nghệ Tế bào Thực vật + Phịng Cơng nghệ Vi sinh + Trạm sản xuất kinh doanh 1.2 Giới thiệu Phịng cơng nghệ tế bào thực vật 1.2.1 Giới thiệu Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Công. .. em lựa chọn phân thực tập “Phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật? ?? thuộc Trung Tâm CNSH Thành Phố Đà Nẵng Hơn tháng thực tập ngắn ngủi giúp em có nhìn chi tiết nuôi mô tế bào thực vật, củng cố kiến... 26 BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NHÂN GVHD:TS.Đặng Đức Long CBHD:Nguyễn Thanh Hưng Chương :QUY TRÌNH TẠO CÂY CÚC TỪ CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 3.1 Kiến thức chung công nghệ nuôi cấy mô tế bào