CÔNG NGHỆ TẾ BÀO
CƠNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 1 Đại học Quốc gia Tp.Hồ Chí Minh Trường Đại học Bách Khoa Khoa Công nghệ Hóa học BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC Phúc trình CƠNG NGHỆ TẾ BÀO Đề tài : IN VITRO CBHD Cô : Lê Thò Thuỷ Tiên Sinh viên : Nguyễn Thò Mộng Vân 60802586 Vũ Viết Văn Thưởng 60802199 Lớp : HC08SH Năm học: 2010 _ 2011 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 2 Mục Lục: I. Mở Đầu II. Tổng Quan Tài Liệu 1. Nguồn gốc cây chè 2. Phân loại cây chè 3. Giá trị của cây chè 4. Tình hình sản xuất chè ở thế giới và Việt Nam 5. Giới thiệu giống chè TB14 6. Các phương pháp nhân giống chè 7. Cơ sở của giâm cành chè 8. Các nghiên cứu về in vitro trên chè I. Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu 1. Vật liệu thí nghiệm 2. Phương pháp thí nghiệm II. Kết Quả Và Thảo Luận 1. Hình ảnh quá trình nuôi cấy hom chè 2. Xác định phương pháp, chất khử trùng mẫu, thời gian khử trùng mẫu 3. Kết luận 4. Đề nghị III. Nghiên Cứu Chiết Xuất và Xác Định tác dụng kháng oxy hóa của Polyphenol từ lá chè xanh Việt Nam 1. Giới Thiệu 2. Hợp chất EGCG: 3. Chiết Xuất EGCG: IV. Tài Liệu Tham Khảo: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 3 I. MỞ ĐẦU Cây chè (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) là cây công nghiệp dài ngày có giá trị xuất khẩu và vai trò quan trọng trong việc bố trí cơ cấu cây trồng và dân cư ở nước ta. Cây chè có chu kỳ khai thác kinh tế kéo dài 40 – 50 năm và có thể trên 100 năm, mang lại nguồn thu nhập chính cho nhiều nông hộ. Năm 2006 tổ chức Y tế thế giới đã bình chọn: “Thức uống lựa chọn số một có lợi cho sức khỏe là nước chè”. Theo tổ chức FAO (2006), Việt Nam được xếp thứ 7 về sản lượng và thứ 6 về khối lượng xuất khẩu chè trên thế giới. Cả nước có khoảng 125000 ha chè với sản lượng 570000 tấn chè thô của 630 cơ sở nhà máy ở 34 tỉnh thành trong cả nước. Qua đó, cho thấy việc phát triển và mở rộng diện tích chè và năng cao chất lượng chè nguyên liệu để phục vụ xuất khẩu là rất cần thiết. Chè là cây giao phấn, cây con trồng từ hạt phân ly tính trạng mạnh, làm vườn chè không đồng đều, để phát triển những vườn chè đồng đều cho năng suất cao, phẩm chất tốt, biện pháp được khuyến cáo là nhân giống vô tính. Biện pháp giâm cành truyền thống dễ áp dụng, có hệ số nhân giống cao.Tuy nhiên, phương pháp giâm cành bằng hom truyền thống làm cho tuổi chung của cây chè con cao hơn do mang một phần tuổi chung từ cây mẹ làm giảm chu kỳ khai thác kinh tế về sau. Nếu quy trình giâm cành chè không được thực hiện nghiêm ngặt, nguyên liệu giâm cành không được trẻ hóa đúng thì cây con sẽ mau bị thoái hóa. Thời gian gần đây, ở các vườn chè cành mới nhất là các vườn chè trồng các giống Đài Loan cây chè sinh trưởng kém và có triệu chứng thoái hóa. Hiện nay, việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp in vitro có xu hướng ngày càng được áp dụng rộng rãi, đạt được nhiều kết quả khả quan. Nhân giống in vitro có thể tạo được cây sạch bệnh, phục tráng giống. Dựa trên những ứng dụng của công nghệ sinh học trong nhân giống cây trồng, giâm cành chè in vitro đã được tiến hành. Tuy nhiên, nhân giống bằng phương pháp giâm cành chè in vitro là phương pháp tương đối mới. Hiện nay vẫn là chủ đề nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, kết quả thu được còn hạn chế. Việc nghiên cứu phương pháp nhân giống chè in vitro còn cung cấp phương tiện phục tráng giống chè cành. Một số nghiên cứu gần đây trên thế giới đã có những thành công bước đầu trong việc áp dụng biện pháp nhân giống in vitro trên chè. Nguyên nhân lớn nhất hạn chế việc áp dụng của phương pháp in vitro trên chè là giai đoạn vô mẫu. Do hàm lượng tanin trong cây chè cao nên xác định phương pháp khử tanin trong mẫu thích hợp là rất quan trọng. Tuy nhiên, tại Việt Nam, việc áp dụng phương pháp in vitro để nhân giống chè rất ít và chưa có kết quả nào công bố. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 4 II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 Nguồn gốc cây chè Việc xác định nguồn gốc cây chè cho đến hiện tại vẫn còn nhiều quan điểm khác nhau về nguồn gốc cây chè, dựa trên những cơ sở về lịch sử, khảo cổ học và thực vật học. Trong suốt thời gian dài, dựa vào những sự khác biệt về hình thái của các giống chè Ấn Độ và Trung Quốc, các nhà thực vật học đã chấp nhận giả thuyết cây chè có hai trung tâm khởi nguyên: Trung Quốc và Ấn Độ. Nhưng theo Hashimoto và Shimura, sự khác biệt giữa chè Ấn Độ và chè Trung Quốc không đủ để giữ thuyết nhị nguyên về nguồn gốc chè. Bởi vì chè Ấn Độ và chè Trung Quốc đều có cùng số nhiễm sắc thể (2n = 2x = 30) và chúng có thể thụ phấn chéo một cách tự do. Một số quan điểm được nhiều người chấp nhận nhất hiện nay là: Theo Daraselia (1989) luận điểm có cơ sở khoa học là dựa theo học thuyết“Trung tâm khởi nguyên cây trồng” của Vavilôp thì cây chè có nguồn gốc ở Vân Nam Trung Quốc (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Thiết, 2005) Cây chè có nguồn gốc ở vùng Assam (Ấn Độ). Năm 1823, Bruce đã phát hiện những cây chè dại lá to ở vùng Assam. Cây chè có nguồn gốc ở Việt Nam: Những công trình nghiên cứu của Djemukhatze (1961 – 1976) về phức chất cathesin của lá chè từ những nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần các chất cathesin giữa các loại chè được trồng và chè mọc hoang dại đã nêu lên luận điểm về sự tiến hóa sinh hóa của cây chè, trên cơ sở đó xác minh nguồn gốc của cây chè. Djemukhatze kết luận rằng những cây chè mọc hoang dại ở Việt Nam tổng hợp chủ yếu là (-) – epicathesin và (-) – epicathesin galat (chiếm 70% tổng số các loại cathesin ), cho phép đi tới một quyết định mới: “Nguồn gốc cây chè chính là ở Việt Nam” Tuy có rất nhiều quan điểm khác nhau chứng minh về nguồn gốc ra đời của cây chè nhưng đều có một sự thống nhất đó là: Cây chè có nguồn gốc từ Châu Á, nơi có điều kiện khí hậu nóng ẩm. 2 Phân loại cây chè Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis (L.) O. Kuntze hoặc Thea sinensis L., thuộc ngành thực vật hạt kín Angiospermae, lớp song tử diệp Dicotyledonae, bộ chè Theales, họ chè Theaceae, chi chè Camellia (Thea), loài sinensis. Hiện nay trong các cách phân loại, cách phân loại cây chè của Cohen Stuart (1919), chia cây chè ra làm bốn thứ (varietas): Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var. macrophylla Sieb), chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var. bohea hay (Camellia sinensis var. microphylla), chè Shan (Camellia sinensis var. Shan J. Wan-Fan) chè Ấn Độ (Camellia sinensis var.assamica (Mast) Choisy) (trích dẫn bởi Võ Thái Dân, 2004). 3 Giá trị của cây chè Chè là loại nước uống thông dụng và phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Hỗn hợp tanin trong chè có tác dụng làm nguôi cơn khát. Cafein và một số hợp chất ankaloide khác (theobromin, theofinlin, adenine) trong chè là những chất có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho thần kinh minh mẫn, kích thích sự tiêu hóa. Trong chè có chứa nhiều vitamin: A, B1, B2, B6, K, PP,… và đặc biệt chứa nhiều Vitamin C. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 5 Đây là nguồn dinh dưỡng có giá trị và rất cần thiết cho cơ thể. Theo Zaprometo, cathesin chè có tác dụng vững chắc cho mao mạch trong cơ thể con người. Qua kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản đã chứng minh chè có tác dụng chống phóng xạ đó là chất stronti 90 (Sr-90) là một đồng vị phóng xạ nguy hiểm. Ngoài ra, chè được dùng làm chất tạo màu thực phẩm vừa có khả năng thay thế các chất tạp màu nhân tạo độc hại, có giá trị dinh dưỡng cao. Các sản phẩm phụ của chè như dầu hạt chè có thể sử dụng trong công nghiệp hay làm dầu ăn như các loại thực phẩm khác. 4 Tình hình sản xuất chè ở thế giới và Việt Nam 4.1 Tình hình sản xuất chè trên thế giới Chè được trồng tập trung nhiều nhất ở Châu Á và Châu Phi. Trên thế giới cây chè được phát triển với tốc độ rất nhanh từ thế kỷ XVIII. Trên thế giới hiện nay có khoảng 52 nước trồng chè, chiếm 2,7 triệu hecta diện tích đất canh tác nông nghiệp trên thế giới, sản lượng hàng năm đạt 2,2 triệu tấn. Mặc dù chỉ chiếm 16,4% tổng diện tích sản xuất chè của thế giới nhưng Ấn Độ là nước xuất khẩu chè lớn nhất thế giới với doanh thu hàng năm đạt 66 triệu đôla Mỹ một năm.Trong những năm qua diện tích chè trên thế giới không ngừng tăng trưởng bình quân 40.000 ha/năm. Theo Mao (1995) diện tích chè thế giới ổn định trong vòng 15 năm qua đạt khoảng 2.430.000 ha. Sản lượng chè thế giới gia tăng do được chú trọng đầu tư, nghiên cứu cải thiện. Số lượng thống kê của FAO về diện tích chè trên thế giới được trình bày ở bảng 2.1 và bảng 2.2. Bảng 2.1 Diện tích chè kinh doanh (ha) ở một số khu vực trên thế giới 2000 – 2007 Năm Thế giới Châu á Châuphi Châumỹ Châu âu Châu đại dương 2000 2384046 2104580 223544 46982 1540 7400 2001 2415365 2132570 228448 45407 1540 7400 2002 2480092 2183976 242608 44573 1535 7400 2003 2508339 2217087 241190 43526 1536 5000 2004 2601131 2801064 517608 80018 1365 9000 2005 2716075 2980027 532703 80095 1372 9000 2006 2708366 3052297 499438 84452 1265 9000 2007 2805502 3231778 565506 80269 755 9000 (Nguồn: www. fao.org, 2009) Về lâu dài, các nước sản xuất chè lớn đều tăng sản lượng kể từ thập niên 80 nhưng với tốc độ chậm. Hơn nữa, sản lượng thu hoạch rất khác nhau giữa các năm do phụ thuộc nhiều vào thời tiết và nhiều nhân tố khác. Nhìn chung, sản lượng chè dự kiến sẽ tăng khoảng 1,9%/năm giai đoạn từ 1999- 2010, cao hơn mức bình quân 1,3%/năm của thập kỷ 90. Phần lớn sự tăng trưởng này là nhờ gia tăng sản lượng chè xanh. Theo ước tính của FAO, sản lượng chè đen thế giới sẽ tăng trung bình 1,2 triệu tấn/năm lên 2,4 triệu tấn vào năm 2010, chủ yếu là nhờ tăng năng suất. Trong giai đoạn này, dự đoán phần lớn các nhà sản xuất chè châu Phi sẽ tăng sản lượng do các đồn điền chè đã đến tuổi trưởng thành và kỹ thuật sản xuất cũng được cải thiện. Ví dụ như sản lượng chè của Uganda, Kenya và Tanzania được dự đoán sẽ tăng tương ứng thêm 2,7%, 2,3% và 1,7% CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 6 Bảng 2.2 Một số quốc gia có diện tích sản xuất chè (ha) lớn trên thế giới năm Ấn độ Trung quốc Sri lanka Kenya Indonesia 2000 490000 898012 188970 120390 121200 2001 504000 905662 188970 124290 115416 2002 510000 913100 