Sinh hóa miễn dịch chương 7

CHNG MT S PHNG PHP PHN TCH DA TRấN MIN DCH Trong nhng nm gn ủõy, cú nhiu xột nghim ủc hiu v rt nhy da trờn k thut hoỏ - dch ủó ủc vo xột nghim y khoa vi mc ủớch chn ủoỏn ủ cú hng ủiu tr thớch hp, trin khai vacxin ủ phũng bnh kp thi, trin khai cỏc bin phỏp v sinh - dch t hc ủ ngn nga lõy lan ca mn bnh Nguyờn lý ca chỳng ủc da trờn cỏc phn ng khỏng nguyờn khỏng th p dng nguyờn lý ny ủ xỏc ủnh ủc t thc phm ủó ủc thc hin khong 20 nm tr li ủõy Hai nguyờn nhõn thỳc ủy ỏp dng rụng rói phng phỏp ny l vic sn xut ủc khỏng th ủn dũng v vic phỏt trin ca phng phỏp ELISA Vic phỏt trin ủc phng phỏp ELISA ủó gúp phn quan trng phng phỏp phõn tớch da trờn dch hc vo ng dng rng rói 7.1 Phn ng khỏng nguyờn v khỏng th Khỏng nguyờn v khỏng th ủc hiu ca nú cú cha cu trỳc tng ng b sung, chớnh vỡ th nú lm cho phn quyt ủnh khỏng nguyờn khp rt khớt vi v trớ gn trờn khỏng th Ti ủú chng ủc ni vi bng nhng liờn kt yu gia cỏc phõn t 7.1.1 Phn ng thun nghch v hng s cõn bng Mt v trớ ca khỏng th ch kt hp vi mụt epitop khỏng nguyờn, phn ng khỏng nguyờn khỏng th l phn ng thut nghch v cú th biu din nh sau: k1 KN + KT KN - KT k2 Trong ủú: k1 l hng s cõn bng phn ng thun k2 l hng s cõn bng phn ng nghch Hng s cõn bng ủc biu din nh sau K= k [ KN KT ] = [KN ][KT ] k Phn ng gia khỏng nguyờn v khỏng th xy di tỏc dng ca nhiu liờn kt (Hỡnh 7.1.) - Liờn kt hydro - liờn kt tnh ủin - Liờn kt Van der wals (liờn kt gia cỏc ủỏm mõy ủin t) - Liờn kt k nc - Hỡnh 7.1: Lc hỳt gia khỏng nguyờn - khỏng th Nhn bit phn ng KN-KT thụng qua cỏc phn ng sau ủõy - Phn ng kt ta - Phn ng ngng kt - C ủnh b th - Phn ng phỏt hunh quang - Phn ng gn enzyme 7.1.2 Phn ng kt ta Khi khỏng th ủc hiu phm ng vi khỏng nguyờn ho tan mt nng ủ nht ủnh s xut hin kt ta nhỡn thy bng mt thng Phn ng ny dựng ủ phỏt hin khỏng nguyờn hũa tan cú khỏng th ủc hiu, hoc ủ phỏt hin khỏng th cú khỏng nguyờn hũa tan ủc hiu Phn ng ti u ủ v tng ủng v nng ủ khỏng nguyờn , khỏng th (hinh 7.2) 6.2.3 6.66.3 Phn ng ngng kt PP +P6' ' Hỡnh 7.2: th biu din mc kt ta ph thuc vo t l KT-KN KhikKk Khi t l tng ủng s to mng li tt nht, nu tha khỏng th epitop khỏng nguyờn bóo ho nhng khụng liờn kt chộo ủc ủc vi thụng qua gn v trớ kt hp khỏng nguyờn Nu tha khỏng nguyờn paratop khỏng th bóo ho, nhng khụng kt hp ủc vi thụng qua epitop 7.1.3 Phn ng ngng kt iu kin xy phn ng l phi cú khỏng nguyờn hu hỡnh ủú l nhng khỏng nguyờn cú kớch thc ln nh hng cu, vi sinh vt Khỏng nguyờn hu hỡnh cú epitop b mt cú th liờn kt chộo vi cỏc khỏng th, to thnh cm v nhỡn ủc bng mt thng Phn ng ngng kt nhy hn phn ng kt ta nờn ủc dựng ủ ủnh tớnh v bỏn ủnh lng khỏng th huyt Cỏch tin hnh phn ng ngng kt - Pha loóng