nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lây nhiễm vi rút npv spl (nucleo polyhedrosis virus spodoptera litura) trên tế bào sâu khoang (spodoptera litura )

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG 3.1 Số cá thể sâu khoang có biểu hiện nhiễm vi rút NPV đã thu thập 3.2 Số lượng mẫu sâu khoa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Nga

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, để hoàn thành luận văn này

tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Lê Văn Trịnh –

Giám đốc Trung tâm Đấu tranh sinh học và Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, luôn tận tình hướng dẫn và

truyền đạt cho tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình nghiên cứu

và viết luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Hữu Đức – Phó

Trưởng Khoa Công nghệ Sinh học, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Học Viện nông nghiệp Việt Nam đã luôn tận tình giúp đỡ tôi

trong quá trình hoàn thành luận văn

Để thực hiện được nghiên cứu này, tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ, tạo điều kiện của các bạn đồng nghiệp, các cán bộ và lãnh đạo Trung tâm Đấu tranh sinh học và Viện Bảo vệ thực vật

Với tình cảm sâu sắc, tôi xin cảm ơn sự ủng hộ và giúp đỡ của các Thầy, Cô giáo thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa Công

nghệ sinh học – Học Viện nông nghiệp Việt Nam trong quá trình thực hiện

luận văn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các Thầy, Cô giáo, các chuyên viên Ban quản

lý đào tạo – Học Viện nông nghiệp Việt Nam đã ủng hộ, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành các thủ tục cần thiết để bảo vệ thành công luận văn này

Hà Nội, năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Nga

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu 1 2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 3 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 CHƯƠNG I CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu 5 1.2 Những nghiên cứu ở nước ngoài 6 1.2.1 Vài nét về sâu khoang (Spodoptera litura) 6 1.2.2 Vi rút diệt côn trùng và vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus) 7 1.2.3 Kỹ thuật phân lập và làm thuần vi rút NPV trong phòng trừ sâu hại 16 1.2.4 Kỹ thuật bảo quản vi rút NPV 17 1.2.5 Kỹ thuật lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào sâu khoang 18 1.3 Những nghiên cứu trong nước 20 1.3.1 Nghiên cứu về thu thập và phân lập vi rút NPV 21 1.3.2 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học từ vi rút NPV 22 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng, phạm vi và dụng cụ, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 26

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

2.1.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 26

2.2.1 Nghiên cứu phân lập, làm thuần và chọn lọc tạo thực liệu vi rút

2.2.2 Đánh giá hiệu lực gây chết sâu non sâu khoang của các nguồn

2.2.3 Lây nhiễm nhân tạo vi rút NPV trên tế bào sâu khoang 28

2.3.1 Nghiên cứu phân lập, làm thuần và chọn lọc tạo thực liệu vi rút

2.3.2 Nghiên cứu lây nhiễm vi rút NPV sâu khoang trên tế bào sâu

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Nghiên cứu phân lập, làm thuần và chọn lọc tạo thực liệu vi rút

3.1.1 Thu thập sâu khoang nhiễm vi rút NPV ngoài đồng 373.1.2 Phân lập và chọn lọc nguồn thực liệu vi rút NPV có hoạt lực cao 383.1.3 Kiểm định nguồn vi rút NPV qua phân tích PCR và hiển vi điện tử 563.1.4 Hiệu lực gây chết sâu non sâu khoang của các nguồn NPV sâu

3.3 Lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào sâu khoang đã nhân nuôi 623.3.1 Xác định nồng độ tế bào thích hợp cho lây nhiễm 623.3.2 Xác định nồng độ vi rút thích hợp cho lây nhiễm 633.3.3 Xác định thời gian ủ lây nhiễm vi rút thích hợp 64

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

3.3.4 Xác định môi trường thích hợp cho lây nhiễm 653.3.5 Xác định nhiệt độ thích hợp cho lây nhiễm 673.3.6 Xác định pH môi trường thích hợp cho lây nhiễm 683.3.7 Kiểm định vi rút NPV được nhân trên tế bào 69

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

DANH MỤC BẢNG

3.1 Số cá thể sâu khoang có biểu hiện nhiễm vi rút NPV đã thu thập

3.2 Số lượng mẫu sâu khoang nhiễm vi rút NPV sau khi phân lập 39 3.3 Hiệu lực gây chết sâu khoang của các nguồn vi rút NPV 41 3.4 Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn

3.7 Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn

vi rút có tiềm năng từ NPV1 sau phân lập lần 2 45 3.8 Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của nguồnvi

rút có tiểm năng từ NPV2 sau phân lập lần 2 46 3.9 Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn

vi rút có tiềm năng từ NPV3 sau phân lập lần 2 47 3.10 Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

3.14 Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành của các nguồn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii

3.2 Thể vùi của các nguồn vi rút NPV sau 10 ngày xử lý 38 3.3 Thể vùi của các nguồn vi rút NPV ở độ phóng đại 400X 39 3.4 Lây nhiễm vi rút NPV trên sâu khoang trong phòng thí nghiệm 40 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu vi rút NPV sâu khoang 57 3.6 Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining 57 3.7 Hình ảnh thể vùi của nguồn vi rút NPV dưới kính hiển vi TEM 58 3.8 Sâu khoang chết sau khi lây nhiễm vi rút NPV (hình A và hình B) 59

3.10 Tế bào sâu khoang nhiễm vi rút NPV chụp dưới kính lúp soi nổi

3.11 Hình ảnh thể vùi của vi rút NPV tế bào sâu khoang dưới kính

3.12 Kết quả điện di PCR vi rút TL1 nhân trên tế bào sâu khoang 72 3.13 Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp của Neighbor-joining 73

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên viết đầy đủ

NPV Vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus)

NPV-Spl Nucleo Polyhedrosis Virus – Spodoptera litura

MNPV Multiple nucleocapsids virion

SNPV Single Nucleocapsids virion

PBS Phosphate Buffered Saline

PIB Thể vùi (Polyhedra Inclusion Body)

MOI Multiplicity of infection

WP Bột thấm nước (Wetable powder)

2WP Bột thấm nước hàm lượng 2 tỷ thể vùi/gam

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu

Nông nghiệp Việt Nam được hình thành và phát triển trong điều kiện khí hậu khác nhau làm cho sự đa dạng nông nghiệp trở lên phong phú, giàu các vi sinh vật Cùng với sự đa dạng của cây trồng thì sự đa dạng của sâu hại

ở Việt Nam cũng rất lớn Hàng năm thiệt hại do sâu hại gây ra khoảng 25- 30% thậm chí có khi lên tới 40- 50% Thành phần sâu hại khoảng 753 loài thuộc 99 họ và 10 bộ (Dương Hoa Xô, 2007)

Sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) là đối tượng sâu hại phổ biến,

phân bố rộng ở nhiều nước thuộc khu vực nhiệt đới và á nhiệt đới Đây là một loài sâu ăn tạp, có thể sống và gây hại trên 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau Ở Việt Nam, sâu khoang thường phát sinh phá hại nặng trên nhiều loại cây trồng, điển hình như các loại cây: bắp cải, rau muống, khoai sọ, thuốc

lá, đậu tương, lạc, bông, đay, v.v (Ward và cs., 2003)

Trên đồng ruộng, sâu khoang cũng như các loài côn trùng bộ Cánh

phấn khác thường bị chết do nhiễm vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus)

