Công nghệ tế bào gốc

Tế bào gốc là một lĩnh vực nghiên cứu còn khá mới mẻ ở Việt Nam nhưng trên thế giới công nghệ tế bào gốc đã xuất hiện cách đây cả nửa thập kỷ

Lời Mở Đầu

Tế bào gốc là một lĩnh vực nghiên cứu còn khá mới mẻ ở Việt Nam nhưng trên thế giới công nghệ tế bào gốc đã xuất hiện cách đây cả nửa thập kỷ Những nghiên cứu về tế bào gốc chủ yếu phục vụ cho y tế nhằm tái tạo và thay đổi các mô của cơ thể người bệnh nhờ vào công nghệ tế bào gốc Công nghệ tế bào gốc có thể

áp dụng cho mọi cơ thể sống nhưng do chi phí nghiên cứu, phân lập và nuôi cấy rất đắt nên hiện nó chỉ được sử dụng hạn chế trên một số mô của một số bệnh nhân có khả năng tài chính hoặc với mục đích thực nghiệm là chính

I.Định nghĩa và phân loại tế bào gốc.

1.Định nghĩa tế bào gốc:

Tế bào gốc là tế bào có khả năng phân chia vô hạn định, và có khả năng sinh sản

và tạo nên các tế bào khác có những chức năng chuyên biệt, một khi nó được cấy vào một môi trường thích hợp

Ví dụ: khi trứng được thụ tinh hình thành hợp tử, hợp tử này có những lần phân chia đầu tiên để hình thành phôi thai, các tế bào con được tạo ra từ quá trình phân chia này(16 tế bào đâu tiên) có hình dạng và cấu trúc di truyền hoàn toàn giống nhau và chưa biệt hóa về cấu trúc để tạo nên các mô riêng biệt vì thế mỗi tế bào này có thể là tế bào gốc để hình thành bất cứ mô nào của cơ thể tùy vào môi trường nuôi cấy

Tế bào gốc có nhưng tính chất đặc trưng là:

- Khả năng tự làm mới

- Khả năng phân chia

- Khả năng tự khuêch đại

- Khả năng biệt hóa

Khả năng tự biệt hóa quan trọng nhất vì mọi ứng dụng của tế bào gốc đều nhờ vào tính chất quý giá này

2.Phân loại tế bào gốc:

Có nhiều cách phân loại tế bào gốc nhưng có hai cách phổ biến nhất đó là dựa vào khả năng biệt hóa và vị trí thu nhận tế bào gốc

a)Dựa vào khả năng biệt hóa của tế bào gốc:

Trong cơ thể mỗi chỳng ta đều cú chứa tế bào gốc, từ những giai đoạn phỏt triển đầu tiờn cho đến cuối cuộc đời

Về cơ bản cú 3 loại tế bào gốc: tế bào gốc tổng năng, tế bào gốc toàn năng và tế bào gốc đa năng

CÁC LOẠI TẾ BÀO GỐC

Loại

tế

bào

gốc

Tế

bào

gốc

tống

năng

Mỗi tế bào cú thể phỏt triển thành một cỏ thể mới Tế bào phụi ở giai đoạn mới phỏt triển

(từ 1 đến 3 ngày)

Tế

bào

gốc

toàn

năng

Tế bào cú thể hỡnh thành nờn bất cứ loại tế bào nào trong

cơ thể (trờn 200 loại)

Tế bào gốc phụi tỡm thấy ở phụi bào (từ 5 đến 14 ngày)

Tế

bào

gốc

đa

năng

Tế bào đó được biệt húa, nhưng vẫn cú thể hỡnh thành nờn

một số loại tế bào khỏc

Mụ bào thai, mỏu dõy rốn và tế bào gốc trưởng thành

Tất cả cỏc tế bào gốc đều cú ớch trong nghiờn cứu y học, nhưng mỗi loại

đều cú cả triển vọng cũng như giới hạn riờng Tế bào gốc phụi được hỡnh

thành từ rất sớm trong quỏ trỡnh phỏt triển của con người, vớ dụ như phụi

bào, cú tiềm năng tạo ra tất cả cỏc loại tế bào của cơ thể Tế bào gốc trưởng

thành chỉ cú trong những loại mụ nhất định ở người đó phỏt triển toàn diện,

từ trẻ em thành người lớn, chỉ giới hạn tạo ra một số loại tế bào chuyờn biệt

nhất định mà thụi

b) Dựa vào vị trí thu nhận tế bào gốc:

Embryonic stem cells: Tế bào gốc phụi

Early human embryo at blastocyst stage: Phụi người ở giai đoạn phụi bào

Adult stem cells: Tế bào gốc trưởng thành

From bone marrow in this example: Lấy từ tủy xương

Totipotent cells: Tế bào gốc tổng năng

Pluripotent cells: Tế bào gốc toàn năng

Cultured stem cells: Tế bào gốc được nuụi cấy

Different culture conditions: Điều kiện nuụi cấy khỏc nhau

Different types of differentiated cells: Cỏc loại

tế bào biệt húa khỏc nhau

Liver cells: Tế bào gan

Nerve cells: Tế bào thần kinh

Blood cells: Tế bào mỏu

1 Fertilization: Sự thụ tinh

2 8-Cell embryo: Phụi gồm cú 8 tế bào Trong giai đoạn phỏt triển này, tế bào

gốc phụi được coi là tế bào gốc tổng năng (Totipotent stem cells); mỗi tế bào

này cú tiềm năng phỏt triển thành một con người

3 Blastocyst: Phụi bào Trong giai đoạn phỏt triển này, tế bào gốc phụi được coi

là tế bào gốc toàn năng (Pluripotent stem cells); mỗi tế bào này cú tiềm năng

phỏt triển thành bất kỳ tế bào nào trong cơ thể

4 Fetus: Bào thai Trong giai đoạn phỏt triển này, tế bào gốc phụi được coi là tế

bào gốc toàn năng (Pluripotent stem cells); mỗi tế bào này cú tiềm năng phỏt

triển thành bất kỳ tế bào nào trong cơ thể

5 Tế bào gốc cũng tỡm thấy nơi cơ thể trưởng thành Chỳng duy trỡ và chữa trị

cơ thể Chỳng được định vị tại nhiều tế bào trong cơ thể Cỏc tế bào gốc trưởng

thành cú tiềm năng nhận lấy những tớnh chất riờng biệt, hầu cú thể tạo nờn cỏc

tế bào cú số lượng hạn định trong cỏc mụ Chỳng được coi như là cỏc tế bào gốc

đa năng (Multipotent stem cells).

Hiện nay cỏc khoa học gia vẫn chưa xỏc định được hết mọi tế bào gốc trưởng thành trong cỏc cơ quan quan trọng của cơ thể Một số mụ như nóo, mặc dự cú tế

bào gốc tồn tại nhưng chỳng lại khụng hoạt động, do đú chỳng khụng sẵn sàng phản ứng với tế bào bị chấn thương hay tổn hại Hiện thời cỏc nhà khoa học cũng đang tỡm kiếm cỏch thức kớch thớch những tế bào gốc đang hiện diện để chỳng phỏt triển và tạo ra đỳng loại tế bào cần thiết nhằm thay thế tế bào bị hủy hoại.

III Cỏch nuụi cấy và biệt húa tế bào gốc

1 NUễI CẤY TẾ BÀO GỐC

1.1 Thành phần mụi trường

Mụi trường nuụi cấy tế bào gốc gồm cỏc thành phần sau: muối vụ cơ, carbohydrate, acid bộo, amino acid, vitamine, yếu tố vi lượng, huyết thanh Mỗi thành phần cú chức năng khỏc nhau

Muối vụ cơ: giữ cõn bằng ỏp suất thẩm thấu của cỏc tế bào, điều hũa điện thế

màng

Carbohydrate, acid bộo, amino acid: cung cấp cỏc chất dinh dưỡng thiết yếu giỳp

tế bào phõn chia Trong đú, carbohydrate là nguồn cung cấp năng lượng chớnh cho

tế bào, thường là glucid

Vitamine: cú thể liờn quan đến trạng thỏi biệt húa của tế bào trong sự điều hũa

chức năng, hay hoạt động như một chất chống oxy húa Vitamin nhúm B cần cho

sự tăng sinh và phỏt triển của tế bào Thụng thường vitamine sử dụng trong mụi trường là riboflavin, thiamine và biotin

Yếu tố vi lượng: bao gồm kẽm, đồng, selenium trong đú selenium là chất giỳp

tỏch cỏc gốc oxy tự do

Huyết thanh: cung cấp chất dinh dưỡng và cỏc nhõn tố tăng trưởng, kớch thớch sự

phục hồi cỏc tổn thương của tế bào, chống oxy húa và làm tăng tớnh bỏm dớnh của

tế bào lờn bề mặt bỡnh nuụi

1.2 Kỹ thuật nuụi cấy

Nuụi cấy sơ cấp: là quỏ trỡnh nuụi cấy được thực hiện trực tiếp từ mảnh mụ

ban đầu đến khi cấy chuyền lần thứ nhất

Nuụi cấy sơ cấp gồm cỏc bước: thu nhận mụ  tỏch rời cỏc tế bào  nuụi cấy tế bào

Trong mụ, cỏc tế bào liờn kết với nhau thành một khối thống nhất thụng qua cỏc cầu nối gian bào Tỏch cỏc tế bào ra khỏi mụ bằng cỏch phỏ bỏ những cầu nối gian bào này Cỏc cầu nối này được phỏ hủy bằng hai cỏch:

(1) Tỏc động cơ học: cắt nhuyễn mụ, ộp nhuyễn mụ và tỏch bằng lọc tế bào (2) Dựng enzyme phõn hủy cỏc cầu nối: cầu nối gian bào cú bản chất là

protein, do đú cỏc enzyme thủy phõn protein được sử dụng để tỏch tế bào, những enzyme thường được sử dụng như trypsin, collagenase, chymotrypsin

Nuụi cấy thứ cấp: là quỏ trỡnh nuụi cấy được thực hiện sau lần cấy chuyền

đầu tiờn

Cấy chuyền để cung cấp cỏc chất dinh dưỡng tươi và khụng gian phỏt triển cho cỏc dũng tế bào phỏt triển liờn tục

Cấy chuyền gồm cỏc thao tỏc: loại bỏ mụi trường cũ  rửa bỡnh/đĩa nuụi  tỏch cỏc tế bào gốc bỏm vào đỏy đĩa  pha loóng cỏc tế bào gốc bằng mụi trường mới Tất cả cỏc thao tỏc này được thực hiện trong buồng thao tỏc vụ trựng Việc tỏch bỏ mụi trường cũ được tiến hành bằng nhiều cỏch khỏc nhau Nếu tế bào nuụi trong bỡnh Roux hay cỏc đĩa nuụi đơn giếng, chỉ cần đổ bỏ mụi trường cũ vào bỡnh chứa Nếu tế bào nuụi trong cỏc đĩa đa giếng ( bốn giếng, tỏm giếng ) dựng pipette với đầu tip vụ trựng hỳt hết mụi trường cũ Sau đú tiến hành rửa tế bào bằng PBS

Cỏc tế bào thường được tỏch rời khỏi đỏy đĩa bằng enzyme trypsin Tuy nhiờn, một số tế bào bỏm khụng thật chặt nờn chỉ cần dựng pipette hỳt và huyền phự vài lần tế bào sẽ tỏch ra

1.3 Một số quy trỡnh thu nhận và nuụi cấy tế bào gốc

Thu nhận và nuụi cấy tế bào gốc từ tủy xương chuột

Sơ đồ 1 Quy trỡnh thu nhận tế bào gốc từ tủy xương chuột

Đùi chuột vừa được thu nhận

Rửa tủy xương bằng dung dịch

D’MEM và thu nhận huyền phự tế

bào

Thu nhận xương đùi chuột

Rửa bằng dung dịch PBS

Lúc bỏ phần cơ và thịt

Rửa lại bằng dung dịch PBS

Thay môi trường mới sau 24 giờ

Cắt bỏ hai đầu xương đùi

Nuụi tế bào trong dụng cụ nuụi phự hợp

Thu nhận và nuụi cấy tế bào gốc từ mỏu cuống rốn

Sơ đồ 2 Quy trỡnh thu nhận tế bào gốc từ mỏu cuống rốn

2 BIỆT HểA TẾ BÀO GỐC

Biệt húa tế bào gốc là quỏ trỡnh biến đổi từ tế bào gốc khụng cú chức năng chuyờn biệt thành tế bào chuyờn húa

Pha mẫu máu thu được với dung dịch PBS/2mM EDTA theo tỉ lệ 1:1

Dựng pipette hỳt 15 ml dung dịch Ficoll_Hypaque vào ống ly tõm 50ml

Rút nhẹ 30 ml hỗn hợp PBS và mỏu lờn trờn lớp dung dịch Ficoll_Hypaque sao cho không làm xáo động bề mặt

Ficoll_Hypaque/mẫu

Ly tõm 30’ ở 1500v\phỳt, nhiệt độ phũng

Tỏch tế bào đơn nhân ra từ pha giữa

Rửa 2-3 lần với PBS/EDTA

Tỏi huyền phự tế bào trong môi trường nuụi cấy

Nguyờn tắc chung nhất là loại bỏ cỏc tỏc nhõn biệt húa khụng định hướng và cảm ứng tế bào gốc biệt húa thành dạng tế bào mong muốn bằng cỏc tỏc nhõn biệt húa thớch hợp