khỏng th cú ủ pha loóng : 1/20; 1/40; 1/80 - Cho khỏng nguyờn hu hỡnh vo cỏc ng nghim cha khỏng th trờn - Hiu giỏ khỏng th l ủ pha loóng cao nht m xy ngng kt Vớ d ng th cú ủ pha loóng cao nht nhng phỏt hin ủc phn ng ngng kt ta núi hiu giỏ ca hyt l 80 7.1.4 Phn ng kt hp b th V nguyờn tc khỏng nguyờn ho tan cú phn ng vi khỏng th ủú s c ủnh b th Cũn ngc li s cú b th t Khi h thng ch th ca cỏc hng cu nhy cm nh hng cu cu (SRBC) ủc thờm vo, mc ủ phõn hu hng cu nhy cm (tan hng cu nhy cm) s t l vi b th t D vo kt qu xột nghim ta kt lun l mu õm tớnh hoc dng tớnh Bc 1:Chun b hai h thng (hinh 7.3): - H thng xột nghim bao gm: Khỏng nguyờn, khỏng th - H thng ch th gm: Hụng cu cu v khỏng th khỏng hng cu cu - B th H thng ch th Hờ thng xột nghim Hồng cầu cừu(SRBC) Bổ thể Kháng thể Kháng thể khỏngSRBC Kháng nguyên Hỡnh 7.4: H thng xột nghim v h thng ch thi Bc 2: B sung b th vo h thng xột nghim (hỡnh 7.5) a) Khỏng nguyờn khụng ủc hiu vi khỏng th cú b th t b)Khỏng nguyờn ủc hiu vi khỏng th khụng cú b th t (b th c ủnh) Kháng thể Kháng thể Kháng nguyên a Kháng nguyên b Hỡnh 7.5: Phn ng khỏng nguyờn-khỏng th cú b sung b th Bc 3: B sung h thng ch thi a) B th t cú phn ng vi ch th (to phc khỏng th hng cu cu- khỏng nguyờn khỏng hng cu cu- b th) (hỡnh 7.6a) b) B th c ủnh khụng cú phn ng vi ch th (do to phc h KNKT-BT) ( 7.6 b) KT HCC KT, K HCC KN a b Hỡnh 7.6: B sung h thng ch th Bc 4: Kt qu xột nghim a) n tớnh: khụng cú khỏng th cn xột nghim, nờn khụng cú phc KNKT-BT Do ủú b th t kt hp vi hng cu nhy cm v xy hin tng tan mỏu (hỡnh 7.7a) b) Dng tớnh: Cú khỏng th cn xột nghim, nờn tn ti phc KN-KT-BT Do ủú b th c ủnh s khụng cú s kt hp vi hng cu nhy cm, kt qu l khụng cú hin tng tan mỏu (hỡnh 7.7b) a b Hỡnh 7.7: Kt qu xột nghim ng dng ca phng phỏp: Phng phỏp ny ủc ng dng rng rói sng lc lõm sng c bit l phộp th ủi vi xoỏn khun bờnh giang mai 7.1.5 Cỏc yu t nh hn ủn phn ng khỏng nguyờn khỏng th - nh hng ca kớch thc, nng ủ ca khỏng th - nh hng ca lc ủy gia cỏc khỏng nguyờn - Tỏc dng ca enzyme - Tỏc dng ca cỏc cht keo - nh hng ủc tớnh khỏng nguyờn - nh hng ca pH, nhit ủ, thi gian phn ng 7.2 K thut hunh quang dch 7.2.1 C s ca phng phỏp Trong k thut ny khỏng th hoc khỏng nguyờn ủc ủỏnh du bng thuc nhum hunh quang V nguyờn tc: k thut ủc da trờn tớnh cht ca thuc nhum ủc kớch thớch bi bc x cú bc súng thớch hp s phỏt sỏng: - Fluorescein phỏt quang mu vng lc - Rodamin phỏt quang cho mu ủ da cam Khỏng th cú gn thuc nhum hunh quang gi l gi l khỏng th hunh quang hay khỏng th ủỏnh du 7.2.2 Hai phng phỏp k thut hunh quang dch Phng phỏp hunh quang MD trc tip (hỡnh 7.8) Mc ủớch ca phng phỏp: Xỏc ủnh vi sinh vt gõy bnh trờn bờnh phm, Vớ d nh