Theo kết quả theo dõi của Viện Bảo vệ thực vật (2001), khi sâu khoang phát sinh ở mật độ cao, tỷ lệ sâu bị chết do nhiễm NPV từ 0,2- 1,5% trên rau bắp cải, từ 0,9- 1,6% trên đậu tương và từ 0,3- 1,9% trên lạc (Viện Bảo vệ thực vật, 2001)

Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV-Spl để cung ứng cho nông dân phục vụ phòng trừ sâu khoang hại trên các cây trồng nông nghiệp,

sẽ góp phần hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất nông sản an toàn, chất lượng cao cho tiêu dùng và xuất khẩu, bảo tồn các loài sinh vật có ích và bảo vệ môi trường đồng ruộng Đồng thời, thông qua việc

sử dụng chế phẩm để phòng trừ sâu khoang sẽ góp phần bổ sung nguồn vi

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2

sinh vật có ích NPV-Spl vào đồng ruộng

Các nhà khoa học đã xác định vi rút lây nhiễm trên sâu khoang là loài

vi rút nhân đa diện NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus) thuộc họ Baculoviridae

và thuộc nhóm vi rút sinh thể vùi, mỗi thể vùi có chứa tới 200 thể vi rút (virion) hình que có vỏ ngoài là protein bao bọc phân tử ADN (nhân) dạng vòng xoắn kép Thể vùi của NPV côn trùng có hình khối đa diện với kích thước từ 0,15- 15µm NPV-Spl rất chuyên tính và có hiệu quả gây chết cao đối với sâu khoang, không lây nhiễm trên các loài không phải là ký chủ của

nó (Engelhard và cs., 1994; Reinisch, 1989)

Tuy nhiên, các loại vi rút chỉ có thể tồn tại, phát triển được trong các tế bào sống và trong điều kiện môi trường thích hợp (Federici, 1997) Vì vậy, việc sản xuất chế phẩm vi rút đòi hỏi phải được thực hiện trên cơ thể sâu hoặc trên các mô, tế bào sâu còn sống Vì vậy, nhiều nước phát triển đã áp dụng công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng để sản xuất các loại chế phẩm NPV với qui mô công nghiệp (Boguslaw và cs., 2011)

Còn ở Việt Nam, việc sản xuất NPV lâu nay vẫn tiến hành theo phương pháp thủ công với qui mô nhỏ hẹp Bằng cách nuôi sâu sống số lượng lớn, sau

đó nhiễm vi rút NPV của loài sâu tương ứng, rồi nghiền lọc và đem ra sử dụng (Trương Thanh Giản và cs., 1996; Hoàng Thị Việt và cs., 2002) Theo cách này thì sản xuất chế phẩm NPV để trừ sâu hại khó có thể thực hiện với qui mô công nghiệp, vì để nuôi được số lượng lớn một loài sâu hại phục vụ sản xuất chế phẩm là một vấn đề hết sức khó khăn và phải có đủ nhà xưởng, trang thiết bị Việc nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV trên cơ sở ứng dụng

kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng là vấn đề mới

Để góp phần tư liệu hướng tới xây dựng qui trình sản xuất chế phẩm sinh học NPV trên cơ sở nuôi nhân tế bào để phục vụ phòng trừ sâu hại ở

nước ta, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3

đến khả năng lây nhiễm vi rút NPV – Spl (Nucleo Polyhedrosis Virus - Spodoptera litura) trên tế bào sâu khoang (Spodoptera litura)”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Phân lập được các nguồn vi rút NPV sâu khoang

- Lây nhiễm nhân tạo thành công nguồn vi rút NPV trên tế bào sâu

khoang (Spodoptera litura)

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

+ Ý nghĩa khoa học

Kết quả thực hiện đề tài đóng góp những tư liệu khoa học làm sáng tỏ tiềm năng to lớn của các nguồn vi rút NPV trên sâu hại nói chung và sâu khoang nói riêng, nhằm hướng tới khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật hữu ích trong tự nhiên để phát triển chế phẩm sinh học, phục vụ phòng trừ sâu hại cây trồng ở nước ta

Bước đầu cung cấp các dẫn liệu khoa học về khả năng lây nhiễm của vi rút NPV sâu hại trên tế bào nuôi nhân, làm cơ sở khoa học cho xây dựng qui trình sản xuất chế phẩm NPV theo công nghệ tế bào

+ Ý nghĩa thực tiễn

Việc thu thập và tuyển chọn thành công 9 nguồn vi rut NPV có tiềm năng và hoạt lực cao trong phòng trừ sâu khoang hại cây trồng, đóng góp những thực liệu vi rút làm tiền đề cho việc nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học vi rút NPV phục vụ sản xuất nông sản an toàn, chất lượng cao

Các kết quả nghiên cứu còn chỉ rõ các yếu tổ ảnh hưởng và xác định thông số kỹ thuật (nồng độ tế bào, nồng độ vi rút, nhiệt độ, pH, v.v) phục vụ lây nhiễm để sản xuất chế phẩm sinh học vi rút NPV có hiệu quả cao Góp phần hướng tới việc sản xuất chế phẩm vi rút NPV bằng công nghệ nuôi nhân

tế bào côn trùng Kết quả của đề tài góp phần mở ra khả năng sản xuất qui mô công nghiệp các chế phẩm sinh học vi rút NPV và sử dụng phòng trừ sâu hại

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4

cây trồng nông nghiệp an toàn và hiệu quả

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5

CHƯƠNG I

CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu

Tác nhân vi rút NPV đều rất chuyên tính và có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp Trên đồng ruộng, vi rút NPV thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ khá cao, kết quả theo dõi liên tục

từ năm 1988 đến 1995 trên đay tại Đan Phượng (Hà Tây cũ) đã xác định tỷ lệ sâu đo xanh chết cao nhất do NPV của các năm biến động từ 31,1% (năm 1995) đến 66,6% (năm 1992) Còn trên sâu khoang hại đậu tương và lạc thường có tỷ lệ chết do NPV từ 1,2- 12,5% (Nguyễn Văn Cảm và cs.,1996) Trên đồng ruộng, vi rút NPV thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ khá cao và luôn tồn tại dưới dạng thể vùi, các thể vùi có thể tồn tại tới 30 năm

và chỉ bị tiêu diệt thể vùi khi gặp phải môi trường đất, nước có pH ≥ 9,0 hoặc dính bám trên thân cây, lá cây hay tàn dư cây trồng ở vị trí bị phơi dưới ánh sáng cực tím (Grzywacz và cs., 1996)

Sau khi các cá thể sâu non ăn phải thức ăn có mang thể vùi NPV, gặp

pH cao của ruột giữa thì màng protein của thể vùi bị phá vỡ, giải phóng các virion và các virion này sẽ xâm nhiễm vào nhu mô ruột Sau đó, sang các mô bào của cơ thể Sau 2-3 ngày sâu ngừng ăn và sau 5- 7 ngày thì sâu chết (Nguyễn Văn Cảm và cs.,1996)