Sự biệt húa tế bào gốc khụng chỉ phụ thuộc vào tiềm năng biệt húa của tế bào gốc

mà cũn phụ thuộc vào tỏc nhõn biệt húa

2.1 Cỏc phương phỏp biệt húa

Dựa vào kiểu tỏc nhõn biệt húa, phõn thành cỏc phương phỏp sau:

Biệt húa bằng húa chất

Một số hormone, cytokine, vitamin, cỏc ion Ca2+ tỏc động lờn tế bào làm tế bào thay đổi sự biểu hiện của gen, đúng một số gen đang hoạt động và mở một số gen chưa hoạt động Những thay đổi này dẫn đến tế bào thay đổi theo chiều hướng phự hợp với kớch thớch, kết quả tạo thành một kiểu tế bào chuyờn biệt nào đú Ngoài

ra, cỏc nhõn tố tăng trưởng thu nhận từ cỏc dịch mụ cũng được xem là chất biệt húa định hướng

Biệt húa bằng cỏc chất nền

Biệt húa bằng cỏc chất nền dựa vào sự tương tỏc giữa tế bào và chất nền trong nuụi cấy tế bào in vitro Tế bào hoạt động nằm trong chất nền ngoại bào ECM (Extra cellular matrix) ECM cú chứa cỏc hợp chất phõn tử cao như collagen, elastin, laminin, fibronectin

Ngoài vai trũ làm cấu trỳc như một giỏ thể cho cỏc tế bào, ECM cũn cú vai trũ sinh

lý như một vi mụi trường của cỏc tế bào Mỗi mụ khỏc nhau cú thành phần ECM của riờng nú Do đú, việc bổ sung ECM thớch hợp vào nuụi cấy in vitro giỳp cỏc

tế bào gốc cú thể biệt húa thành cỏc tế bào mong muốn

Đồng nuụi cấy với cỏc tế bào đó biệt húa

Khi thực hiện đồng nuụi cấy, tế bào gốc và tế bào đó biệt húa tương tỏc mật thiết với nhau, dẫn đến sự truyền cỏc tớn hiệu phõn tử một cỏch hiệu quả gõy ra sự biệt húa ở tế bào gốc

Kớch thớch vật lý

Xung điện, cỏc lực cơ học và xử lý nhiệt cú thể làm tế bào gốc biệt húa Nếu làm giảm nhiệt độ cỏc tế bào cơ tim phụi chuột sẽ làm tăng sự biểu hiện của beta-TGF, tỏc nhõn gõy biệt húa ở một số tế bào

Cỏc gốc tự do và dạng oxygen hoạt động

Cỏc gốc tự do và cỏc dạng oxygen hoạt động là những chất truyền tin nội bào quan trọng trong quỏ trỡnh biệt húa của tế bào

Chuyển gen

Phương phỏp này thường được sử dụng để điều hũa sự biệt húa tế bào gốc phụi Đưa gen cần chuyển vào tế bào nhằm bổ sung một số gen hoạt động vào hệ gen của tế bào gốc phụi, khởi động sự biệt húa tế bào gốc theo con đường tạo thành tế bào chuyờn húa mong muốn

2.2 Một số quy trỡnh biệt húa tế bào gốc

Biệt húa tế bào gốc thành tế bào xương

Sơ đồ 3 Quy trỡnh biệt húa tế bào gốc thành tế bào xương.

Bỡnh Roux chứa tế bào gốc

Bổ sung LG-DMEM, FBS, khỏng sinh, dexamethasone, beta-glycerolphosphate

Nuụi trong 14-28 ngày

Tế bào xương bắt màu đỏ của Alizarin red

Biệt húa tế bào gốc thành tế bào mỡ

Sơ đồ 4 Quy trỡnh biệt húa tế bào gốc thành tế bào mỡ.

III.Tỡm hiểu về tế bào gốc cuống rốn và những ứng dụng

Dõy rốn được bao bọc bờn ngoài là một lớp màng quấn quanh tổ chức của dõy rốn Từ lớp màng bao dõy rốn này cú thể thu được hai loại tế bào gốc là tế bào gốc biểu mụ và tế bào gốc trung mụ

Từ tế bào gốc trung mụ màng dõy rốn cỏc nhà khoa học đó biệt hoỏ được chỳng thành cỏc nguyờn bào sợi (là những tế bào phớa dưới của da), tế bào

mỡ, tế bào sụn, nguyờn bào xương, tế bào giống tế bào thần kinh và những

tế bào sản sinh chất nhầy mucin Từ tế bào gốc biểu mụ màng dõy rốn cỏc nhà khoa học đó biệt hoỏ được chỳng thành tế bào sừng (là những tế bào bề mặt da), tế bào gan và tế bào sản sinh chất nhầy mucin Khi phối hợp cả hai loại tế bào gốc trung mụ và biểu mụ cỏc nhà khoa học đó tạo ra những cấu trỳc tương đương da, cũn được gọi là da nhõn tạo khụng gian ba chiều