xỏc ủnh Streptococcus pyrogenes t hng bnh nhõn Cỏc bc tin hnh - C ủnh tiờu bn trờn phin kớnh - Ph khỏng th hunh quang khỏng th lờn - Cho khỏng th hunh quang gn vi t bo - Ra loi khỏng th khụng gn vi t bo - Quan sỏt di kớnh hin vi hunh quang, ch cú vi khun gn ủc hiu vi khỏng th hunh quang mi phỏt sỏng v quan sỏt ủc Phng phỏp hunh quang MD giỏn tip Mc ủớch Phng phỏp ny thng dựng xỏc ủnh khỏng th th dch ca bnh nhõn Vớ d xỏc ủnh IgG khỏng spirochet cú huyt hoc nc bt bnh nhõn viờm li Phng phỏp ny nhy hn phng phỏp trc tip Cỏc bc tin hnh - C ủnh tiờu bn (khỏng nguyờn) trờn phin kớnh - Cho khỏng th huyt bnh nhõn phn ng vi khỏng nguyờn (vi khun gõy bnh) - Cho khỏng th cú ủỏnh du hunh quang ủ khỏng th phn ng ủc hiu vi phc hp khỏng nguyờn-khỏng th - Ra nhng phn khụng phn ng ủc hiu gia khỏng th hunh quang vi phc hp khỏng nguyờn- khỏng th - Soi ủc kt qu bng ủốn hunh quang (ủốn UV) Hỡnh 6.8 K thut hunh quang dch trc tip Mụ phng phng phỏp hunh quang giỏn tip Bc 1:C ủnh tiờu bn trờn phin kớnh Bc 2: Trỏng kớnh vớ khỏng th ủc hiu ủ to phc hp KN-KT Bc 3:Trỏng khỏng th ủc hiu vi khỏng th cú gn vi thuc nhum hunh quang Bc 4:Soi ủc kt qu bng ủốn hyựnh quang (ủốn UV) 7.3 Thớ nghim dch phúng x Nguyờn tc: V nguyờn tc tng t nh hunh quang dch, nhng khỏc l khỏng nguyờn hoc khỏng th ủc ủỏnh du bng cht phúng x (126I ) Thớ nghim ny Rosalyn Yalow ủ ngh nm 1960 ủ xỏc ủnh nng ủ insulin huyt tng Nh phỏt minh ny m b ủó nhn gii thng Noben nm 1977 Ngy phng phỏp ny ủc s dung ủ xỏc ủnh hoocmon, globulin dch, khỏng nguyờn ca virus Cỏc bc tin hnh - Ly mt lng chớnh xỏc khỏng nguyờn cú ủỏnh du bng cht phúng x (vớ d 126I ) - Cho lng khỏng nguyờn ủỏnh du núi trờn tỏc dng ủc hiu vi lng khỏng th va ủ - Ra sch khỏng ngyuyờn ủỏnh du khụng bt cp vi khỏng th - o ủ phúng x ca phc cht khỏng nguyờn ủỏnh du - khỏng th (A) - Cng thớ nghim nh trờn nhng ủõy ta thờm mt lng khỏng nguyờn huyt cú nhng ủc tớnh tng t nh khỏng nguyờn ủỏnh du Do cnh tranh m khỏng nguyờn ny kt hp ủc hiu vi khỏng th, sau ủú lng khỏng th d mi kt hp vi khỏng nguyờn ủỏnh du - Ra nhng khỏng nguyờn ủỏnh du khụng bt cp vi khỏng th - o ủ phúng x ca phc khỏng nguyờn ủỏnh du vi khỏng th cũn li (B) - T giỏ tr A&B ta tớnh ủc nng ủ ca khỏng nguyờn huyt cn nghiờn cu 7.4 K thut cht hp ph dch gn enzym (ELISA - Enzyme Linker Immunosorbent Assay) Nhng xột nghim hp ph dch gn enzyme l k thut khỏ nhy v ủn gin, cho phộp xỏc ủnh khỏng nguyờn hoc khỏng thm cú nng ủ rt thp (khong 0,1 mg/ml) So vi phng phỏp dch phúng x thỡ phng phỏp ny ủn gin r tin an ton m ủm bo ủ chớnh xỏc Cỏc xột nghim ủc tin hnh trờn bn nha polystyren cú 96 ging ủỏy bng, th tớch mi ging khong 200 àl Nguyờn tc chung ca k thut ELISA: Nguyờn tc chung ca k thut ELISA l to liờn kt ủc hiu gia khỏng nguyờn v khỏng th S liờn kt ủú cho phộp xỏc ủnh s cú mt ca khỏng th hoc khỏng nguyờn Ngi ta s dng khỏng th gn cng hp enzym sau ủú b sung c cht, enzym thy phõn c cht to thnh cht lm thay ủi mu dung dch Tựy thuc vo cng ủ mu dung dch ta suy nng ủ khỏng nguyờn hoc khỏng th cn nghiờm cu Cỏc enzyme thng dựng l: (galactosidase; glucoxydase; akanline phosphotasen, ) Ngoi ủ tng ủ nhy ca phng phỏp ngi ta s dng h thng cụng hp biotin -avidin, biotin -sprept H thng cng hp dch biotin - avadin Biotin ( vitaminH) ủc tng hp t sinh vt hoc thc vt cú trng lng phõn t khong 244Da Biotin cú ỏi lc vi avidin (l cht cú nhiu lũng trng trng) Avidin cú v trớ trờn phõn t liờn kt vi biotin, v nh th biotin d dng kt hp vi protein: khỏng th, enzyme v cỏc loi khỏng nguyờn khỏc Phng phỏp ny nú s nõng cao ủ nhy ca xột nghim ủc bit l cỏc xột nghim dch m khỏng nguyờn pha rn H thng cng hp dch biotin - strept Ngi ta cng tỡm thy cht hot tớnh tng t nh avidin t x khun v nh vy ta cú h thng cng hp dch biotin - strept xột nghim dch H thng cng hp dch biotin - strept (avidin) dựng xột nghim dch ủc bit vai trũ ca avidin v strept avidin cú th thay ủi cho Ngy b kớt ny ủó ủc ch to t cỏc hóng ni ting trờn th gii Cỏc khỏng nguyờn hoc khỏng th cn xỏc ủnh ủc hp ph trc tip hoc giỏn tip lờn b mt ca ging nha Sau ủú mt phng ca ging ủc bao ph bng mt loi ủm cha protein, thng l gelatin hoc BSA ủ ngn nga s liờn kt khụng ủc hiu ủi vi bn nha Cú nhiu k thut ELISA , dúi ủõy s trỡnh by k thut ELI AE túm bt khỏng ngyuờn v ELISE cnh tranh (hỡnh 7.9) Hỡnh 7.9: K thut ELI SA 7.5.1 Phng phỏp ELI SA túm bt khỏnh nguyờn (bỏnh kp) Phng phỏp ny dựng ủ xỏc ủnh nhng cht cú phõn t lng ln v nguyờn tỏc khỏng th gn lờn cht mang (thnh ging) Ngi ta b sung KN, khỏng th th ủ KT2 kt hp vi KN (cn phõn tớch) dng bỏnh kp Sau ủú trụi phn khụng bt cp v b sung khỏng th cng hp enzyme, c cht Enzyme chuyn c cht thnh hp cht mu ủc xỏc ủnh bng ph k T nng ủ cht mu ta tớnh ủc nng ủ cht cn phõn tớch Bc 1: Nh KT1 vo ging ủ cho KT1 bỏm vo thnh ging (antitoxin) KT1 Bc 2: Che bn bng protein Protein Bc 3: Nh khỏng nguyờn ủc hiu (toxin) ủ KN bt cp vi KT1 Khỏng nguyờn Bc 4: B sung KT2 ủ to phc hp KT1-KN-KT2 KT2 Bc 5: sung khỏng th cng hp enzym ủ enzym ( KT.E) ủ lo phỳc hp KT1-KN-KT2- KT E KH-E Bc 6: B sung c chõt ủ enzym thy phõn c cht to thnh cht mu - C cht Bc 7: Enzym chuyn c cht thnh hp cht mu xanh C cht Mu ca dung dch cú th phỏt hin bng mt hoc ph k, t mt ủ quang ta tớnh ủc nng ủ ca khỏng nguyờn ( nng ủ ủc t) 7.4.2 Phng phỏp ELISA cnh tranh Nguyờn tc: Cng hp khỏng nguyờn v protein (hepten) ủc c ủnh trờn b mt cht rn Cho mt lng khỏng nguyờn