4. Ý nghĩa của đề tài
2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp
bào trên tiêu bản nhuộm kép
Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram [1]:
1. Tím gentian: 2 phút. 2. Rửa nước. 3. Dung dịch Lugol: 2 phút. 4. Rửa nước. 5. Cồn 950: 20 giây. 6. Rửa nước. 7. Dung dịch Fucshin: 2 phút. 8. Rửa nước.
9. Hong khô trên ngọn lửa đèn cồn.
Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Nếu tế bào vi khuẩn nhuộm màu hồng (Gram âm), đó chính là vi khuẩn Acetobacter.
2.2.1.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng theo
phương pháp Graxinop
Trước tiên, phải nhân giống các chủng vi khuẩn phân lập được bằng cách: Từ mỗi loại khuẩn lạc, dùng que vô trùng, gợt lấy khuẩn lạc vào các ống
nghiệm đã chứa sẵn môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3, đã khử trùng và để nguội), nuôi trong tủ ấm 3 – 4 ngày để hoạt hóa giống, từ các ống giống đó, ta nuôi vi khuẩn trên môi trường nhân giống cơ bản (môi trường MT2) trong các ống nghiệm, có thể nuôi lắc để thu sinh khối tế bào vi khuẩn.
Tiếp tục nuôi cấy các chủng Acetobacter trong môi trường dịch thể (MT3),
tuyển chọn các chủng cho màng tốt nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.1.4. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng mỏng màng mỏng
Quá trình tuyển chọn các chủng Acetobacter được tuyển chọn thông qua
các chỉ tiêu: quan sát quá trình hình thành màng (thời gian tạo màng, đặc điểm của dịch nuôi cấy…), kích thước và hình dạng tế bào khi nhuộm Gram, kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Acetobacter phân lập được, kiểm tra độ dày mỏng của màng, kiểm tra tính chịu lực của màng: độ dai chắc của màng bằng cảm quan.
2.2.1.5. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi phân lập và sơ bộ xác định là Acetobacter được
cấy trên môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3), nuôi trong tủ ấm
3 – 4 ngày ở 300C. Sau đó, giữ lạnh ở tủ 40C để bảo quản giống. Cấy truyền
giữ giống trên môi trường thạch nghiêng một tháng một lần.
2.2.1.6. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng
Nuôi cấy Acetobacter trên các loại môi trường lỏng đã được thanh trùng ở
1210C trong vòng 20 phút, thay đổi các yếu tố điều kiện môi trường ( nhiệt
độ, độ pH ban đầu). So sánh các kết quả thí nghiệm với nhau tìm ra điều kiện tối ưu nhất.
2.2.3. Các phương pháp hoá sinh 2.2.3.1. Phát hiện hoạt tính catalase 2.2.3.1. Phát hiện hoạt tính catalase
Nhỏ 1 giọt H2O2 3% lên khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (calatase+). Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính calatase (calatase-).
Ngoài ra, có thể nhỏ trực tiếp H2O2 3% lên sinh khối tế bào của chủng
nghiên cứu đã được tách từ dịch nuôi cấy bằng cách đem li tâm 6000 vòng/10phút, quan sát hiện tượng như trên.
2.2.3.2. Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic
Để thử khả năng oxy hoá acid acetic, sử dụng môi trường:
Cao nấm men: 10g Canxi acetat: 10g
Thạch agar: 20g Nước máy: 1000ml
pH : 7,0-7,2
Cho môi trường vào bình tam giác,rồi đem thanh trùng môi trường ở 121oC trong 20 phút, đổ thạch đĩa, để nguội, cấy vi khuẩn tuyển chọn mới được hoạt hoá (18-24 giờ) nuôi 3-4 ngày ở điều kiện thích hợp. Quan sát hiện tượng: Nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dương tính, ngược lại là âm tính.
2.2.3.3. Phương pháp phát hiện khả năng tổng hợp cellulose
Nuôi vi khuẩn trong môi trường thử khả năng tạo màng (MT3), nuôi tĩnh
khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên màng dung dịch lugol và
H2SO4 60%, nếu là cellulose thì màng sẽ chuyển sang màu xanh lam.