Trước khi chết, phần cuối thân dính bám vào lá hoặc thân cây và treo ngược cơ thể, khi sâu non chết cơ thể căng mọng nước rất dễ bị vỡ khi có va chạm nhẹ Sau khi vỡ, thể vùi được giải phóng ra môi trường đồng ruộng và tồn tại trong đất, tàn dư cây trồng Một sâu non chết bệnh NPV có chứa tới 24.553 thể vùi được giải phóng ra môi trường đồng ruộng và tồn tại để tiếp tục chờ cơ hội tiếp tục xâm nhiễm gây chết cho sâu hại Trong quá trình canh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6

tác hoặc do mưa gió, làm đất các thể vùi này dính bám lên lá cây và tiếp tục chờ cơ hội tiếp tục xâm nhiễm gây chết cho sâu hại (Pourmirza, 2000)

Như vậy, việc phun chế phẩm vi rút NPV vừa có ý nghĩa như một loại thuốc sinh học để phòng trừ sâu hại một cách trực tiếp, vừa bổ sung nguồn vi rút hữu ích vào đồng ruộng, góp phần bảo vệ cân bằng sinh thái, duy trì quần thể các sinh vật có ích, đảm bảo an toàn sức khoẻ người lao động, môi trường

và chất lượng sản phẩm khi thu hoạch

Vi rút NPV sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng sẽ phá hủy các mô

và làm cho vật chủ chết Những cá thể còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng, làm nhộng bị thối, ngài vũ hóa bị biến dạng, hoặc khả năng đẻ trứng giảm và ảnh hưởng tới các thế hệ sau (Pourmirza, 2000)

Hơn nữa, các loài vi rút gây chết trên côn trùng sâu hại thường có đặc điểm chuyên tính cao với ký chủ của chúng và rất an toàn đối với người và các động vật máu nóng (Barreto, 2005) Do vậy, vi rút gây bệnh côn trùng ngày càng được chú ý nghiên cứu và được coi là một trong những nhân tố có triển vọng trong phòng chống sâu hại cây trồng

1.2 Những nghiên cứu ở nước ngoài

1.2.1 Vài nét về sâu khoang (Spodoptera litura)

Sâu khoang có tên khoa học là Spodoptera litura, thuộc Họ Ngài sáng

(Noctuidae), Bộ Cánh vảy (Lepioptera) Sâu khoang còn được gọi là sâu ăn tạp là đối tượng gây hại nặng trên các loại cây trồng nông nghiêp Trên thế giới sâu phân

bố rất rộng vì phổ ký chủ rộng, sâu khoang có thể gây hại khoảng 290 loài thực

vật, trong đó có 200 loại cây trồng (http://www.bvtvhcm.gov.vn)

Sâu khoang có vòng đời từ 25 - 48 ngày, trải qua 4 giai đoạn trứng, sâu non, nhộng và trưởng, sâu non vừa nở ăn gặm vỏ trứng và sống tập trung, nếu

bị khua động nhẹ chúng có thể bò phân tán ra chung quanh hoặc nhả tơ buông mình xuống đất, ở giai đoạn này sâu chỉ gặm mặt dưới lá, chừa biểu bì

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7

trên và gân Sang tuổi 2 sâu bắt đầu phân tán và ăn gặm lá nhiều hơn Từ tuổi 4 sâu có phản ứng rõ rệt đối với ánh sang nên ban ngày sâu ẩn những nơi tối hoặc chui xuống kẻ đất nứt, ban đêm sâu bò lên cây, trong những ngày trời râm mát hoặc mưa nhẹ thì ban ngày sâu có thể bò hoạt động trên cây Ở tuổi lớn sâu

có tập quán ăn thịt lẫn nhau và không những ăn phá lá cây mà còn ăn trụi cả thân, cành và trái non Khi sắp làm nhộng sâu chui xuống đất làm thành một

khoang và nằm yên trong đó hóa nhộng (http://www.bvtvhcm.gov.vn)

Các biện pháp phòng trừ sâu khoang bao gồm biện pháp canh tác, biện pháp cơ giới vật lý, biện pháp hóa học và biện pháp sinh học trong đó biện pháp hóa học được sử dụng nhiều nhất ở các vùng chuyên canh rau màu, sự lạm dụng thuốc hóa học trong phòng trừ sâu hại làm ảnh hưởng đến các sinh vật có ích, gây ô nhiễm môi trường và đặc biệt ảnh hưởng tới sức khỏe con người Hiện nay, trên thế giới (Trung Quốc, Nga, Brazil, Úc,…) đã ứng dụng chế phẩm sinh học để phòng trừ sâu khoang hại cây trồng, đặc biệt là các chế phẩm sản xuất từ vi rút NPV (Boguslaw và cs., 2011)

1.2.2 Vi rút diệt côn trùng và vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus)

1.2.2.1 Lịch sử phát hiện vi rút diệt côn trùng

Lịch sử cổ đại ghi nhận những phát hiện về bệnh tằm dâu và ong khi

con người bắt đầu nhân nuôi, thuần dưỡng hai loài côn trùng có ích này Năm

384-322 Trước công nguyên Aristotle đã miêu tả bệnh của ong, nhưng người Trung quốc đã có những quan sát về bệnh tằm dâu từ 2700 năm trước công

nguyên (Simmonds và cs., 1976)

Năm 1856, Cornalia và Maestri đã mô tả bệnh tằm nghệ - bệnh vi rút Các tác giả này đã phát hiện thấy các thể đa diện trong cơ thể tằm Bolle (1898) mô tả sự hoà tan thể đa diện trong ruột tằm và giải phóng các hạt (Stair, 1968)

Năm 1919, Akkva, Komarek và Breidl (1923) đã phát hiện dịch qua lọc

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8

có bản chất vi rút và dịch lọc này có khả năng gây bệnh, tạo nên những thể đa diện ở côn trùng (Mclntosh và cs., 2003)

Người đầu tiên nhìn thấy vi rút gây bệnh côn trùng là Bergold trong những công trình công bố 1943-1947 sau khi có kính hiển vi điện tử (Bergold, 1953)

1.2.2.2 Cơ chế gây bệnh của vi rút diệt côn trùng

Khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, các vi rút nhân lên ngay trong nhân hoặc trong chất nguyên sinh của tế bào, phá huỷ các mô và làm cho vật chủ chết Những côn trùng còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng (nhộng bị thối, ngài vũ hoá bị biến dạng), trong giai đoạn ngài (khả năng đẻ trứng giảm) và ảnh hưởng tới các thế hệ sau Nguồn vi rút tồn tại trong tự nhiên lại gây lây nhiễm cho các thế hệ mới Trên cơ sở khoa học này,

vi rút gây bệnh côn trùng ngày càng được chú ý nghiên cứu và được coi là một trong những nhân tố có triển vọng trong phương pháp đấu tranh sinh học phòng chống sâu hại cây trồng trong tương lai (Simmonds và cs., 1976)

Năm 1986, Evan đã miêu tả hơn 20 họ vi rút gây bệnh cho côn trùng

Trong đó 2 họ được nghiên cứu nhiều là Baculoviridae và Reoviridae Đại diện của họ Baculoviridae là vi rút đa diện nhân (NPV) và đại diện của họ

Reoviridae là vi rút đa diện tế bào chất (CPV) (Evan, 1986)