t v khỏng th cng hp enzyme vo Khỏng nguyờn c ủnh v khỏng nguyờn t cnh tranh bỏm vo khỏng th Lng khỏng nguyờn t cng nhiu thỡ khỏng th b khỏng nguyờn c ủnh gi li cng ớt Sau trụi cỏc cht cũn d, b sung c cht ủ enzyme phõn hu thnh cỏc hp cht mu Mu ca dung dch cú th phỏt hin bng ph k, t mt ủ quang A1, A2 ca mu chng v mu nghiờn cu ta tớnh ủc nng ủ ca khỏng nguyờn (nng ủ ủc t) theo cụng thc C= A1 A2 100;% A1 Trong ủú: A1 l mt ủ quang ca mu chng A2 Mt ủ quang ca mu nghiờn cu Nu C 50% thỡ ủc coi l dng tớnh Nhng test thng s dng: Cỏc enzyme ủc dựng ủc bit nhiu nhng test nhanh nh spot test , dip test u ủim ca test l ủ s dng, r tin nhanh v ủ nhy cao Tuy nhiờn s dng test thỡ ngi nghiờn cu cn phi hiu rừ nghiờn cu c mỡnh ủ s dng test cho thớch hp ng dng: K thut ny dựng ủ ủnh tớnh hoc ủnh lng cỏc cht cú phõn t lng nh, ủc t ca nm mc, d lng thuc tr sõu, d lng cht khỏng sinh Cỏc bc thc hin: Bc 1: Gn cng hp SBA-afatoxi B1(AFB1) (A FB c ủnh trờn protein hapten - SBA) AFB BS A AFB1 AFB1 BSA AFB1 BSA BSA Cng hp protein (BSA) v khỏng nguyờn (AFB) Bc 2: Trỏng ging bng protein AFB BS A AFB BS A Protein ging Bc 3: Cho tip cng hp khỏng th gn enzyme vo mu xột nghim v mu chng ủ to phc hp KN-.KT.E,KN c ủnh - KT AFB BS A AFB BS A Khỏng th cng hp enzyme Mu chng khụng cú A FB Trong mu xột nghim, nu khỏng nguyờn t cng nhiu thỡ khỏng th gn vi khỏng nguyờn c ủnh cng ớt AFB BS A B1 Khỏng th cng hp enzyme, khỏng nguyờn A FB BS A Mu nghiờn cu cú cú A FB t Bc 4: Ra trụi nhng khỏng th khụng bt cp vi khỏng nguyờn c ủnh ca mu chng v mu nghiờn cu Nh vy mu chng khụng cú khỏng nguyờn t nờn khỏng th cng hp b khỏng nguyờn c ủnh gi li nhiu hn AF BS AF BS AF BS Mu ủi chng v mu nghiờn cu sau trụi AF BS Bc 5: B sung c cht AF BS AF BS AF BS AF C cht BS Bc 6:C cht b enzyme phõn hu thnh hp cht cú mu xanh AF BS AF BS AF BS AF BS Mu chng cú mu ủm hn mu nghiờn cu 7.5 K thut thm dch ng dng: K thut ny dựng nhiu chun ủoỏn nhim HIV, nhim khun v xỏc ủnh khỏng th ủn dũng K thut gm nhiu bc ủc tng hp ca phng phỏp chớnh (ủin di SDS- Page, wethern bot, ELISE) - in di protein trờn gel acrylamit ủ tỏch protein - Chuyn protein t bng gel lờn mng lai (nitroxenlulose) - Ph huyt cha khỏng th lờn mng lai v tin hnh lai - Ra nhng khỏng th khụng bt cp khỏng nguyờn trờn mng lai ( proten) - Thờm khỏng khỏng th cng hp enzym ủ khỏng th phn ng vi phc hp (khỏng nguyờn - khỏng th) - B sung c cht ủ enzyme thy phõn c cht thnh dung dch mu - Xỏc ủnh nng ủ khỏng th huyt thụng qua vic ủo mu dung dch bng ph k 7.6 Phng phỏp sc ký ỏi lc dch Thụng thng cỏc ủc t nm mc (AFB1) nụng sn thc phm rt thp ( dng lng vt) ủnh lng vi ủ chớnh xỏc AFB1 ta cn phi lm giu mu bng phng phỏp sc ký ỏi lc