2.2.3.4. Phương pháp xác định khă năng tổng hợp acid acetic bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị
Cho vào cốc thủy tinh (loại 100 ml hoặc 200 ml) dịch lên men, thêm vào đó 1 – 2 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Chú ý chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hống nhạt. Sau đó tính số gam acid acetic trong 100 ml dung dịch lên men theo công thức:
Với : X : Số gam acid acetic trong 100 ml dung dịch lên men
V : Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 10 ml dung dịch lên men
K : Lượng acid acetic tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N (K = 0,006)
10 : Số ml dịch lên men đem chuẩn độ
2.2.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp sau: + Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình cộng các chỉ số acid tạo thành trong các lần thí nghiệm:
+ Sai số đại diện của trung bình cộng:
+ Hệ số biến thiên trung bình cộng:
Trong đó : là trung bình cộng các chỉ số acid tạo thành n là số lần thí nghiệm
±m là sai số đại diện của trung bình cộng lượng acid tạo thành
Cv là hệ số biến thiên trung bình cộng lượng acid tạo thành là trung bình bình phương các sai lệch
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng Acetobacter
Sau khi thu nhận chủng giống từ phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, chúng tôi tiến hành khảo sát một số đặc tính
sinh học của loài Acetobacter
3.1.1. Hình thái và tế bào học chủng vi khuẩn Acetobacter
Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học Labomed (Mỹ)
với độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy chủng Acetobacter là trực khuẩn Gram âm có dạng hình que hay hình elip, đứng độc lập hay xếp chuỗi tuỳ vào điều kiện nhiệt độ và pH, một số có dạng hình bán nguyệt (hình 3.4)
Hình 3.4. Kết quả nhuộm Gram của Actobacter
Kích thước tế bào 0,6 – 0,8 m, có thể có tiên mao và có khả năng di
động, sống hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng hữu cơ, không sinh bào tử [2]. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày. Kết quả này cùng phù hợp với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thúy Hương (2006) khi nghiên cứu về Acetobacter[6].
3.1.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Acetobacter hình thành khuẩn lạc
(hình 3.5)
Hình 3.5. Acetobacter trên môi trường thạch đĩa
Quan sát trên hình 3.5 ta thấy đường kính trung bình là 3mm nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường.
3.1.3. Sinh trưởng trên môi trường lỏng
Vi khuẩn Acetobacter nuôi cấy trong môi trường lỏng hình thành một lờp màng có màu trắng sáng, bề mặt màng nhẵn, có độ dai cao trên bề mặt nuôi cấy (hình 3.6)
Hình 3.6. Acetobacter trên môi trường lỏng
Vi khuẩn Acetobacter là những loài hiếu khí, khi sống trong môi trường lỏng
sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường
Acetobacter
glucose, kết hợp đường với một acid béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào. Tiền chất này tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzym có thể polymer hoá glucose thành cellulose và trên môi trường dịch thể chúng sẽ phát triển thành lớp màng độ dày, mỏng khác nhau tuỳ thuộc vào từng loài. Màng đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với cellulose.
3.1.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Acetobacter 3.1.4.1. Hoạt tính catalase 3.1.4.1. Hoạt tính catalase
Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tượng sủi bọt khí (hình 3.7). Chứng tỏ oxy được giải phóng ra, hay nói cách khác dưới tác dụng của enzym catalase phân giải H2O2 theo phương trình.
2 2 2 2
1 2
C a ta la se
H O H O O
Hình 3.7. Hoạt tính catalase của chủng Acetobacter
Kết quả này cũng phù hợp với ý kiến đưa ra của Walker và cs (1942)
đã chứng minh hoạt tính catalase ở vi khuẩn Acetobacter là loài có hoạt tính
catalase mạnh nhất [17].