210620 131450 115803 2003 516000 943400 210620 131450 116200 2004 520000 989262 212720 136700 116200 2005 521000 1058564 212720 141300 142847 2006 523000 1116740 212720 147080 111055 2007 558000 1165732 212720 149190 110524 (Nguồn: www. fao.org, 2009) Tại châu Á, sản lượng chè Ấn Độ ước tăng bình quân 2,5%/năm cho đến năm 2010. Trong thập kỷ này, tỉ trọng của Ấn Độ trong tổng sản lượng chè thế giới sẽ tăng từ 38% lên 44%. Sản lượng chè của Inđônêxia và Sri Lanka ước tăng lần lượt 1,1% và 1,7%. Tuy nhiên, sản lượng chè đen của Trung Quốc có thể sẽ tiếp tục giảm (khoảng 1,7%/năm) do nước này đang tập trung sản xuất các loại chè khác. Đến 2010, dự đoán ba nước sản xuất chè đen lớn nhất thế giới là Ấn Độ, Kyena và Sri Lanka sẽ chiếm 70% sản lượng chè toàn cầu, tăng so với 63% năm 2000. Chè xanh chủ yếu được sản xuất ở Trung Quốc (chiếm 73% sản lượng thế giới năm 2000), Nhật Bản (13%), Việt Nam (6%) và Inđônêxia (6%). Phần lớn chè xanh được tiêu thụ ngay tại nước sản xuất (như Trung Quốc và Nhật Bản). Khối lượng xuất khẩu rất thấp, chỉ khoảng 27%. Trong năm 2001, nhập khẩu chè xanh thế giới chỉ đạt tổng cộng 187.000 tấn, bằng 17% lượng chè đen nhập khẩu. Theo ước tính của FAO, sản lượng chè xanh thế giới sẽ tăng bình quân 2,6%/năm cho đến năm 2010, cao hơn gấp 3 lần tỉ lệ tăng trưởng của chè đen và đạt 900.000 tấn. Trong đó, sản lượng chè xanh của Trung Quốc tăng nhiều nhất (2,7%/năm), tiếp đến là Việt Nam (2,5%), Inđônêxia (2,3%) và cuối cùng là Nhật Bản (0,1%/năm). Đến năm 2010, Trung Quốc sẽ chiếm tới 75% sản lượng chè thế giới. 4.1 Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam Việt Nam được xác định là một trong tám địa điểm cội nguồn của cây chè, có điều kiện địa hình, đất đai, khí hậu phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây chè và đứng thứ năm trên thế giới về sản lượng và xuất khẩu chè. Sản phẩm chè của Việt Nam có mặt trên 110 quốc gia và vùng lãnh thổ, trong đó “CheViet” đã được đăng ký bảo hộ tại 70 thị trường (Hiệp hội Chè Việt Nam, 2009). Năm 2004, toàn quốc có 108.000 ha chè, đạt năng suất 513,8 nghìn tấn (chè tươi) trong đó có 85% diện tích đang được trồng bằng các giống chè địa phương có năng suất và chất lượng thấp nên chất lượng chè của Việt Nam chỉ đạt mức trung bình yếu của thế giới (Báo cáo ngành chè năm 2004). CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 7 Bảng 2.3 Biến động diện tích, năng suất và sản lượng chè ở Việt Nam từ 2000- 2007 Năm Diện tích(ha) Năng suất (kg chè khô/năm/ha) Sản lượng (tấn/năm) 2000 70300 9943 69900 2001 80000 9462 75700 2202 98000 9612 94200 2003 86100 12113 104300 2004 120800 9892 119500 2005 122500 10818 132525 2006 102100 14789 151000 2007 106500 15399 164000 (Nguồn: www. fao.org, 2009) Hiện nay, nước ta có năm vùng sản suất chè chính bao gồm: Vùng chè miền núi Tây Bắc: gồm Sơn La, Lai Châu là hai tỉnh trồng chè lớn, giống chè trồng chủ yếu là Shan và Trung Du Vùng chè Việt Bắc – Hoàng Liên Sơn: gồm các tỉnh Hà Giang, Tuyên Quang, Yên Bái, Hòa Bình, Lào Cai, giống chè chủ yếu là Shan, Trung du, Assam Vùng chè Trung du – Bắc Bộ: Bao gồm Thái Nguyên, Bắc Cạn, Phú Thọ, Yên Bái, Hà Tây, giống chủ yếu được trồng chủ yếu là Trung Du, Assam và chè lai. Vùng chè Bắc Trung Bộ: gồm các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh, giống trồng chu yếu là chè Gay địa phương và chè Assam. Vùng chè Miền Nam: chủ yếu trồng ở vùng Tây Nguyên như Lâm Đồng, Gia