dch Sc ký ỏi lc dch ủc da trờn phn ng ủc hiu gia khỏng th v khỏng nguyờn (AFB1) Phng phỏp ny khụng nhng ch ủc hiu m cũn ủn gin, d thc hin v khụng ủc hi cho ngi s dng Nguyờn lý ca sc ký ỏi lc dch Ct sc ký ỏi lc dch ủc minh ho trờn hỡnh 7.10 Trờn nhng ht gel khỏng th ủc hiu vi cht cn phõn tớch ủc gn mt cỏch bn vng nhng khụng mt hot tớnh Cỏc ht gel ny ủc nhi mt ct nh (ct sc ký) Khi cho dch chit mu qua cỏc ct ny cỏc cht cn phõn tớch (khỏng nguyờn) s b khỏng th gi li Sau ton b mu ủó qua ct, ta ct ủ loi b nhng phn khụng bt cp ủc hiu vi khỏng th Sau ủú s dng dung mụi ủ kộo khỏng nguyờn khỏng th Dung dch thu ủc, xỏc ủnh bng phng phỏp ELISA hoc mt s phng phỏp phõn tớch khỏc Hỡnh 7.10: Ct sc ký ỏi lc dch 7.7 Phng phỏp ủin di dch 1- in di khuych tỏn dch Nguyờn tc K thut ny da trờn hin tng khuych tỏn khỏng nguyờn v khỏng th nhng khụng phi l khuych tỏn t nhiờn m ngi ta s dng dũng ủin ủ hng dn cho khỏng nguyờn v khỏng th gp nhanh hn Khỏng nguyờn chuyn ủng t cc õm sang cc dng, khỏng th chuyng ủng ngc li cho ủn khỏng nguyờn gp khỏng th to thnh cỏc vũng cung kt ta cú th nhỡn ủc bng mt hoc thụng qua thuc nhum ủc hiu Cỏch thc hin - Chun bi gel agar hoc gel agarose (1% ủm barbitone pH = 8,2) - Tri gel trờn phin kớnh dy khong 3mm - c hai ging cỏch khong 1cm theo chiu di ca phin kớnh - Chuyn phin kớnh vo bung ủin di cú cha dung dch ủm barbitone pH = 8,2 - Cho mu phõn tớch cha khỏng nguyờn phớa cc õm ( khong 5ữ10àl) - Cho mt lng tng ng khỏng th phớa cc dng - Tin hnh ủin di ủin th 8v/1cm vũng 30 phỳt - Nu cú phn ng khỏng nguyờn khỏng th thỡ s xut hin cỏc vũng cung kt ta cú th nhỡn ủc bng mt hoc thụng qua thuc nhum CBB, 0,025% (Coomassie briliant blue) 2- in di hi t ủng ủin K thut ny cho phộp tỏch bit ủc cỏc protein theo ủim ủng ủin ca chỳng ti cỏc v trớ pH khỏc trờn bn gel Gradient pH ủc to bn gel s ủc hỡnh thnh gia cc õm v cc dng quỏ trỡnh ủin di Kt qu l cỏc protein s di chuyn sc hỳt ca cỏc nhúm ủin tớch ủi vi cc dng v cc õm cho ủn cỏc protein khỏc bit ủin tớch ny s ủt ti ủim ủng ủin ca chỳng thỡ dng li Dóy pH trờn bn gel ủc trỡ n ủnh ta s dng mt hp cht ủin di lng tớnh v ủc gi l cỏc ampholit mang Nhng ion lng tớnh ny cú ủim ủng ủin xỏc ủnh ủc la chn v phõn b ủu thnh mt dóy pH mong mun Hn hp ampholit ny ủc bỏn sn t cỏc hóng ni ting trờn th gi Ngi ta cú th s dng gel polyacrylamit ủ ủin di, ủi vi nhng phõn t quỏ kng knh ta cú th s dng gel agarose Sau chun b xong: mu phõn tớch, khuụn gel, ta ủt vo bung ủin di, ni ủin cc vo b ngun v tin hnh ủin di Thi gian ủin di ph thuc vo thang pH, thng ngi ta ủin di qua ủờm nhit ủ 40C 3- in di hai chiu (2D-Page) in di hai chiu trờn gel polyacrylamit ủc dựng ủ mụ t phng phỏp tỏch tỏch