Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn acetobacter

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter ” là do tôi thực hiện, không có sự t



PHẠM VĂN HOẠT

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO MÀNG BC CỦA CHỦNG VI KHUẨN

LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn

PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung và các thầy cô trong phòng Vi Sinh

khoa Sinh - KTNN đã tận tình giúp đỡ em trong thời gian qua Em xin

chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh – KTNN đã

tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài Cảm ơn tất cả các bạn sinh viên đã

giúp đỡ tôi để hoàn thành khóa luận một cách tốt đẹp

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2011

Sinh viên

Phạm Văn Hoạt

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường

tới quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter ” là do

tôi thực hiện, không có sự trùng lặp với các tác giả khác

Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2011

Sinh viên

Phạm Văn Hoạt

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Bản cam đoan

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt, bảng, hình vẽ

TÓM TẮT CÔNG TRÌNH

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung của đề tài 2

4 Ý nghĩa của đề tài 2

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lược sử nghiên cứu 3

1.2 Phân loại Acetobacter 4

1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter 4

1.2.2 Phân loại vi khuẩn Acetobacter 5

1.3 Đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter 7

1.3.1 Đặc điểm hình thái 7

1.3.2 Đặc điểm khuẩn lạc 8

1.3.3 Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng 9

1.3.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacte 9

1.3.5 Con đường chuyển hoá cacbon 9

1.4 Vị trí phân loại và đặc điểm của Acetobacter xylinum 10

1.4.1 Vị trí phân loại Acetobacter xylinum 10

1.4.2 Đặc điểm của Acetobacter xylinum 10

1.4.3 Màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum 11

1.4.4 Cơ chế tổng hợp màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum 12

1.5 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum 13

1.5.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới 13

1.5.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam 14

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và thiết bị 16

2.1.1 Vi sinh vật 16

2.1.2 Hoá chất và thiết bị 16

2.1.2.1 Hoá chất 16

2.1.2.2 Thiết bị ……… 16

2.1.3 Môi trường 17

2.1.3.1 Môi trường phân lập giống (MT1) 17

2.1.3.2 Môi trường nhân giống cơ bản (MT2) 17

2.1.3.3 Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp vi sinh 18

2.2.1.1 Phân lập chủng Acetobacter theo phương pháp truyền thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck 18

2.2.1.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép 19

2.2.1.3 Tuyển chọn các chủng Acetobacter cho màng theo phương pháp Graxinop 19

2.2.1.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng mỏng 20

2.2.1.5 Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường

thạch nghiêng 20

2.2.1.6 Phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng 21

2.2.3 Các phương pháp hoá sinh 21

2.2.3.1 Phát hiện hoạt tính catalase 21

2.2.3.2 Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic .21

2.2.3.3 Phương pháp phát hiện khả năng tổng hợp cellulose 21

2.2.3.4 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid acetic bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị màu 22

2.2.4 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng Acetobacter 24

3.1.1 Hình thái và tế bào học của chủng vi khuẩn Acetobacter 24

3.1.2 Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa 25

3.1.3 Sinh trưởng trên môi trường lỏng 25

3.1.4 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Acetobacter 26

3.1.4.1 Hoạt tính catalase 26

3.1.4.2 Khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic 26

3.1.4.3 Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose 27

3.2 Sự thay đổi của màng BC qua thời gian nuôi cấy 28

3.3 Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC 29

3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng BC 31

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

PHỤ LỤC 37

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum

Hình 1.2 Con đường chuyển hoá cacbon trong Acetobacter xylinum

Hình 2.3 Acetobacter trên môi trường thạch nghiêng

Hình 3.4 Kết quả nhuộm Gram của Actobacter

Hình 3.5 Acetobacter trên môi trường thạch đĩa

Hình 3.6 Acetobacter trên môi trường lỏng

Hình 3.7 Hoạt tính catalase của chủng Acetobacter

Hình 3.8 Khả năng oxy hóa acetat của vi khuẩn Acetobacter

Hình 3.9 Kết quả nhuộm màng BC

Hình 3.10 Màng BC sau 4 ngày nuôi cấy

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi khối lượng màng BC qua thời

gian nuôi cấy

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến sự hình thành

màng BC

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng BC

Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành

màng BC

Hình 3.16a Kết quả thí nghiệm lần 1 ảnh hưởng của pH đến sự hình

thành màng BC (môi trường nước máy)