Lai, Kontum và Đắc Lắc, giống được trồng chủ yếu là chè Shan. Việt Nam trở thành thành viên chính thức của Tổ chức thương mại thế giới (WTO) từ tháng 1/2007. Nền nông nghiệp nói chung, ngành chè nói riêng bước vào quá trình hội nhập đối mặt với thách thức lớn về cải thiện chất lượng sản phẩm, tiếp cận thị trường mới, nhất là bối cảnh buộc phải thực hiện những biện pháp ngặt nghèo hơn các nước khác về kiểm dịch động thực vật, an toàn thực phẩm, sở hữu trí tuệ và các rào cản kỹ thuật trong thương mại. Năm 2006, chè Việt Nam đứng ở vị trí thứ 6 về diện tích, thứ 7 về sản lượng và thứ 5 về lượng xuất khẩu trong số gần 40 nước sản xuất và hơn 30 nước xuất khẩu chính, được xem là kỷ lục về sản lượng và giá trị xuất khẩu mà trước đó chưa từng có. Theo số liệu của của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn năm 2009, diện tích trồng chè của Việt Nam sẽ đạt 131,5 nghìn ha tăng 1.900 ha so với diện tích năm 2007. Năng suất trồng chè năm 2009 dự kiến đạt 6,5 tấn búp tươi/ha, tăng so với mức 5,9 tấn/ha của năm 2007 (Vinanet, 2009). Song, chè Việt Nam là một trong số ít nước được cảnh báo về dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm. Chính vì vậy, vấn đề sản xuất chè an toàn, chất lượng, bền vững, an toàn cho sức khỏe của con người, bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững đã và đang được nghành chè quyết tâm thực hiện. 5 Giới thiệu giống chè TB14 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 8 Là giống chè Shan Trấn Ninh được người Pháp bình tuyển tại Blao từ tập đoàn so sánh giống của Trung tâm thực nghiệm nông nghiệp Bảo Lộc từ năm 1952. Hiện nay là giống chủ lực của nghành chè Lâm Đồng chiếm 80% diện tích (Trung tâm nghiên cứu và chuyển giao kĩ thuật cây công nghiệp và cây ăn quả Lâm Đồng, 2008). Giống chè TB14 có lá màu xanh nhạt, hình thon dài, lá dài từ 10 – 15 cm, rộng 4 – 4,5 cm, có 12 đôi gân lá. Mép lá có răng cưa đều và kéo dài đến chóp lá. Góc lá lớn, trên tôm có nhiều lông tơ trắng mịn, khả năng phân cành mạnh, năng suất đạt từ 18 – 20 tấn/ha/năm. Chất lượng chè phù hợp với chế biến hương nội tiêu và chè đen. Hiện nay là giống chè cành chủ lực ở Lâm Đồng. 6 Các phương pháp nhân giống chè 6.1 Nhân giống bằng hạt Đây là phương pháp nhân giống chè đầu tiên được áp dụng từ khi ngành chè Việt Nam phát triển. Hiện nay trong phát triển ngành chè khuyến cáo là không nên sử dụng vì chè là cây giao phấn nên vườn chè trồng bằng hạt có sự phân ly rất lớn về hình thái, về đặc tính sinh trưởng, về năng suất, phẩm chất giảm và không ổn, chỉ được áp dụng trong công tác chọn tạo giống mới ở các trung tâm nghiên cứu. Ưu điểm – Đơn giản, dễ làm giá thành thấp. – Chi phí lao động thấp. – Tuổi thọ của cây chè cao. – Cây có khả năng thích ứng rộng trên nhiều địa hình. Nhược điểm – Cây chè không giữ được đặc tính của cây mẹ, quần thể cây chè không đồng đều, năng suất chè không cao, chất lượng phẩm chất không ổn định. – Hạt chè dễ mất sức nảy mầm và khó bảo quản được lâu. Thời vụ gieo hạt chủ yếu phụ thuộc vào mùa quả chín thường gieo vào đầu tháng 10 đến hết tháng 11. Số lượng hạt gieo cho một hecta 200 – 250 kg tương đương 400 – 500 kg quả. Do đó hệ số nhân giống thấp. Theo Đỗ Ngọc Quý và ctv. (1978) một hecta chè để giống quả chỉ trồng được bốn hecta. 