Bỡnh Roux chứa tế bào gốc

Bổ sung DMEM, FBS, khỏng sinh, dexamethasone, insulin

Nuụi trong 3 ngày

Tế bào mỡ bắt màu xanh đen đến nõu của Sudan black

Cho đến nay, vẫn chưa cú một ứng dụng chớnh thức nào sử dụng tế bào gốc màng dõy rốn để điều trị trờn người Cỏc nghiờn cứu trờn thực nghiệm cho thấy tế bào gốc màng dõy rốn cú khả năng thỳc đẩy quỏ trỡnh liền vết

thương do bỏng và cỏc vết thương mạn tớnh (như cỏc vết loột ở bệnh nhõn tiểu đường, bệnh nhõn sau chiếu xạ, bệnh nhõn liệt bị loột cỏc vựng tỡ đố) Bờn cạnh hướng nghiờn cứu ứng dụng điều trị vết thương, cỏc tế bào gốc màng dõy rốn cũng đang được nghiờn cứu để điều trị phục hồi thớnh giỏc và thị giỏc thụng qua sửa chữa tế bào bề mặt và tế bào thần kinh, sửa chữa xương và sụn, phối hợp trị liệu gen với tế bào để điều trị cỏc bệnh như

chứng mỏu chảy khụng đụng do thiếu yếu tố đụng mỏu, và điều trị bệnh tiểu đường Cỏc kết quả nghiờn cứu thực nghiệm đầy hứa hẹn mở ra triển vọng

cú thể sớm đưa tế bào gốc màng dõy rốn vào ứng dụng điều trị trờn người

Trờn thực tế cỏc tế bào cuống rốn mới chỉ được sử dụng hạn chế trong việc điều trị cỏc bệnh liờn quan đến da và cú một vài trường hợp ghộp tủy thành cụng Đú là những dấu hiệu hết sức đỏng mừng cho ngành y học trong việc điều trị một số căn bệnh liờn quan đến cỏc loại tế bào được biệt húa từ

tế bào mỏu cuống rốn

Cỏc tế bào cuống rốn cú quy trinh xử lý chung trong quỏ trỡnh điều trị như sau:

Mỏu cuống rốn được lấy trờn tĩnh mạch cuống rốn của nhau thai ngay sau khi sinh

Cho v ào tỳi cú dung dịch chống đông, rồi bảo quản bằng dung

nhiệt độ -196 độ C

kiểm tra loại trừ cỏc bệnh lõy nhiễm như HIV, các bệnh hiểm nghốo….

Cho v ào tỳi cú dung dịch chống đông, rồi bảo quản bằng dung

nhiệt độ -196 độ C

Hiện thời ở Việt Nam cỏc nhà khoa học cú thể thu nhận tế bào gốc cuống rốn và bước đầu cú những thành cụng trong điều trị bệnh ngoài da và cỏc bệnh ỏc tớnh liờn quan đến mỏu

Ngõn hàng tế bào gốc cuống rốn đó được thành lập ở Tp HCM và đó thu nhận và bảo quản ngày càng nhiều mẫu kớ gửi

III.ứng dụng

- Tế bào gốc - cho dự là mỏu cuống rốn, tế bào người lớn hay phụi thai - cú nhiều ứng dụng trong cỏc lĩnh vực nghiờn cứu khoa học và liệu phỏp tế bào Đối với cỏc nhà nghiờn cứu, cỏc tế bào gốc là chỡa khoỏ để hiểu biết làm thế nào mà con người cú thể phỏt triển từ chỉ một tế bào duy nhất Hy vọng rằng, việc nghiờn cứu tế bào gốc sẽ khỏm phỏ những bớ ẩn của một tế bào biệt hoỏ và cú thể phõn biệt tế bào gốc với tế bào bỡnh thường, và cũng sẽ xỏc định những tớn hiệu kớch hoạt quỏ trỡnh biệt húa tế bào Những hiểu biết hơn, và cú thể kiểm soỏt thậm chớ, trong phõn chia tế bào và sự khỏc

Lưu trữ tế bào gốc trong môi trường nitơ lỏng(-196 oC)

Phá đông và thao tác nuôi cấy trong môi trường thớch hợp để tạo loại tế bào cần thiết

Cấy ghép vào cơ thể bệnh nhõn