cỏc phõn t protein theo hai chiu in di chiu cú ủ phõn gii cao, bao gm cú ủin di hi t v ủin di protein SDS - Page in di hai chiu l mt cụng c ht sc hu ớc nghiờn cu c bn v nghiờn cu lõm sng Nh ủin di hai chiu (2D-Page) cỏc khỏng th tinh ch cú th ủc chuy thm dch ủ phỏt hin khỏng nguyờn v cỏc epitop tng ng in di hai chiu kt hp vi nhum bc cng cho phộp ủỏnh giỏ chớnh xỏc mc ủ tinh sch ca mt loi protein nht ủnh.(xem phn mụ phng) + Yờu cõu pyờ [...]... xét nghiệm ñặc biệt là các xét nghiệm miễn dịch mà kháng nguyên ở trong pha rắn Hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - strept Người ta cũng tìm thấy chất hoạt tính tương tự như avidin từ xạ khuẩn và như vậy ta có hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - strept trong xét nghiệm miễn dịch Hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - strept (avidin) dùng trong xét nghiệm miễn dịch ñặc biệt vai trò của avidin và strept... phần không bắt cặp ñặc hiệu với kháng thể Sau ñó sử dụng dung môi ñể kéo kháng nguyên ra khỏi kháng thể Dung dịch thu ñược, xác ñịnh bằng phương pháp ELISA hoặc một số phương pháp phân tích khác Hình 7. 10: Cột sắc ký ái lực miễn dịch 7. 7 Phương pháp ñiện di miễn dịch 1- ðiện di khuyếch tán miễn dịch Nguyên tắc Kỹ thuật này dựa trên hiện tượng khuyếch tán kháng nguyên và kháng thể nhưng không phải là... phân cơ chất thành dung dịch màu - Xác ñịnh nồng ñộ kháng thể trong huyết thanh thông qua việc ño màu dung dịch bằng phổ kế 7. 6 Phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch Thông thường các ñộc tố nấm mốc (AFB1) trong nông sản thực phẩm rất thấp (ở dạng lượng vết) ðể ñịnh lượng với ñộ chính xác AFB1 ta cần phải làm giàu mẫu bằng phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch Sắc ký ái lực miễn dịch ñược dựa trên phản... tính ñược nồng ñộ của kháng nguyên huyết thanh cần nghiên cứu 7. 4 Kỹ thuật chất hấp phụ miễn dịch gắn enzym (ELISA - Enzyme Linker Immunosorbent Assay) Những xét nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme là kỹ thuật khá nhạy và ñơn giản, cho phép xác ñịnh kháng nguyên hoặc kháng thểầm có nồng ñộ rất thấp (khoảng 0,1 mg/ml) So với phương pháp miễn dịch phóng xạ thì phương pháp này ñơn giản rẻ tiền an toàn mà... giản, dễ thực hiện và không ñộc hại cho người sử dụng Nguyên lý của sắc ký ái lực miễn dịch Cột sắc ký ái lực miễn dịch ñược minh hoạ trên hình 7. 