CPV ký sinh trong 4 bộ côn trùng hay gặp nhất là bộ cánh vảy

(Lepidoptera) có 250 vật chủ, bộ hai cánh (Diptera) có 39 vật chủ Tuy nhiên chỉ có CPV của sâu thông Dendrolimus spectabilis là được sản xuất và đăng

ký là thuốc trừ sâu sinh học vi rút (George, 1986) Mặc dù thuốc CPV có hiệu quả diệt sâu, nhưng người ta vẫn ít quan tâm để phát triển hơn so với Baculovirus, vì lí do chủ yếu là CPV chỉ tấn công tế bào biểu mô ruột của sâu

và có xu hướng gây ra nhiễm trùng mãn tính Hơn nữa trong điều kiện tự nhiên, chúng gây bệnh dịch với tỷ lệ thấp và ít ảnh hưởng tới quần thể vật chủ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9

như Baculovirus Tuy nhiên chúng có thể nhân nuôi theo qui mô lớn trong công nghiệp (Evan, 1986)

Theo các tác giả Granados và Federici (1986); có hơn 600 loài sâu thuộc bộ Lepidoptera, Hymenoptera, Coleoptera, Diptera, v.v là vật chủ của

Baculovirus Do đó có rất nhiều nghiên cứu và sản xuất thuốc trừ sâu vi rút

tập trung vào nhóm vi rút này Hầu hết Baculovirus thuộc tính chuyên hoá cao, chỉ ký sinh trong một loài sâu, thậm chí ký sinh một số mô nhất định nào

đó của sâu (Granados và Federici, 1986), Baculovirus của Autographa

californica (AcMNPV) và Baculovirus của Autographa falcifera có vật chủ

của hơn 30 loài côn trùng thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera) Những tác động có hại của Baculovirus đối với thiên địch và các ong kí sinh trưởng thành chưa được phát hiện trong tự nhiên (Carter, 1984)

Sau khi NPV vào cơ thể ký chủ côn trùng bằng đường tiêu hoá, sâu non ngừng ăn Cơ thể sâu biến đổi về màu sắc Sau 1-2 ngày cơ thể sâu căng phồng, mọng nước Cơ thể có màu vàng hoặc trắng Hạ bì dễ bị nứt, chuyển động chậm, chết nhanh Ngoài đồng ruộng sâu chết do vi rút thường quan sát thấy đầu chúc xuống dưới, dịch trắng chảy ra ngoài (Lê Quang Quyến, 2005)

Hình 1.1 Sâu khoang khoẻ mạnh (A) và sâu khoang chết

do nhiễm vi rút NPV (B)

“Nguồn: ottosii.tenkomori.tv và http://www.trevorwilliams.info/Virus_insecticides.htm”

Nguyên nhân gây chết sâu là do khi các hạt vi rút bám vào các tế bào

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10

dễ mẫn cảm và xâm nhập vào các tế bào đó Dưới tác dụng của dịch tiêu hoá

pH > 9 các thể vùi đa diện nhanh chóng hoà tan trong môi trường kiềm, các virion được giải phóng Các virion hấp phụ vào màng vi mao Chức năng của màng này là cho phép thâm nhập vào để sinh sản, phá vỡ thành tế bào, thoát

ra ngoài và thâm nhập các tế bào khác của vật chủ và gây bệnh cho vật chủ

Cơ chế này giống như cơ chế nhân lên của thực khuẩn thể trong tế bào (Dow, 1992; Pearson và cs., 2001)

Quá trình nhiễm bệnh của sâu thường trải qua ba giai đoạn (Federici, 1997; Ohkawa và cs., 2010):

- Giai đoạn tiềm ẩn: kéo dài khoảng 12 giờ Đây là giai đoạn xâm nhập

của vi rút vào bên trong tế bào Các vi rút cài vào các thụ thể của màng của nhân tế bào

- Giai đoạn tăng trưởng: kéo dài 16 - 48 giờ Vi rút tăng trưởng nhanh

trong giai đoạn này Trong nhân tế bào vật chủ, xuất hiện các cấu trúc mạng lưới Sau 32 giờ trong nhân tế bào vật chủ chứa đầy các virion không vỏ

- Giai đoạn cuối: ở giai đoạn này xảy ra sự tạo thành thể vùi, nghĩa là

các virion được bao bọc trong thể protein Thời kỳ ủ bệnh của các côn trùng

bị bệnh thường kéo dài từ 3-12 ngày phụ thuộc vào tuổi của vật chủ, nhiệt độ,

độ ẩm và các điều kiện khác của môi trường

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11

Hình 1.2 Chu trình tồn tại và phát triển của vi rút NPV trong tự nhiên

“Nguồn: Ward và cs., 2003”

Trong tự nhiên, việc lây truyền nguồn bệnh vi rút ở côn trùng xảy ra theo hai hướng (Federici, 1997):

- Lây truyền ngang: Nguồn bệnh lây lan giữa các cá thể trong cùng một

thế hệ trong điều kiện phát thành dịch, nguồn vi rút có thể bám vào vỏ trứng của vật chủ Khi nở ấu trùng gặm vỏ trứng chui ra và bị nhiễm bệnh

- Lây truyền dọc: là sự lây truyền bệnh qua trứng và phôi

Trong in vitro sự thâm nhập của NPV vào tế bào mẫn cảm bằng cách các vỏ vi rút hấp thụ trên bề mặt tế bào và các hạt vi rút này đi vào tế bào chất bằng thực bào Các capsit nhân lên trong tế bào chất và tương tác với các lỗ rò của màng nhân để đi vào chất nhân (Ohkawa và cs., 2010)

Trong quần thể sâu hại tự nhiên côn trùng không chỉ bị một bệnh do một loại vi rút gây ra mà còn bị nhiễm bệnh hỗn hợp của 2 loại vi rút Thông thường đó là hỗn hợp giữa NPV và CPV Có loài côn trùng cùng một lúc có tới 9 vi rút gây bệnh Đến nay sự nhiễm bệnh hỗn hợp của nhiều loại vi rút đã được biết ở 198 loại côn trùng (Granados và Federici, 1986)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12

Tác động qua lại giữa các vi rút trong quá trình nhiễm bệnh biểu hiện theo ba kiểu: đồng tác động, tác động không phụ thuộc vào nhau và tác động gây nhiễu cho nhau Khi có hiện tượng đồng tác động các vi rút trong cùng một

cơ thể vật chủ sẽ làm tăng tỷ lệ chết của sâu và rút ngắn thời gian gây chết xuống 50% Điều này rất có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất, ngược lại hiện tượng tác động nhiễu làm giảm hiệu lực gây bệnh của vi rút và làm giảm hiệu quả của chế phẩm, vì vậy khi sản xuất chế phẩm cần loại trừ các vi rút có tác động nhiễu Chế phẩm NPV không được dùng trong quần thể sâu hại có bệnh CPV vì giữa hai nhóm này thường có tác động nhiễu lên nhau (Xeros, 1952)

1.2.2.3 Các phương pháp phát hiện vi rút

- Phương pháp căn cứ vào triệu chứng bệnh

Căn cứ vào triệu chứng bên ngoài để xác định sự có mặt của vi rút côn trùng Thông thường người ta so sánh giữa côn trùng khoẻ và côn trùng bị bệnh dựa vào các triệu chứng bên ngoài của sâu có thể phân biệt được các nhóm vi rút gây bệnh cho côn trùng Trên cơ sở những quan sát bằng thực nghiệm, với số mẫu vật quan sát lớn, có thể xây dựng được một khoá phân loại đơn giản để xác định các nhóm vi rút côn trùng (Lê Quang Quyến, 2005)