Hình 3.16b Kết quả thí nghiệm lần 2 ảnh hưởng của pH đến sự hình

thành màng BC (môi trường nước máy)

Hình 3.16c Kết quả thí nghiệm lần 3 ảnh hưởng của pH đến sự hình

thành màng BC (môi trường nước máy)

Hình 3.17 Kết quả thí nghiệm lần 4 ảnh hưởng của pH đến sự hình thành

màng BC (môi trường nước dừa)

Hình 3.18a Kết quả thí nghiệm lần 1 ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình

thành màng BC trong môi trường nước máy

Hình 3.18b Kết quả thí nghiệm lần 3 ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự

hình thành màng BC trong môi trường nước máy

Hình 3.19 Kết quả thí nghiệm lần 2 ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình

thành màng BC môi trường nước dừa

Hình 3 20 Màng BC do chủng Acetobacter xylinum tạo ra

ở pH =5 và t0C = 300C

TÓM TẮT CÔNG TRÌNH

Vi khuẩn Acetobacter là chủng có khả năng tạo màng BC trên môi

trường dịch thể trong điều kiện nuôi cấy tĩnh Màng BC được cấu tạo bởi

những chuỗi polymer 1,4 glucopyranose mạch thẳng, có cấu trúc hóa học và

đặc tính cơ học giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính

chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao,

tính đàn hồi lớn, khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất

lớn Vì vậy màng BC được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều lĩnh

vực công nghệ Trong công nghệ thực phẩm sử dụng vi khuẩn Acetobacter tạo

màng BC dày để sản xuất thạch dừa, màng để bảo quản thực phẩm Trong

công nghiệp giấy, màng BC được dùng để sản xuất giấy chất lượng cao, dùng

để làm màng lọc nước trong công nghệ môi trường, làm chất mang đặc biệt

cho các pin và tế bào năng lượng Trong lĩnh vực mỹ phẩm màng BC được

dùng làm mặt nạ dưỡng da Trong lĩnh vực y học, màng BC bước đầu được

nghiên cứu làm màng trị bỏng, da nhân tạo thay thế da tạm thời, mạch máu

nhân tạo Đặc biệt, hiện nay nhu cầu về màng trị bỏng rất cao nhưng đều phải

nhập ngoại với giá thành rất lớn

Công trình của chúng tôi tập trung nghiên cứu: Ảnh hưởng của điều kiện

môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, độ pH) đến khả năng tạo màng BC của chủng

vi khuẩn A.xylinum với mục đích tìm ra nhiệt độ, độ pH thích hợp cho sự tạo

màng Nội dung của chúng tôi gồm:

Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng A.xylinum; nghiên cứu

ảnh hưởng của nhiệt độ, độ pH ban đầu tới sự tạo màng BC của chủng

A.xylinum Công trình cho phép lựa chọn điều kiện môi trường nuôi cấy thích

hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum tạo màng BC có chất lượng tốt nhất

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Như chúng ta đã biết thế kỷ XX là thế kỷ của ngành công nghệ thông

tin thì thế kỷ XXI là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học Ngày nay công

nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật chủ đạo và chiếm giữ

một vị chí cao của nhiều quốc gia trên thế giới Là một bộ phận của ngành

CNSH, công nghệ Vi sinh đã và đang phát triển mạnh mẽ với những thành

tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành: công nghiệp, nông

nghiệp, y học Khó có thể tìm ra một lĩnh vực nào của công nghệ sinh học

mà lại không liên quan tới vi sinh vật

Cho đến nay Acetobacter được đánh giá là loại vi khuẩn có khả năng

sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên Vi khuẩn Acetobacter thuộc

nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng thuộc họ

Acetobacteriaceae Vi khuẩn Acetobacter tìm thấy trong giấm, dịch rượu,

nước ép hoa quả Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên môi trường dịch lỏng, chúng

sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng BC, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn

liên kết với phân tử cellulose Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi

polymer--1,4 glucopyranose không phân nhánh được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn

khi nuôi cấy chúng trên môi trường dịch lỏng

Màng BC do Acetobacter tạo ra có cấu trúc hóa học và đặc tính cơ học

giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính chất hóa lý đặc

biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn,

khả năng thấm hút nước nhanh, khả năng polymer hóa rất lớn Vì vậy màng

BC được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ

Một trong các ứng dụng đã và đang được quan tâm hiện nay là sản xuất màng

BC điều trị bỏng và tổn thương da [7]

Nhằm bổ sung hiểu biết về Acetobacter và màng BC tạo cơ sở cho sản

xuất màng trị bỏng, chúng tôi quyết định chọn đề tài:

“Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới quá trình lên men

tạo màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter ”

2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến khả năng

tạo màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum

3 Nội dung của đề tài

3.1 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn A xylinum

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự tạo màng BC của chủng

A.xylinum

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH ban đầu tới sự tạo màng BC của

chủng vi khuẩn A.xylinum

4 Ý nghĩa của đề tài

Tìm ra một số đặc điểm của chủng vi khuẩn A.xylinum Từ đó chọn điều

kiện môi trường (pH, nhiệt độ) nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn

A.xylinum tạo màng BC có chất lượng tốt nhất

NỘI DUNG

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Lược sử nghiên cứu

Giấm là sản phẩm rất quen thuộc đối với mỗi chúng ta, nó xuất hiện

khoảng từ những năm 1000 trước công nguyên, người xưa dùng nó làm nước

uống jessus, và được biết đến nhờ hiện tượng lên men hỏng của rượu vang

Chính vì vậy giấm có tên là “Vinegar”, bắt nguồn từ tiếng Pháp: “Vine” là

rượu vang và “aigre” là chua Khi đó, người ta chưa biết vi khuẩn Acetobacter

chính là tác nhân của quá trình lên men này

Giấm mới chỉ bắt đầu được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỉ XIX

Person là người đầu tiên nghiên cứu về giấm và vi khuẩn Acetobacter 1822,

ông đã quan sát lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt giấm và chứng minh sự

có mặt của một loại vi sinh vật, ông gọi chúng là Mycoderma aceti

Năm 1837, Kiitzing từ những thí nghiệm của mình đã đưa ra kết luận: quá

trình lên men giấm được thực hiện khi có sự tham gia của vi khuẩn Cùng năm

đó, nhà bác học nổi tiếng người Đan Mạch là Hansen đã tách được từ màng

giấm 2 loại vi khuẩn thuần khiết ông gọi đó là: Mycoderma aceti và

Mycoderma pasteurianum

Nhờ có sự xuất hiện của kính hiển vi, 1862 đến 1868, Pasteur nhờ sự trợ

giúp của kính hiển vi đã chứng minh nhận của Kiitzing và Pasteur là hoàn toàn

đúng đắn Ông nghiên cứu lớp màng xuất hiện trên bia và rượu vang, ông kết

luận: Màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn và ông cũng gọi nó là

Mycoderma aceti

Từ đó đến nay, nhiều nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu về

Acetobacter Các nghiên cứu chủ yếu nhằm mục đích cải tiến và hoàn thiện

hơn quá trình lên men giấm, phân loại Acetobacter thành các nhóm, các loài

dựa trên những đặc tính sinh lý, sinh hoá và các ứng dụng của chúng

1.2 Phân loại Acetobacter

1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter

Để phân loại Acetobacter, các nhà nghiên cứu dựa vào một số tiêu chuẩn:

- Địa điểm phân lập: có liên quan đến điều kiện sống

- Đặc điểm nuôi cấy: đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch (hình thái,

tính chất, màu sắc…); khi nuôi cấy trên môi trường lỏng chú ý sự biến đổi

của môi trường sau thời gian nuôi cấy (môi trường đục hay trong, mùi thơm

dễ chịu hay không mùi, màu sắc môi trường…)

- Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả năng di

động, có hay không có tiên mao, vỏ nhầy, màu sắc khi nhuộm Gram

- Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với các yếu tố: nhiệt độ, độ pH của môi

trường, khả năng hình thành sắc tố, mối quan hệ với oxy, khả năng lên men

acetic, khả năng sử dụng chất vô cơ và hữu cơ,…

- Đặc điểm sinh hoá (theo Frateur, 1950):

+ Khả năng tạo catalase

+ Khả năng tổng hợp các xeto từ các rượu bậc cao như : glixerol,

manitol, sorbitol

+ Khả năng oxy hoá acetat thành CO2 và H2O

+ Khả năng oxy hoá glucose thành acid gluconic

+ Khả năng sử dụng muối amôn làm nguồn nitơ duy nhất, khả năng sử

dụng rượu etylic làm nguồn cacbon

+ Khả năng sinh sắc tố nâu

+ Khả năng tổng hợp cellulose

- Ngoài ra, ngày nay khi định loại Acetobacter, người ta còn sử dụng sinh

học phân tử để giải trình tự rARN16S

1.2.2 Phân loại vi khuẩn Acetobacter

Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter được tiến hành ngay từ

thế kỷ XIX Trong đó có một số khoá phân loại đáng chú ý như sau: khoá

phân loại của Beijerinck năm 1899, ông đã tiến hành phân lập vi khuẩn acetic

thuần khiết và chia chúng thành 4 nhóm cơ bản Năm 1916, Janke đã tiếp theo

công trình nghiên cứu của Beijerinck Ông đã phân loại dựa trên 2 dấu hiệu:

Một là: Sử dụng muối amoni làm nguồn cung cấp nitơ trong quá trình sinh

trưởng và phát triển

Hai là: Không có hoặc có khả năng di động trong quá trình phát triển

Năm 1926, Henneberg dựa vào nơi sống mà chia vi khuẩn acetic làm

4 nhóm sau:

+ Nhóm 1: Vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa hublon độc với

chúng

+ Nhóm 2: Vi khuẩn có khả năng phát triển trên bia

+ Nhóm 3: Vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang, oxy hoá rượu

thành giấm, thường dùng trong sản xuất giấm theo phương pháp chậm

+ Nhóm 4: Vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh

Năm 1934, các nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ dựa vào khả năng sử dụng các

hợp chất tương đối đơn giản của cacbon và nitơ, đã xếp vi khuẩn acetic vào

họ Nitrobacteriaceae Từ đó, vi khuẩn acetic có tên là Acetobacter

Năm 1936, Kenyver, Wanneil và Staniel nghiên cứu khả năng di động

của chúng thấy có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động nên xếp chúng

vào họ Pseudomonadaceae

Năm 1948, Vanghn đã nghiên cứu khả năng di động của một số loài

Acetobacter: Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter

zancens, Acetobacter melanogenus, Acetobacter oxydans và thấy chúng đều

có đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn acetic trong họ

Pseudomonadaceae Cùng năm 1948, Krassilnicov cùng một số tác giả người

Mỹ đã thống nhất xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ vi khuẩn

Pseudomonadaceae

Năm 1914, Bergey đã phân các loài trong giống Acetobacter thành 2

nhóm:

- Nhóm 1: Có khả năng oxy hoá acetic thành CO2 và H2O, gồm các nhóm:

+ Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (sinh trưởng trên môi

trường Hoyer) như: Acetobacter aceti

+ Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất:

* Trên môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy chứa cellulose như:

Acetobacter xylinum

* Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo thành màng nhầy có chứa

cellulose như: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus,

Acetobacter kneizigianus

- Nhóm 2: Không có khả năng oxy hoá acid acetic

+ Tạo thành sắc tố trên môi trường glucose

* Sắc tố nâu tối tới đen nhạt như: Acetobacter melanogenus

* Sắc tố hồng như: Acetobacter resens

+ Không tạo thành sắc tố:

* Nhiệt độ thích hợp nhất từ 300C đến 350C : Acetobacter suboxydans

* Nhiệt độ thích hợp nhất từ 180C đến 210C : Acetobacter oxydans

Năm 1950, Frateur chính thức đưa ra một khoá phân loại mới dựa trên

các tiêu chuẩn cụ thể như:

- Khả năng tạo catalase

- Khả năng tổng họp các chất xeto từ rượu bậc cao như: glycerol, manitol,

sorbitol

- Khả năng oxy hoá acid acetic thành CO2 và H2O

- Khả năng oxy hoá glucose thành gluconic

- Khả năng sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ và rượu làm nguồn

cacbon (Sinh trưởng trên môi trường Hoyer)

- Tạo sắc tố nâu

- Tổng hợp cellulose

Trên cơ sở đó, Frateur chia vi khuẩn acetic thành các nhóm theo bảng sau:

Bảng 1.1 Phân loại các nhóm vi khuẩn acetic theo Frateur (1950)

1 Suboxydans Acetobacter suboxydans

Có đầy đủ các đặc điểm trên

3 Oxydans Acetobacter ascendans

Acetobacter ransens Acetobacter lovaniens

Không có khả năng tạo ra các hợp chất xeto từ rượu bậc cao

4 Peroxydans Acetobacter peroxydans

Actebacter paradonum

Không có hoạt tính catalase, không oxy hoá glucose thành acid gluconic

1.3 Đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter

1.3.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men acid acetic

Đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại học có thể xếp chúng vào 2 giống:

vi khuẩn Acetobacter có chu mao hoặc không có chu mao và Gluconobacter

đơn bào

Theo Bergey, 1989 và Larpent et al, 1990, Acetobacter và Gluconobacter

là hai giống vi khuẩn quan trọng nhất trong họ Acetobacteriaceae Hai giống

này gặp thấy nhiều trong tự nhiên, trên bề mặt lá cây, hoa quả và đều có khả

năng tạo acid từ rượu Nhưng Gluconobacter không có chu trình tricacboxylic

(ATC) nên không có quá trình oxy hoá acetat thay vào đó có một số chu trình

khác như: chu trình Glyoxylat, quá trình photphoril hoá, còn Acetobacter lại

không xảy ra các quá trình trên

Đem so sánh 2 vi khuẩn trên với những vi khuẩn thuộc giống

Pseudomonas thấy có nhiều nét tương đồng Tuy nhiên chúng khác

Pseudomonas ở những điểm sau: khả năng chịu độ acid cao hơn, khả năng

chuyển hoá pepton yếu hơn, không sinh sắc tố, ít di động hơn Một số loài vi

khuẩn acetic khi sống trên môi trường nghèo chất dinh dưỡng hoặc thời

gian nuôi cấy lâu thì tế bào dễ bị biến đổi hình thái( kéo dài hoặc phình to

hay phân nhánh)

Tế bào vi khuẩn acetic có hình que hoặc hình elip, đứng độc lập hay xếp

thành chuỗi, kích thước 0,6 – 0,8 µm, có thể có tiên mao và có khả năng di

động, sống hiếu khí bắt buộc, hóa dưỡng hữu cơ, nhuộm màu Gram âm, không

sinh bào tử

Vi khuẩn Acetobacter thích hợp pH = 4,5 – 6,2 và nhiệt độ 25 – 35oC, có

khả năng oxy hoá rượu etylic thành acid acetic và có quá trình oxy hoá hoàn

toàn các chất hữu cơ tạo các hợp chất xeton hay acid hữu cơ tương ứng

1.3.2 Đặc điểm khuẩn lạc

Trên môi trường đặc (thạch đĩa), Acetobacter phát triển thành các khuẩn

lạc tròn, đều, đường kính trung bình là 3mm Thường có 3 dạng:

Một số loài như Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti có khuẩn lạc nhỏ

(đường kính ≈ 1mm), bề mặt trơn bóng, ở giữa khuẩn lạc dày và đậm màu hơn

các phần xung quanh

Một số khác lớn hơn (đường kính khoảng 4 – 5 mm), bề mặt trơn nhẵn,

không màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, có thể tách ra khỏi môi trường dễ

dàng Một loại khác ăn sâu vào môi trường, khó tách ra bằng que cấy

1.3.3 Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng

Trên môi trường lỏng, vi khuẩn Acetobacter tạo thành các loại màng BC

có độ dày mỏng, và đặc tính khác nhau

Một số loài tạo thành màng dày như sứa, nhẵn, khi lắc chìm xuống đáy

bình và hình thành lớp màng mới

Một số loài tạo thành màng mỏng như tờ giấy cellofan, dai, nhẵn, khi lắc

cũng chìm xuống đáy bình, dịch nuôi cấy trong, có mùi thơm dễ chịu Khi

nghiên cứu màng này thấy có nhiều sợi cellulose đan kết với nhau tạo nên độ

dẻo dai, đàn hồi và độ chắc khỏe, màng có chứa nhiều vi khuẩn Acetobacter

Một số khác tạo thành những loại màng mỏng, dễ vỡ, nhăn nheo, bám

theo thành bình, dịch nuôi cấy đục có màu vàng nâu, không trong, có mùi

không dễ chịu

1.3.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter

Vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với nguồn cacbon, nguồn nitơ và các chất

sinh trưởng hết sức đa dạng Chúng có thể đồng hoá nhiều loại thức ăn cacbon

khác nhau như: các loại đường (monosaccharide, disaccharide,

polysaccharitde), rượu etylic, acid hữu cơ nhưng không sử dụng được tinh bột

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi khuẩn acetic cần cung cấp

một số acid amin như: valin, alanin, prolin, ioslysine Một số chất kích thích

sinh trưởng như: acid nicotic, acid folic, biotin

Một số vi khuẩn acetic có khả năng tổng hợp polysaccharide phân tử lớn

như: cellulose, tinh bột, dextran,…Người ta ứng dụng đặc tính này trong sản

xuất công nghiệp Một số loài tổng hợp được những sợi cellulose như bông:

Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti, Acetobacter kiitzingianum

1.3.5 Con đường chuyển hoá cacbon

Qua sự nghiên cứu về khả năng chuyển hoá cacbon các tác giả đã đi đến

kết luận: Vi khuẩn acetic có khả năng oxy hoá gluxit theo các hướng sau:

Hướng 1: Chuyển hoá gluxit theo con đường hexosemono phosphate

(HMP) hoặc pentose nhờ sự oxy hoá các cơ chất đã được photphoril hoá

Hướng 2: Theo con đường Entner – Doudoroff (ED) - chỉ gặp trong loài

có khả năng tổng hợp cellulose

Hướng 3: Theo chu trình Kreps (ATC) hoặc glyoxylat

Hướng 4: Sinh trưởng trên môi trường chứa glycerol

Hướng 5: Không có sự photphoril hoá cơ chất do thiếu enzym

phosphofructokinase do đó không tồn tại con đường glycolysis

1.4 Vị trí phân loại và đặc điểm của Acetobacter xylinum

1.4.1 Vị trí phân loại Acetobacter xylinum

Theo hệ thống phân loại của Bergey,(1992) Acetobacter xylinum thuộc

giống Acetobacter,họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales,

lớp Schizommycetes Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, một số

tác giả coi Acetobacter xylinum như một loài phụ của Acetobacter acetic [11]

1.4.2 Đặc điểm của Acetobacter xylinum

Vi khuẩn Acetobacter xylinum là trực khuẩn hình que, kích thước khoảng

2m, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, có khả năng di động Các tế bào