6.2 Nhân giống bằng phương pháp chiết cành Chiết cành chè được tiến hành trên cây mẹ, hàng năm các cành chiết không thu hái, sau đó tiến hành chiết bằng hai cách: Cách 1: Uốn cành sát đất, lấy đất vùi một phần cành, phần bị lấp đất sẽ mọc ra rễ mới. Cách 2: Đắp đất vào toàn bộ gốc cao đến tận các cành, để cho phần cành bị lấp mọc ra rễ mới. Khi cành chè có bộ rễ phát triển tốt tiến hành chặt đứt phần tiếp giáp với cây mẹ rồi bứng cành đưa đi trồng. Ưu điểm – Cây con mau cho thu hoạch búp, rút ngắn thời gian kiến thiết cơ bản. – Cành chiết đem trồng có tỷ lệ sống cao. Nhược điểm – Phương pháp chiết cành có hệ số nhân giống thấp một cây chè mẹ chỉ được 10 – 15 cây con. – Tốn nhiều nhân công nên không được phổ biến rộng rãi trong sản xuất. 6.3 Nhân giống bằng ghép cây con trong giai đoạn vườn ươm CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 9 Chè là cây giao phấn vì vậy khi trồng chè bằng hạt làm cây chè dễ bị thoái hóa và lẫn tạp, năng suất không ổn định, nhưng chè trồng bằng hạt có bộ rễ phát triển tốt ăn sâu, chịu hạn tốt. Mặt khác, cây chè trồng bằng cành cho năng suất cao hơn chè trồng bằng hạt từ 33 – 45 % tùy giống (kết quả nghiên cứu của Trường Đại Học Nông Nghiêp I Hà Nội), nhưng bộ rễ của chè cành phát triển nông và chịu hạn kém. Tháng 5 – 1999 Trung tâm Nghiên cứu và chuyển giao kỹ thuật cây Công nghiệp và cây Ăn Quả Lâm Đồng đã tiến hành nghiên cứu thành công kỹ thuật tạo cây chè ghép. Cây chè ghép được tạo thành bằng cách kết hợp giữa hai cá thể, chè trồng bằng hạt làm gốc ghép và chè cành làm cành ghép. Cành ghép lấy từ cây chè giống nội địa hoặc nhập nội có năng suất và phẩm chất cao, dễ canh tác và chăm sóc. Ưu điểm: – Sản lượng và chất lượng chè cao hơn cây chè hạt. – Cây con đồng đều. – Cây chè ghép có khả năng chống chịu tốt và tuổi thọ cao, dễ chăm sóc. Nhược điểm: – Chi phí cao, đòi hỏi kỹ thuật trong thao tác ghép, thời vụ ghép. 6.4 Nhân giống bằng phương pháp giâm cành Hiện nay, giâm cành chè là một phương pháp nhân giống phổ biến trên thế giới Giâm cành chè được nghiên cứu ở Trung Quốc từ năm 1900, Ấn Độ 1911, Gruzia năm 1928, Srilanka năm 1938. Ở nước ta, miền Bắc bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng năm 1962, miền Nam năm 1952 (Đỗ Ngọc Quỹ và ctv, 1997). Ưu điểm: – Có hệ số nhân giống rất cao, có thể cung cấp đồng thời một số lượng giống lớn, tránh được khó khăn thiếu giống khi trồng mới. Một hecta chè để giống đem giâm cành có thể trồng được 30 – 70 hecta (Lê Tất Khương và ctv. 1999). Số liệu từ Viện nghiên cứu chè Phú Hộ cho thấy từ một hecta vườn chè giống bốn tuổi có thể cung cấp được khoảng ba triệu hom, đủ cây cho trồng mới 50 hecta nếu trồng hai cây/hố, hoặc 80 hecta nếu trồng một cây/hố. – Tạo được vườn chè đồng đều với những đặc tính tốt của cây mẹ, rất thuận lợi cho đầu tư và thâm canh, cơ giới hóa, cho năng suất cao, nguyên liệu đồng đều giúp chế biến được chè có chất lượng tốt và ổn định. – Rút ngắn được thời gian kiến thiết cơ bản. Thời gian cho thu hái nhanh khoảng hai đến ba năm (Viện nghiên cứu chè, 2000). Nhược điểm: – Phải qua giai đoạn vườn ươm. – Đòi hỏi phải có kỹ thuật trong các khâu giâm cành, chăm sóc, quản lý vườn ươm tỉ mỉ, tốn nhiều công lao động. – Khối lượng vận chuyển cây con ra trồng ngoài đồng lớn. – Giá thành cây con cao, làm tăng đáng kể chi phí trồng mới, chi phí cao hơn trồng hạt từ sáu đến tám lần (Viện nghiên cứu chè, 2000). – Trong thời gian kiến thiết cơ bản, khả năng chịu hạn của cây con kém. 6.5 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô Hiện nay, nhân giống chè bằng phương