- Phương pháp kính hiển vi điện tử

Nhuộm mẫu soi trên kính hiển vi quang học có thể phát hiện được các thể vùi nhưng không phân biệt được vi rút có thể vùi và không có thể vùi (GV)

vì vậy cần phải dùng kính hiển vi điện tử quét (Scaning Electron Microscopy - SEM) hoặc kính hiển vi truyền qua (Transmission Electron Microscopy -TEM)

để xác định Kính hiển vi điện tử là công cụ hữu hiệu để phân biệt được những nét đặc trưng của từng nhóm vi rút Có thể dùng mẫu để soi thẳng bằng SEM hoặc cắt lát mỏng để quan sát (Ramoska và Hink, 1974)

1.2.2.4 Đặc điểm của vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus)

Vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus) thuộc họ Baculoviridae,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13

thuộc lớp Virus bao gồm 2 giống: vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus - NPV) và vi rút hạt (Granulosis Virus – GV) (Erayya và cs., 2013)

Theo Farrar và cs (1999) thì NPV là nhóm vi rut lớn và có hiệu quả gây chết cao đối với các loài côn trùng, mỗi loài vi rút thường rất chuyên tính Đặc biệt, các loài NPV hoàn toàn không lây nhiễm trên các loài động vật có xương sống Vì thế, chúng là những tác nhân sinh học rất hữu ích trong phòng trừ sâu hại cây trồng (Harrap, 1972)

NPV có dạng hình gậy, chứa ADN, nucleocapsis, có kích thước 40- 70

x 200 - 400 nm NPV tồn tại dưới dạng các hạt tinh thể sáng gọi là thể vùi (OB) hoặc thể đa diện (PIB) (Pearson và cs., 2001) Khi quan sát dưới kính hiển vi phản pha có kích thước 1-7µm Tinh thể này có nhiều cạnh và tạo thành 1 protein có khối lượng phân tử khoảng 25- 30 kDa Các hạt vi rút có một lớp bọc bên ngoài gọi là nhân capsit và vi rút NPV có một đặc tính là hình thành các protein tinh thể trong nhân của tế bào côn trùng với kích thước 0,5 - 15 nm (Harrap, 1972)

Vi rút NPV có cấu tạo gồm 3 phần: vỏ ngoài, vỏ capsid và lõi axit nucleic (Harrap, 1972)

- Vỏ ngoài: là một lớp màng nhầy ngoài cùng có tính chất là protein và

gọi là protein ngoài Protein ngoài mang trính kháng nguyên và có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ

- Vỏ capsid: Vỏ capsid nằm kế tiếp bên trong lớp vỏ ngoài và được

ngăn cách với lớp vỏ ngoài bởi một lớp keo dính Protein cấu tạo nên vỏ capsid được gọi là protein trong Protein trong mang tính kháng nguyên làm tăng khả năng gây bệnh của vi rút

- Genom: Genom của vi rút NPV là một phân tử ADN gồm 2 mạch

xoắn kép Khi nhiễm vào tế bào vật chủ vi rút đưa lõi ADN vào tế bào vật chủ, ADN của vi rút sử dụng năng lượng, nguyên liệu và riboxom của tế bào

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14

vật chủ để tổng hợp nên protein và quá trình nhân lên của ADN Mặt khác khi

tế bào bị nhiễm vi rút, ADN của vi rút sinh ra men azenaza ức chế ADN của

tế bào chủ và phân giải tạo thành các nucleotit tự do Sau khi tổng hợp đủ các thành phần như vỏ, ADN, vi rút tiến hành lắp ráp để tạo thành vi rút mới [45]

Quá trình nhân lên của vi rút NPV và sự hình thành thể đa diện được tiến hành trong nhân tế bào, vỏ của thể đa diện được tổng hợp ở ngoài nhân sau đó vận chuyển vào trong nhân để hình thành các thể đa diện Số lượng vi rút và thể đa diện ngày một tăng, kêt quả phá vỡ tế bào chủ, giải phóng vi rút

tự do và thể đa diện Vi rút tự do lại tiếp tục xâm nhập vào tế bào lân cận, bắt đầu chu trình phá vỡ tế bào tiêp theo Các tế bào chủ bị phá vỡ, quá trình phát bệnh biểu hiện ra bên ngoài (Reinisch, 1989)

Hình 1.3 Các dạng Baculovirus (A) và thể vùi của vi rút (B,C,D)

“Nguồn: Van Oers và Vlak, 2007”

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15

(nếu ở thể đa diện vi rút bị bất hoạt trong vòng 3 giờ) Trong cơ thể dạng tự do

có thể xâm nhập tế bào gây nhiễm ngay (Falcon và Hess, 1985; Harrap,1972)

+ Dạng thể đa diện (NPV hình thành các thể vùi đa diện chứa nhiều

nhân capsit trong một vỏ vi rút gọi là MNPVs): Thể đa diện còn được gọi là

thể bao hàm, thể đa diện chứa khoảng 3-5 % hạt vi rút thành thục còn lại là protein (Carter, 1984) Vỏ của thể bao hàm là protein loại polyhedrin Polyhedrin dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm Do đó trong dịch ruột của sâu khoang pH là 9-10 các thể đa diện bị phá vỡ giải phóng các hạt vi rút tự

do Vi rút xâm nhập vào tế bào máu đến tế bào da, tế bào biểu mô khí quản, tế bào mỡ rồi gây bệnh (Kumari và Singh, 2009)

Trong môi trường vi rút NPV tồn tại ở 2 dạng, dạng tự do dễ gây bệnh,

nó xâm nhập vào đường miệng qua thức ăn, qua các vết xây xước ở da (Kiều Hữu Ảnh, 2006)

+ Dạng thứ nhất : Thể đa diện thường có trong lá thầu dầu theo đường

miệng vào ruột Tại ruột giữa, một phần bị thải ra ngoài, do tác dụng của protein huỳnh quang đỏ trong dịch tiêu hóa của ruột, một số gây bệnh tại chỗ, một số theo máu đến các cơ quan nội tạng trong cơ thể để nhiễm và gây bệnh

+ Dạng thứ hai : Khi tiếp xúc với tế bào, trên lớp vỏ của vi rút có khả

năng giúp cho vi rút gắn với thực thể của tế bào để xâm nhập vào bênh trong, quá trình tổng hợp protein và ADN của vi rút được tiến hành trong nhân và có thể quan sát được băng phương pháp vạch chất đồng vị Protein loại polyhedrin được tổng hợp ngoài nhân, sau đó vận chuyển vào trong nhân bao lấy các hạt vi rút thành thục tạo thành thể đa diện Thể đa diện có thể tồn tại ngoài tế bào vật chủ, tận dụng tính chất này người ta đã sử dụng vi rút NPV

để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, tiêu diệt côn trùng có hại (Kumari và Singh, 2009)

Phân tích trên kính hiển vi điện tử thấy các thể vùi đa diện nhân là

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 16

những tinh thể lớn, nhiều cạnh, có dạng như hình que, hình vuông, kích thước

từ 1- 7µm Các thể vùi này có cấu tạo bởi các thể protein Các lát cắt cực mỏng phóng đại trên 60.000 lần cho thấy các khối đa diện chứa nhiều virion hình que (Harrap, 1972)