được bao bọc bởi màng nhầy có bản chất là cellulose Chúng tích luỹ khoảng

4,5% acid trong môi trường, khi nồng độ acid acetic vượt quá giới hạn cho

phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn

Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum

Vi khuẩn Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí

bắt buộc, không sinh bào tử Thường sống trong giấm, rượu nhạt, nước ép hoa

quả, bề mặt hoa quả, và có cả ở trong đất Theo Bergey, 1992, nhiệt độ thích

hợp cho vi khuẩn Acetobacter xylinum là 250C – 350C, pH tối ưu là 4,5 – 6,2 [11]

Đặc điểm khuẩn lạc: Trên môi trường đặc, vi khuẩn Acetobacter xylinum

hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hoặc gợn

sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên, dễ tách

khỏi môi trường [5]

1.4.3 Màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum

Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn

Acetobacter xylinum hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose,

được tập hợp bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng

Bacterial cellulose hay màng BC

* Cấu trúc của màng Bacterial cellulose:

Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch

thẳng Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu

trúc và đặc tính lại khác xa nhau

Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo

thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi

lớn hơn- sợi vĩ mô ( microfibril) ( Jonas and Farad, 1998), những sợi này kết

hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon Dải ribbon có chiều

dài trong khoảng từ 1-9nm Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ

liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực

vandesvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt

môi trường nuôi cấy [14]

Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết

tinh cao (khoảng 60%), độ polymer hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học

cao, khả năng hấp thụ nước lớn

Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn Acetobacter xylinum được

nghiên cứu đầu tiên bởi Brown năm 1886 Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau

của thế kỷ XX, những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng

như cấu trúc và đặc tính của cellulose

1.4.4 Cơ chế tổng hợp màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum

Bacterial cellulose là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa

cacbon trong vi khuẩn Acetobacter xylinum

Saxena và cs đã chứng minh vị trí tổng hợp cellulose ở tế bào

Acetobacter xylinum nằm giữa lớp màng lipopolysaccharide và lớp màng sinh

chất Vì enzym CS nằm trên màng sinh chất nên cellulose là sản phẩm ngoại bào

Alina Krystynowicz và cs đã chứng minh vai trò của 4 enzym (GK,

PGM, UGP, CS) tham gia xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Acetobacter

xylinum (hình 1.2), trong đó UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử khi nhuộm âm bản và đông lạnh cho

thấy mỗi tế bào có 46 điểm tổng hợp cellulose Khoảng cách giữa mỗi điểm là

12-15 nm, kích thước của mỗi điểm là 3,5nm Khi tế bào phân chia, các vị trí

tổng hợp cellulose được phân bố về 2 tế bào con Các chuỗi polyme β -1,4

glucopynanose từ mỗi vị trí sẽ liên kết với các chuỗi ở vị trí khác tạo dải

ribbon, tốc độ kéo dài sợi là 2 μm/ phút [2]