pháp nuôi cây mô là một hướng nghiên cứu rất mới. Theo Willson và Clifford (1992), những tiến bộ gần đây trong nghiên cứu tế bào và nuôi cấy mô mở ra cơ hội cho không chỉ việc nhân nhanh chóng vật liệu nhân giống, và cả cho việc sử dụng các quy luật di truyền, sinh lý học và sinh hóa học vào việc phát triển các dòng chè đặc trưng. Đối với các nước trồng chè nổi tiếng trên thế giới hiện nay như: Ấn Độ, Trung CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 10 Quốc, Nhật Bản, Kenya, Đài Loan…đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trên chè thu được một số thành tựu bước đầu trong việc chuẩn hóa quy trình nuôi cấy, môi trường nuôi cấy mô chè. Ưu điểm: – Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ. Phần này giống như nhân giống vô tính. Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống qua hạt. – So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn. – Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh. Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất. Việc trao đổi giống được dễ dàng. – Phục tráng giống. Nhược điểm: – Đòi hỏi kỹ thuật cao. – Chi phí cao. 6.6 Nhân giống bằng phương pháp giâm cành in vitro Đây là phương pháp nhân giống dựa trên sự kế thừa của phương pháp giâm cành truyền thống và nuôi cấy mô. Bằng cách sử dụng một hom chè mang một mầm nách qua khử trùng được giâm trong môi trường dinh dưỡng có chứa chất kích thích sinh trưởng. Hom chè sẽ được kích thích cho tăng trưởng tạo rễ và tạo chồi trực tiếp từ hom chè, không qua giai đoạn tạo cụm chồi và cấy chuyền. Từ một hom chè ban đầu qua giâm cành tạo thành một cây con phát triển hoàn chỉnh rễ thân lá, rồi tiến hành trồng ra đất. Ưu điểm – Làm cho cây con thuần nhất và sinh trưởng tốt, cây được làm trẻ lại và ít nhiễm bệnh. – Giữ nguyên đặc tính của cây mẹ, có ý nghĩa trong công tác phục tráng giống và nhân giống chè. – Hệ số nhân giống cao. – Có thể tiến hành nhân giống quanh năm, rút ngắn thời gian nhân giống. – Tuổi chung của cây chè tạo ra từ giâm cành in vitro nhỏ hơn tuổi chung của cây chè được tạo ra từ giâm cành truyền thống. Nhược điểm – Chi phí tốn kém. – Kỹ thuật giâm cành chè in vitro hiện nay đang ở giai đoạn thử nghiệm trong phòng thí nghiệm. – Chưa tìm ra chất khử trùng và thời gian khử trùng thích hợp cho hom chè được lấy trực tiếp từ đồng ruộng. – Trong chè hàm lượng tanin cao, gây khó khăn lớn trong việc khử trùng mẫu, và sự hóa nâu của môi trường do tanin trong mẫu tiết ra làm hóa nâu môi trường làm hom chè dễ bị chết hoại. 2.7 Cơ sở của giâm cành chè 7.1 Cơ sở hình thành callus và rễ [...]... 4.1: Hom chè sau khử trùng A: Hom chè chết hoại, mơi trường hóa nâu B: Hom chè thối mầm nách C: Hom chè nhiễm khuẩn D: Hom chè chết hoại thân có màu xanh E: Hom chè nhiễm nấm F: Hom chè chết hoại G: Hom chè sạch 1.2.Hom chè khơng phát động mầm 20 CƠNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Hình 4.2 Hom chè khơng phát động mầm A: Hom chè sau 15 ngày D: Hom chè sau 60 ngày B: Hom chè sau 30 ngày E: Hom chè sau... Hom chè sau 45 ngày F: Hom chè sau 90 ngày 1.3.Hom chè tái sinh chồi 21 CƠNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Hình 4.5 Hom chè tái sinh chồi A: Hom chè sau 15 ngày D: Hom chè sau 60 ngày B: Hom chè sau 30 ngày E: Hom chè sau 75 ngày C: Hom chè sau 45 ngày F: Hom chè sau 90 ngày 2 Xác định phương pháp, chất khử trùng mẫu, thời gian khử trùng mẫu Khử trùng mẫu trong giâm cành chè in vitro