Các virion của NPV sâu xanh chỉ có một nucleocapsid trong một lớp vỏ bao và nucleopsid này cũng có dạng hình que Các khối đa diện có đặc điểm

dễ bị kiềm hoá, dùng 1/10N NaOH có thể phá vỡ các vỏ đa diện giải phóng các virion, chính vì vậy trong ruột côn trùng, dịch ruột mang tính kiềm nên các polyhedra dễ bị phân huỷ để lây nhiễm tiếp vào các nhân của các tế bào khác Mỗi nucleocapsid chỉ chứa một sợi đôi ADN dạng vòng Trọng lượng phân tử 75 - 100 106 Da (Harrap, 1972)

1.2.3 Kỹ thuật phân lập và làm thuần vi rút NPV trong phòng trừ sâu hại

Các loài Baculovirus chỉ lây nhiễm trên các loài động vật chân khớp, chủ

yếu là các loài côn trùng thuộc bộ Lepidoptera Chúng thuộc họ Baculoviridae,

bao gồm 2 giống: vi rút nhân đa diện (NPV) và vi rut hạt (GV) (Erayya và cs., 2013) Theo Yeh và cs (2007), hiện nay đã xác định được hơn 600 nguồn vi rút thuộc 42 loài Baculovirus , trong số đó, có 28 loài NPV được xác định là có thể vùi (OB) chứa lượng lớn các thể vi rút (Yeh và cs., 2007)

Các tác giả cũng chỉ rõ hầu hết các loài NPV trên côn trùng đều có phạm vi ký chủ hẹp và không lây nhiễm gây hại trên các loài không phải là ký chủ của nó Đặc biệt, các loài NPV hoàn toàn không lây nhiễm trên các loài động vật có xương sống Vì thế, chúng là những tác nhân sinh học rất hữu ích trong phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng và là vector hiển thị các gen lạ (Carter, 1984) Theo Farrar và Ridgway (1999) thì NPV là nhóm vi rut lớn và có hiệu quả gây chết cao đối với các loài côn trùng, mỗi loài vi rút thường rất chuyên tính với một hoặc một vài loài côn trùng gần gũi với ký chủ chuyên tính của

chúng (Farrar và Ridgway, 1999)

Theo Sun và cs (2004), hiện nay đã có 12 loài vi rút loài Baculovirus ở Trung

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17

Quốc đã được sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học và đã được thương mại hóa, bao

gồm H armigera NPV, S litura NPV, S exigua NPV, Buzura suppressaria NPV,

Pieris rapae GV and Plutella xylostella GV Các loài Baculovirus ở Trung Quốc

được sử dụng nhiều nhất trên thế giới (Sun và cs., 2004)

Đã có nhiều tài liệu đã chỉ ra rằng để có sản phẩm có hàm lượng vi rút

cao và có hiệu quả trong phòng trừ sâu hại thì phải có nguồn thực liệu vi rút tiêu chuẩn đã được làm thuần và nghiên cứu đầy đủ về kỹ thuật lây nhiễm trên

tế bào nhân nuôi Theo Grzywacz và cs (1996), để có nguồn thực liệu vi rút NPV có hiệu quả, tốt nhất nên phân lập và nuôi nhân từ nguồn NPV trên các

cá thể sâu chết do nhiễm NPV được thu thập ngoài đồng ruộng Vì nguồn NPV này phù hợp và có hiệu quả cao với nòi sinh thái của loài sâu hại cần phát triển chế phẩm NPV để phòng trừ Các tác giả này đã đưa ra qui trình kỹ thuật rất chi tiết gồm 8 bước để phân lập và làm thuần nguồn thực liệu vi rút NPV Các tác giả này còn khuyến cáo, việc nhân sinh khối nguồn thực liệu vi rút để phục vụ lây nhiễm tạo chế phẩm tốt nhất nên tiến hành trên nguồn tế bào nuôi nhân, như thế sẽ đảm bảo độ thuần và chống lẫn tạp với các loại vi sinh vật khác (Grzywacz và cs., 1996)

Theo Lynn (2002) và một số tài liệu khác đã đưa ra qui trình chi tiết gồm 8 công đoạn kế tiếp nhau để nhân sơ cấp và làm thuần thực liệu vi rút NPV Các tác giả cũng khuyến cáo việc làm thuần thực liệu NPV để sản xuất chế phẩm và cho các mục đích nghiên cứu khác cần tiến hành 2- 3 lần trên tế bào loài sâu hại đã được nuôi nhân (Lynn, 2002)

1.2.4 Kỹ thuật bảo quản vi rút NPV

Kết quả nghiên cứu của Patricia và cs (2001) chỉ rõ khi bảo quản ở nhiệt độ -700C hay ở nhiệt độ 50C hoặc ở nhiệt độ trong phòng trong thời gian

9 và 12 tháng thì hoạt lực trừ sâu của NPV không hề bị thay đổi Đồng thời, cũng xác định cần đóng gói bằng túi plastic, nhưng cần lưu ý là độ ẩm của sản

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18

phẩm có xu hướng tăng dần sau khi đóng gói Nếu sau 1 năm bảo quản mà độ

ẩm của sản phẩm vượt quá 12% thì hiệu lực trừ sâu của chế phẩm NPV sẽ bị giảm đi Vì vậy, việc duy trì độ ẩm sản phẩm luôn thấp dưới 12% là rất cần thiết để đảm bảo hoạt lực của chế phẩm nếu phải bảo quản trên 12 tháng (Lynn, 2002; Patricia và cs., 2002)

Theo Sireesha và cs (2010), trong thực tế đồng ruộng thì thể vùi của nhiều loại NPV có thể duy trì độc tính từ 2- 25 năm, nhưng trong sản xuất công nghiệp thì sản phẩm phải đảm bảo hoạt lực từ 18 tháng trở lên do phải mất thời gian chờ tiêu thụ Tuy nhiên, qua thử nghiệm các phương thức bảo quản khác nhau, tác giả xác định nếu đựng bằng các dụng cụ để bảo quản trong tủ lạnh (4- 50C), sau 10 tháng bảo quản thì hiệu lực trừ sâu của chế phẩm ít bị thay đổi Nhưng bảo quản trong lọ thủy tinh trắng hay lọ thủy tinh màu tối và

để ở nhiệt độ bình thường thì hoạt tính trừ sâu đều bị suy giảm rõ rệt sau 10 tháng bảo quản, hiệu lực trừ sâu xanh hại bông giảm từ 95,4% chỉ còn 66,18

1.2.5 Kỹ thuật lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào sâu khoang

Các kết quả nghiên cứu lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào nhân nuôi để tạo chế phẩm đã được diễn giải khá chi tiết trong nhiều tài liệu Theo kết quả nghiên cứu của Goodman và cs (2001), Ney và cs (2004), nồng độ tế bào khi lây nhiễm là 0,95 x 105; 2,05 x 105 và 5,13 x 105 tế bào/ml thì đạt tỷ lệ tế bào bị nhiễm vi rút NPV tương ứng là 98,5%; 99,5% và 100% sau 120 giờ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19

Sử dụng tỷ lệ dịch thể khi lây nhiễm là 1:1 và 1:2 thì tỷ lệ tế bào bị nhiễm vi rút NPV tương ứng là 72,5% và 93,7% trong 120 giờ Điều đó cho thấy việc lây nhiễm vi rút NPV trong môi trường có mật độ tế bào thấp sẽ đạt hiệu quả cao (Goodman và cs., 2001)