Hình 1.2 Con đường chuyển hoá cacbon trong Acetobacter xylinum

Quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter xylinum diễn ra đồng

thời với quá trình hình thành màng trên bề mặt môi trường dịch Lớp màng

này chính là hàng rào ngăn cản oxy và chỉ những tế bào tiếp xúc trực tiếp với

oxy mới có khả năng tổng hợp cellulose

1.5 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum

1.5.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới

Vi khuẩn Acetobacter xylinum và màng BC của chúng đã thu hút được sự

chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh

vực: trong công nghệ môi trường, các nhà khoa học dã dùng màng BC làm

màng phân tách để xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng

lượng (Brown 1989) [12], Jonas và Farad (1998) [14] đã dùng màng như một

chất đặc biệt để biến đổi độ nhớt, làm các sợi truyền quang, làm môi trường cơ

chất trong sinh học Đặc biệt trong công nghiệp dệt, Brown (1989) đã sử dụng

chúng để sản xuất vải đặc biệt có giá trị kình tế cao [12] Trong công nghiệp

giấy, màng BC được sử dụng để sản xuất giấy điện tử có chất lượng cao

Trong công nghiệp thực phẩm, nó được ứng dụng để sản xuất thạch dừa, một

món ăn được ưa chuộng ở Đông Nam Á

Ứng dụng nổi bật nhất của màng BC là trong lĩnh vực y học Nó được sử

dụng để chế tạo vật liệu composite đắp lên vết thương hở, điều trị bỏng, thay

thế da tạm thời, làm mặt nạ dưỡng da [10], làm mạch máu điều trị các bệnh

tim mạch Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng

trong phẫu thuật và nha khoa implants Năm 2005, Henrik Backdahl và cs đã

ghép thành công sợi cellulose trên động mạch cảnh của lợn thấy chúng sinh

sản và kéo dài khoảng 40m chỉ sau 2 tuần cấy ghép Họ đã đi đến kết luận có

sự tương đồng về cấu trúc giữa màng BC với collagen

1.5.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam

Trong điều trị bỏng, để giảm đau cho bệnh nhân, hạn chế mất dịch, máu

qua vết thương, hạn chế nhiễm khuẩn vết bỏng, kích thích biểu mô hoá ở

bỏng nông hay kích thích tạo mô hạt ở bỏng sâu người ta thường sử dụng các

loại vật liệu che phủ tạm thời Việc sử dụng các vật liệu che phủ tạm thời có

nguồn gốc từ da dị loại để che phủ vết thương phần mềm, vết bỏng đã được

sử dụng từ rất lâu Tuy nhiên, việc sử dụng những loại da này cũng mới chỉ

dừng lại ở cách sử dụng đơn giản, đó là da tươi Mặc dù da dị loại tươi có

những ưu điểm, đặc biệt là khả năng bám dính tốt, nhưng nó cũng có những

nhược điểm nhất định Hơn nữa, việc sử dụng lại ở thế bị động, bảo quản và

xử lý phức tạp, khó có thể sử dụng rộng rãi trên lâm sàng Vật liệu từ da đồng

loại là lý tưởng nhất cho việc che phủ vết thương, vết bỏng nhưng trong nhiều

trường hợp rất khan hiếm, không đủ đáp ứng được Chính vì vậy vật liệu che

phủ tạm thời từ các loại màng sinh học là lựa chọn số một, có vai trò rất quan

trọng trong điều trị bỏng Một trong các loại màng sinh học đã và đang được

quan tâm ngày nay là màng cellulose vi khuẩn

Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ vi khuẩn

A.xylinum ngày càng được quan tâm Có một số các nghiên cứu, công bố liên

quan đến A.xylinum sự hình thành BC và ứng dụng màng BC Các công trình

mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình tạo màng, đặc tính cấu trúc màng làm

cơ sở chế tạo màng trị bỏng [7], sản xuất thạch dừa Gần đây nhất là nghiên

cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn của

Nguyễn Thúy Hương và Phạm Thạch Hổ

Theo tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ Vi sinh – Ký sinh, Đại học

Y Dược, Thành phố Hồ Chí Minh cho biết nhóm nghiên cứu của ông chế tạo

thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên

men Nó có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên

nó có vai trò như màng sinh học có thể thay thế da tạm thời

Nghiên cứu về màng trị bỏng của tác giả như Huỳnh Thị Ngọc Lan,

nghiên cứu chế tạo màng trị bỏng từ Bacterial cellulose của A.xylinum và hoạt

chất tái sinh mô của dầu mù u Ngoài ra, có nghiên cứu về hiệu ứng làm lành

vết thương của hỗn hợp Chistosan tan trong nước – Bacterial cellulose – Nano

bạc của nhóm tác giả Nguyễn Thị Mỹ Lan, Huỳnh Thị Phương Linh, Lê Thị

Mỹ Phước và Nguyễn Quốc Hiển

Và tại phòng Vi sinh, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà

Nội 2, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs đang tiến

hành nghiên cứu quy trình sản xuất màng BC với chất lượng tốt và ứng dụng

vào trị bỏng bước đầu đã đạt được thành công