10 Trên những hạt gel kháng thể ñặc hiệu với chất cần phân tích ñược gắn một cách bền vững nhưng không mất hoạt tính Các hạt gel này ñược nhồi trong một cột nhỏ (cột sắc ký) Khi cho dịch chiết mẫu qua các cột này các chất cần phân tích (kháng nguyên) sẽ bị kháng... thay ñổi màu dung dịch Tùy thuộc vào cường ñộ màu dung dịch ta suy ra nồng ñộ kháng nguyên hoặc kháng thể cần nghiêm cứu Các enzyme thường dùng là: (galactosidase; glucoxydase; akanline phosphotasen, ) Ngoài ra ñể tăng ñộ nhạy của phương pháp người ta sử dụng hệ thống công hợp biotin -avidin, biotin -sprept Hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - avadin Biotin ( vitaminH) ñược tổng hợp từ sinh vật hoặc thực... gelatin hoặc BSA ñể ngăn ngừa sự liên kết không ñặc hiệu ñối với bản nhựa Có nhiều kỹ thuật ELISA , dưói ñây sẽ trình bày kỹ thuật ELI AE tóm bắt kháng ngyuên và ELISE cạnh tranh (hình 7. 9) Hình 7. 9: Kỹ thuật ELI SA 7. 5.1 Phương pháp ELI SA tóm bắt khánh nguyên (bánh kẹp) Phương pháp này dùng ñể xác ñịnh những chất có phân tử lượng lớn về nguyên tác kháng thể gắn lên chất mang (thành giếng) Người ta... hợp KT1-KN-KT2- KT E KH-E Bước 6: Bổ sung cơ chât ñể enzym thủy phân cơ chất tạo thành chất màu - Cơ chất Bước 7: Enzym chuyển cơ chất thành hợp chất màu xanh Cơ chất Màu của dung dịch có thể phát hiện bằng mắt hoặc phổ kế, từ mật ñộ quang ta tính ñược nồng ñộ của kháng nguyên ( nồng ñộ ñộc tố) 7. 4.2 Phương pháp ELISA cạnh tranh Nguyên tắc: Cộng hợp kháng nguyên và protein (hepten) ñược cố ñịnh trên bề... trôi AF BS Bước 5: Bổ sung cơ chất AF BS AF BS AF BS AF Cơ chất BS Bước 6:Cơ chất bị enzyme phân huỷ thành hợp chất có màu xanh AF BS AF BS AF BS AF BS Mẫu chứng có màu ñậm hơn mẫu nghiên cứu 7. 5 Kỹ thuật thấm miễn dịch Ứng dụng: Kỹ thuật này dùng nhiều trong chuẩn ñoán nhiễm HIV, nhiễm khuẩn và xác ñịnh kháng thể ñơn dòng Kỹ thuật gồm nhiều bước ñược tổng hợp của 3 phương pháp chính (ñiện di SDS- Page,... protein SDS - Page ðiện di hai chiều là một công cụ hết sức hữu íc trong nghiên cứu cơ bản và trong nghiên cứu lâm sàng Nhờ ñiện di hai chiều (2D-Page) các kháng thể tinh chế có thể ñược chuyể thấm miễn dịch ñể phát hiện kháng nguyên và các epitop tương ứng ðiện di hai chiều kết hợp với nhuộm bạc cũng cho phép ñánh giá chính xác mức ñộ tinh sạch của một loại protein nhất ñịnh.(xem phần mô phỏng) + ... (hỡnh 7. 7a) b) Dng tớnh: Cú khỏng th cn xột nghim, nờn tn ti phc KN-KT-BT Do ủú b th c ủnh s khụng cú s kt hp vi hng cu nhy cm, kt qu l khụng cú hin tng tan mỏu (hỡnh 7. 7b) a b Hỡnh 7. 7: Kt... khỏng th hunh quang hay khỏng th ủỏnh du 7. 2.2 Hai phng phỏp k thut hunh quang dch Phng phỏp hunh quang MD trc tip (hỡnh 7. 8) Mc ủớch ca phng phỏp: Xỏc ủnh vi sinh vt gõy bnh trờn bờnh phm, Vớ d nh... ELISA , dúi ủõy s trỡnh by k thut ELI AE túm bt khỏng ngyuờn v ELISE cnh tranh (hỡnh 7. 9) Hỡnh 7. 9: K thut ELI SA 7. 5.1 Phng phỏp ELI SA túm bt khỏnh nguyờn (bỏnh kp) Phng phỏp ny dựng ủ xỏc ủnh