Theo Agathos và cs.(1994), Maiorella và cs (1988) và nhiều tác giả khác thì bình chứa dịch tế bào để lây nhiễm vi rút NPV chỉ nên chiếm 2/3 tổng dung tích bình chứa, pha loãng để đảm bảo mật độ tế bào từ 0,5- 1,0 x

106 tế bào/ml để qua 1 ngày đêm Nếu kiểm tra thấy tế bào tiếp tục phân chia trở lại thì mới tiến hành lây nhiễm vi rút NPV Các tác giả còn đề xuất một công thức tính toán liều lượng NPV lây nhiễm thích hợp để đạt hiệu quả cao dựa vào chỉ số MOI (mức độ lây nhiễm) của vi rút đối với tế bào (Goodman

và pH là 7.0 mật độ thể vùi thấp hơn ở mức pH là 6,5 Khi lây nhiễm vi rút HearNPV trên dòng tế bào HzAM1 thì mật độ thể vùi cũng đạt cao nhất, đạt tới 1,1 x 107 OB/ml ở pH là 6,5; còn ở mức pH là 6,0 và 7,0 thì mật độ thể vùi chỉ bằng 30,4% mật độ thể vùi ở pH là 6.5 còn ở tế bào HzGUT mật độ thể vùi đạt cao nhất ở điều kiện pH môi trường là 6,5 đạt tới 0,8 x 106 OB/ml, còn ở pH là 6,0 và 7,0 mật độ thể vùi chỉ bằng 74,3 % và 43,8% so với mật độ thể vùi ở điều kiện pH là 6,5 (Jakubowska và cs., 2009)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20

Theo Phenjun và cs (2003) đã lây nhiễm vi rút HaNPV trên dòng tế bào côn trùng nuôi cấy từ Heliothis zea trên các môi trường MM8, SF900,

TC100 và huyết thanh Khi nồng độ tế bào nuôi cấy đạt được 105 đến 106 tế bào/ml tiến hành lây nhiễm vi rút Kết quả cho thấy sau 7 ngày khi lây nhiễm với chỉ số MOI là 0,1 thì mật độ thể vùi đạt tới 4,3 x 106 PIB/ml và khi lây nhiễm với chỉ số MOI là 0,3 đạt tới 7,8 x 106PIB/ml (Phejun và cs., 2003)

Theo Mekvichitsaeng và cs (1998), khi lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào

Heliothis zae (Hz) ở các chỉ số MOI khác nhau thì cho mật độ thể vùi khác nhau Với chỉ số MOI là 0,1 khi nồng độ tế bào là 1 x 106 PIB/ml, sau 5 ngày nhiễm thì thể vùi được giải phóng và sau đó vi rút đã nhiễm vào tế bào Hz Thí nghiệm lây nhiễm được tiến hành ở các nồng độ vi rút là 1x105; 2.5 x105;

5 x105 ; 1x106 và 2x106 PIBs/ml trên sâu, kết quả sau 10 ngày lây nhiễm cho thấy ở nồng độ vi rút là 2,5 x 105 PIB/ml là nồng độ tốt nhất để đạt tỷ lệ chết 80% sâu tuổi 2 (Mekvichitsaeng và cs., 1998)

Hình 1.4 Quá trình nhiễm của vi rút NPV trên tế bào côn trùng

“Nguồn: Rohrmann và George, 2011”

1.3 Những nghiên cứu trong nước

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21

1.3.1 Nghiên cứu về thu thập và phân lập vi rút NPV

Các nhà nghiên cứu về bảo vệ thực vật ở Việt Nam cũng đều khẳng định

vi rút nhân đa diện bệnh khá phổ biến và có hiệu quả khá rõ rệt trên các loài sâu hại cây trồng ngoài đồng ruộng Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu chuyên sâu về tác nhân vi rút NPV cũng như vai trò của nó trong hạn chế số lượng sâu hại ngoài đồng ruộng còn ít và chưa được quan tâm đúng mức (Viện Bảo vệ thực vật, 2006)

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Cảm và cs (1996) đã điều tra thu thập mẫu sâu nhiễm bệnh trên bông, thuốc lá và rau màu ở nhiều tỉnh khác nhau thuộc khu vực phía Bắc và Đông Nam Bộ, đã xác định có 5 loài

Baculovirus Các loài Baculovirus bao gồm 4 loài NPV của sâu xanh (H

armigera ), sâu khoang (S litura) hại rau màu, sâu đo xanh (A flava) hại đay, sâu róm hại thông (D punctatus) và 1 loài vi rút hạt (GV) trên sâu tơ (P

xylostella) hại rau họ thập tự Qua nghiên cứu NPV trên sâu xanh còn cho thấy vi rút NPV không chỉ gây chết sâu non, mà còn gây chết hoặc ức chế khả năng hoàn thành phát dục của nhộng và trưởng thành sâu xanh (Nguyễn Văn Cảm và cs., 1996) Theo tổng hợp của Hoàng Thị Việt và cs (2002) thì ở Việt Nam đã phát hiện được 10 chủng NPV trên 10 loài sâu hại cây trồng và 2 chủng GV trên 2 loài sâu hại là sâu tơ và sâu xanh bướm trắng (Hoàng Thị Việt và cs., 2002)

Qua nghiên cứu thí nghiệm diện hẹp liên tục từ năm 1989 đến 1992 đã khẳng định vi rút NPV-Se có hiệu lực cao trong phòng trừ sâu sâu keo da láng Đồng thời, rất chuyên tính với sâu keo da láng, không gây tổn hại đến các loài sinh vật có ích trên đồng ruộng

Tác giả Nguyễn Văn Hai (2010) đã tiến hành thu thập sâu khoang bị lây nhiễm vi rút NPV ngoài đồng ruộng tại 5 tỉnh thuộc khu vực đồng bằng sông Cửu Long Qua nghiên cứu, tác giả nhận thấy các nguồn NPV nhân từ các nguồn sâu nhiễm bệnh thu thập ngoài tự nhiên trên sâu non sâu khoang

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22

tuổi 2 đều cho tỷ lệ sâu nhiễm bệnh hình thành thể vùi đạt từ 5- 9,33 x 108

PIB/ml trong điều kiện phòng thí nghiệm Thí nghiệm so sánh các nguồn bệnh với hàm lượng 10,8 x 108 PIB/ml thì hiệu lực gây chết trên sâu non sâu khoang tuổi 2 từ 72,5- 94,5%, song với mức độ rất khác nhau giữa các nguồn NPV thu thập được từ các vùng sản xuất nông nghiệp khác nhau (Trần Văn Hai và cs., 2010)