3.1.4.2. Khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic
Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường có chứa CaCO3
điều đó cho thấy acid gluconic đã được tạo thành (Hình 3.8). Chúng tham gia
phản ứng với CaCO3 để chuyển môi trường từ màu trắng sang không màu.
Hình 3.8. Khả năng oxy hóa acetat của vi khuẩn Acetobacter
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Hai-Peng Cheng và cs (2002) khi xác định sự có mặt của acid gluconic trong tổng hợp cellulose, nó là sản phẩm oxy hoá glucose, được tích luỹ ở pha lag và là chất quan trọng trong quá trình tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter [13].
3.1.4.3. Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose
Nhỏ dung dịch Lugol và H2SO4 60% lên mặt lớp màng BC sẽ xuất hiện màu lam.
Hình 3.9. Kết quả nhuộm màng BC
Qua hình 3.9 chứng tỏ Acetobacter có khả năng hình thành màng
cellulose.
Dựa theo khoá phân loại của Bergey (1992) [11], các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn acetic của Frateur 1950, căn cứ váo các kết quả khảo sát các đặc
điểm sinh học của loài Acetobacter mà chúng tôi nhận từ phòng thí nghiệm
Vi sinh khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2 thì đó là loài Acetobacter
xylinum và có khả năng tạo màng sinh học BC sử dụng trong trị bỏng và
tổn thương da.
3.2. Sự thay đổi của màng BC qua thời gian nuôi cấy
Khi nuôi cấy Acetobacter xylinum trong môi trường lỏng đã được thanh
trùng ở 1210C trong vòng 20 phút, nhận thấy:
Trong ngày đầu, vi khuẩn làm quen với môi trường, tích luỹ chất dinh dưỡng và năng lượng cho các giai đoạn sinh trưởng tiếp theo. Lượng acid bắt đầu hình thành nhưng không nhiều làm cho pH môi trường giảm nhẹ.
Ngày thứ 2, màng BC bắt đầu được hình thành trên bề mặt môi trường, tăng dần và đạt khối lượng cực đại vào ngày thứ 4. Sau đó màng chìm xuống dần và khối lượng màng giảm dần do bị phân hủy.
Hình 3.10. Màng BC sau 4 ngày nuôi cấy
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 2 4 8 12 15 m(g)
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi khối lượng màng BC qua thời gian nuôi cấy
Qua thực nghiệm chúng tôi đi đến một số nhận xét sau:
Màng BC bắt đầu hình thành từ ngày thứ 2 và ổn định dần sau 4 ngày nuôi cấy. Môi trường giàu dinh dưỡng màng tiếp tục dày lên, khi môi trường nghèo dinh dưỡng nó chìm xuống và bị phân huỷ dần. Chình vì vậy chúng tôi chọn sau 4 ngày nuôi cấy sẽ thu màng (hình 3.11)
3.3. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC
Giá trị pH được đo bằng nồng độ các ion H+ và OH
có trong môi trường, độ pH ban đầu của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến tính chất sinh lý của tế bào nên ảnh hưởng đến khả năng hình thành màng
BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum.
Để xác định khoảng pH thích hợp cho tế bào sinh trưởng tạo màng BC, chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên các loại môi trường có giá trị pH khác nhau ở 30oC trong 4 ngày. Qua nhiều lần thi nghiệm kết quả thu được trình bày tại bảng 3.2 và hình 3.12
Ngày m(g)
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC STT pH Đặc điểm của màng BC X m δ(%) Cv(%) 1 3 Màng mỏng khoảng 1mm, khá dai 1,245 ± 0,01 0,02 1,61 2 4 Màng mỏng 2 – 4 mm, dai, bề mặt nhẵn 3,218 ± 0,02 0,03 0,93 3 5 Màng mỏng 2 – 4 mm, dai, bề mặt nhẵn 3,463± 0,02 0,03 0,87 4 6 Màng mỏng 2 – 4mm, dai, bề mặt nhẵn 3,203 ± 0,02 0,04 1,24 5 7 Màng không hình thành - - - 6 8 Màng không hình thành - - - Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC pH = 5
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 3 4 5 6 7 8 m(g)
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC
Từ kết quả trên cho thấy: Vi khuẩn Actobacter xylinum sinh trưởng tốt ở
pH = 4 – 6 và đạt giá trị cao nhất ở pH = 5. Giá trị này cũng tương ứng với giá trị pH trong môi trường nước dừa. Như vậy để hạn chế tối đa sự thay đổi nồng độ các ion trong môi trường nuôi cấy đồng thời sự tạo thành màng BC là tốt
nhất chúng tôi chọn độ pH = 5 để nuôi cấy chủng Acetobacter xylinum. Kết
quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Hestrin và Schramm(1954) xác định giá trị pH tối ưu là 5.
Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ đến sự tạo
màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum với độ pH = 5.
3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hình thành màng BC
Điều kiện thời tiết khí hậu Miền Bắc nước ta bốn mùa với sự thay đổi nhiệt độ rất rõ rệt. Nhiệt độ không những ảnh hưởng đến sự sinh trưởng mà còn quyết định đến khả năng hình thành màng BC của chủng A.xylinum. Trong quá trình nuôi cấy, nhiệt độ thấp vi khuẩn sinh trưởng chậm, thời gian nuôi
pH m(g)
cấy phải kéo dài làm giảm khả năng tổng hợp cellulose. Nhiệt độ quá cao sẽ dẫn dến hô hấp quá mạnh cũng ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose. Để xác định nhiệt độ tốt nhất cho quá trình lên men đồng thời có thể lợi dụng được sự thuận lợi của điều kiện khí hậu để khi sản xuất màng mang lại hiệu
quả kinh tế cao. chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum ở
pH = 5 trong tủ ấm với các loại môi trường, ở mức nhiệt độ khác nhau, thu hồi và xác định trọng lượng thô của màng BC sau 4 ngày nuôi cấy. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.15
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hình thành màng BC
STT Nhiệt độ (toC) Đặc điểm của màng BC X m δ (%) Cv (%) 1 20 Không hình thành màng, chỉ có sợi cellulose nhỏ, lơ lửng trong môi trường.
- - - 2 25 Màng mỏng(1 – 2mm), khá dai, bề mặt nhẵn 2,634 ± 0.02 0,05 1,90 3 30 Màng mỏng 2 – 3mm, dai, bề mặt nhẵn 3,474 ± 0,02 0,04 1,15 4 35 Màng mỏng 2 – 3mm, dai, bề mặt nhẵn 3,235 ± 0,02 0,04 1,23 5 40 Không hình thành màng - - - 6 45 Không hình thành màng - - -
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng BC
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 20 25 30 35 40 m(g)
Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng BC
Từ kết quả trên cho thấy chủng Acetobacter xylinum sinh trưởng và tổng
hợp cellulose thích hợp ở khoảng nhiệt độ 25 – 35oC. Khả năng hình thành
màng cellulose tốt nhất ở 30oC. Nhiệt độ trên 35oC ức chế hoạt động tổng hợp
cellulose. Như vậy nhiệt độ nuôi cấy để tạo màng tôt nhất và thời gian phù hợp nhất là ở 30oC.
Màng BC thu được từ quá trình lên men acetic với sự tham gia của vi khuẩn Acetobacter xylinum dùng theo mục đích chế tạo màng sinh học trị bỏng phải đảm bảo các yêu cầu sau: đủ mỏng, phải có độ dai, chắc, bề mặt trơn nhẵn, màu sắc sáng trong…
Quá trình nuôi cấy thu nhận màng BC phụ thuộc vào nhiều yếu tố tác động, việc nghiên cứu ảnh hưởng đến sinh tổng hợp màng BC sao cho thời gian tạo màng phù hợp để khi áp dụng rộng rãi ở quy mô công nghiệp sẽ đem lại lợi ích kinh tế cao.
T0C
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum là chủng cho màng BC đáp ứng yêu cầu màng sinh học sử dụng trong trị bỏng.
1.2. Sự hình thành màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum tốt