để tạo hom chè. .. mẫu: Mẫu chè giâm xong được chuyển qua phòng bảo quản ở nhiệt 23 – 27 0C, chu kì chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 16 h Mơi trường giâm cành được chuẩn bị trước trong chai nước biển 100 ml, 200 ml, 500 ml dùng để chứa mơi trường IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1 Hình ảnh q trình ni cấy hom chè 1.1.Hom chè sau khử trùng 18 CƠNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 19 CƠNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO... trong chè bằng lòng trắng trứng đã thu được những dấu hiệu khả quan về biện pháp khử tanin, thời gian khử tốt là 120 phút và thu được từ 30 - 40% mơ sẹo Từ những cơ sở lý luận trên làm cở sở cho thí nghiệm thử nghiệm quy trình giâm cành chè in vitro III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Vật liệu thí nghiệm 15 CƠNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 1.1 Đối tượng thí nghiệm Hom chè (VD ở nước ta hom chè. .. etylaxetat,thu được polyphenol Hàm lượng chất khơ của chè xanh Việt nam: Mẫu chè 1 2 3 4 Mẫu tươi (g) Mẫu khơ (g) Hàm lượng chất khơ(%) Lá chè non Lá chè bánh tẻ Lá chè già Hỗn hợp Trung bình stt 700 210 100 480 139,9 45,5 24,9 104 18,84 21,66 24,9 21,66 21,76 Kết quả tách chiết cafein bằng clorofom: stt Mẫu lá chè 1 2 Lá chè bánh tẻ Lá chè già Lượng lá chè khơ (g) 50 150 Lượng clorofom(ml) Cafein (g) 130... tiếp xúc giữa hom chè và chất khử trùng tốt hơn Việc khử trùng mẫu chè cho tới hiện nay vẫn chưa tìm ra phương thức khử trùng mẫu thích hợp, chất khử trùng và thời gian khử mẫu thích hợp 3 Kết luận Cho đến nay các Thí nghiệm Giâm cành chè in vitro” qua q trình tiến hành tuy vẫn chưa thu được kết quả như mục tiêu đề ra nhưng bước đầu đã thu được cây chè sống bằng phương pháp giâm cành in vitro Qua... tuổi cây Vì vậy cho nên chọn hom chè ở lá thật thứ hai tính từ lá tơm để làm vật liệu tiến hành giâm cành Từ đoạn cành chè non gồm một tơm và ba lá thật Dùng kéo cắt bỏ lá để lại cuống lá, lấy đoạn hom ở vị trí lá thật thứ hai, và để chừa lại một đốt phía trên và một đốt phía dưới, hom có chiều dài từ 4 - 6 cm Hình 3.1 Hom chè sau bước 1 Bước 2: Xử lý hom chè: Hom chè được rửa sạch dưới vòi nước,... thương cho mẫu Dùng ngón tay chèn vòi nước cho dòng chảy thành tia, và xịt vào mẫu để rửa trơi các bào tử và nấm bám trên mẫu Sau đó để dưới vòi nước chảy tràn nhẹ trong 3 – 5 phút 17 CƠNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Hình 3.2 Hình ảnh hom chè trong khử trùng mẫu A: có lắc B: khơng lắc Hom chè được đựng trong bình tam giác 350 ml đã được hấp vơ trùng, đem vào phòng giâm vơ trùng tiến hành khử... mẫu đã hồn tất Bước 3: Tiến hành giâm cành: Dùng giấy thấm đã được hấp vơ trùng thấm cho khơ những hom mẫu, dùng dao sắc cắt hai đầu hom còn khoảng 1 – 2 cm và cuống còn 0,2 – 0,3 cm tránh làm hư hại đến mầm Sau đó tiến hành cắm vào mơi trường, mỗi chai nước biển cắm 1 hom Thao tác giâm cành phải nhanh để hạn chế sự tiếp xúc của hom chè với khơng khí làm đen hom chè, được tiến hành trong điều kiện... hành thí nghiệm giâm cành chè in vitro trong các giai đoạn tiếp theo Bước đầu đã thu được một số kết quả thí nghiệm như sau: Về phương pháp khử trùng: Chọn Javen làm chất khử trùng, với tỉ lệ 1:3 trong thời gian 6 phút và 1:5 trong thời gian 5 phút.Khử trùng kép và khơng lắc mẫu Về phương pháp khử tanin trong mẫu: Đối với việc khử tanin trong hom chè dùng trong thí nghiệm giâm cành in vitro bằng