1.3.2 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học từ vi rút NPV

Việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học NPV phục vụ phòng trừ sâu hại rau màu ở nước ta được quan tâm từ những năm 1980 với sự giúp đỡ của các chuyên gia thuộc Viện Khoa học nhiệt đới của Liên Xô (cũ) và bắt đầu triển khai với qui mô lớn từ năm 1990 Hai cơ quan tiến hành nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV là Viện Bảo vệ thực vật và Trung tâm Bông Nha Hố (nay

là Viện nghiên cứu cây bông) (Trần Thị Kiều Trang và Chaudhari, 2002) Tại Viện Bảo vệ thực vật, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV được khởi xướng với sự giúp đỡ của các chuyên gia Liên Xô (cũ) Sau đó, được tiến hành với kinh phí đầu tư của chương trình Công nghệ sinh học qua 2 đề tài cấp Nhà nước kế tiếp nhau từ năm 1996 đến năm 2005 và 01 dự án bằng vốn hỗ trợ của Chương trình Bánh mì nhà thờ (Cộng hòa Liên bang Đức) giai đoạn 1990- 1995 Các đề tài, dự án đã thu được nhiều thành tựu to lớn và có giá trị thực tiễn cao đối với công tác bảo vệ thực vật ở Việt Nam Tổng hợp đến năm 2005, đã đạt được kết quả cụ thể sau (Phạm Thị Thùy, 2008):

- Đã nghiên cứu, xây dựng được qui trình sản xuất thức ăn nhân tạo nuôi sâu Đã thiết lập được 01 pilot và tổ chức nhân nuôi được số lượng đáng kể sâu non của loài sâu xanh và sâu khoang phục vụ lây nhiễm vi rút để sản xuất chế phẩm NPV

- Xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm NPV từ nguồn sâu non nhân nuôi Đã nghiên cứu kỹ thuật tạo dạng sử dụng chế phẩm dưới

dạng bột thấm nước Phối hợp với chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) tạo

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23

sản phẩm phổ rộng VBt để phòng trừ sâu hại

- Đã sản xuất được tổng số 1.500 kg chế phẩm ViHa và ViSL có hàm lượng 1,5 x 106 PIB/gam Sử dụng chế phẩm trên rau su hào, cải bắp, lạc và thuốc lá với tổng diện tích 82 ha tại các vùng ngoại thành Hà Nội, Vĩnh Phúc

và tỉnh Hà Tây (cũ), cho hiệu quả phòng trừ sâu khoang và sâu xanh trên lạc

từ 76- 89,6% sau 7- 10 ngày phun Có 2 chế phẩm với tên thương mại là ViSl

và ViHa được đăng ký vào danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng ở Việt Nam

Tại Trung tâm bông Nha Hố, cũng trong các năm 2000-2005, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV cũng được tiến hành khá mạnh mẽ theo phương pháp nuôi sâu kết hợp với thu thập nguồn sâu trên đồng ruộng Sau

đó đem về phòng thí nghiệm lây nhiễm vi rút và nghiền lọc lấy dịch thể chứa

vi rút để sử dụng Trung tâm đã sản xuất được từ 50- 100 lít/năm chế phẩm NPV dạng thô để phòng trừ sâu khoang và sâu xanh hại bông (Viện Bảo vệ thực vật, 2001)

Tại Viện Bảo vệ thực vật, việc sản xuất chế phẩm NPV đề phòng trừ sâu đo xanh hại đay và sâu róm hại thông bằng 2 cách: Cách 1 là nuôi sâu non đến tuổi 3- 4 thì nhiễm NPV và thu hồi sâu chết, nghiền lọc lấy dịch đem sử dụng hoặc tạo dạng chế phẩm khô; Cách 2: thu sâu non ngoài đồng về nhiễm

vi rút, rồi nghiền lọc và đem sử dụng (Nguyễn Văn Cảm và cs., 1996; Trương Thanh Giản và cs., 1996; Hoàng Thị Việt và cs., 2002)

Tại Viện Sinh học nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh cũng đã sản xuất được 3 loại chế phẩm vi rút NPV là chế phẩm vi rút NPV sâu xanh (NPV.Ha), đạt 3-5x108 PIB/ml, chế phẩm vi rút NPV sâu khoang (NPV.Sl), đạt 3-5x108PIB/ml và chế phẩm vi rút sâu xanh da láng (NPV.Se), đạt 3-5x108 PIB/ml (Phạm Thị Thùy, 2008)

Các chế phẩm virus sâu xanh (NPV.Ha) trừ sâu xanh đục quả bông ở Ninh Thuận, Sơn La và sâu đục quả đậu, chế phẩm vi rút sâu khoang

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24

(NPV.Sl) trừ sâu khoang hại rau, chế phẩm virus sâu keo da láng (NPV.Se) trừ sâu keo da láng hại hành, tỏi, v.v có hiệu quả phòng trừ các loại sâu hại trên diện tích vài trăm ha, tập trung ở Ninh Thuận, Vĩnh Phúc, Hải Phòng và Thanh Hóa vào năm 1992- 2004 (Phạm Thị Thùy, 2008)

Tuy nhiên, vào các năm sau đó thì các đơn vị này đều không sản xuất chế phẩm NPV tại chỗ, mà chuyển giao hướng dẫn kỹ thuật cho nông dân cách thu thập sâu non sâu khoang, sâu xanh bị nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng Đem về nhà nghiền lọc, rồi đem sử dụng để phòng trừ các sâu này trên ruộng của chính mình Hoạt động đó đã góp phần nâng cao đáng kể nhận thức và kỹ thuật cho nông dân trong việc sử dụng nguồn lợi vi rút tự nhiên để phòng chống sâu hại

Theo Trần Thị Kiều Trang và cs (2002) khi nghiên cứu nồng độ sử dụng vi rút NPV để phòng trừ sâu hại cây trồng ở các ngày tuổi khác nhau thì kết quả cho thấy sau 2 ngày tuổi nhiễm vi rút NPV sâu sẽ bị nhiễm nhanh gấp 1.500.000 lần so với sâu ở 8 ngày tuổi, thời gian yêu cầu để 50% sâu chết gia tăng với tuổi sâu, sự kết hợp NPV với một số thuốc hóa học ở liều lượng cực nhỏ cho thấy có kết quả tốt như trong trường hợp NPV kết hợp với Actara và Diflubenzuon cho tác dụng bổ trợ tăng phần trăm tỷ lệ chết của sâu và thời gian gây chết được rút ngắn hơn so với sử dụng NPV đơn độc, tuy nhiên đối với sự kết hợp NPV và Imidacloprid cho tác dụng bổ trợ ở nồng độ thấp từ 1- 77ppm và tác dụng đối kháng nếu nồng độ Imidacloprid trên 7ppm (Trần Thị Kiều Trang và Chaudhari, 2002)

Tìm hiểu từ các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước đã thu thập được cho thấy:

+ Ở nước ngoài: Việc nghiên cứu về vi rút côn trùng nói chung và vi rút sâu hại nói riêng được tiến hành từ rất lâu và trên nhiều khía cạnh khác nhau, như thành phần, đặc điểm hình thái, sinh học sinh thái và cơ chế xâm nhiễm, gây chết côn trùng của vi rút NPV Đặc biệt, các nước như Trung

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25

Quốc, Ấn độ, Mỹ, Anh, Pháp, Brasin, v.v phát triển mạnh việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học vi rút NPV qui mô công nghiệp theo hướng ứng dụng công nghệ nuôi nhân tế bào (Boguslaw và cs., 2011)

+ Tại Việt Nam: Do điều kiện trang thiết bị chưa có điều kiện đáp ứng cho nghiên cứu chuyên sâu, nhất là trong nghiên cứu về vi rút nói chung và nghiên cứu NPV nói riêng Đồng thời, việc nghiên cứu sản xuất ứng dụng NPV trong phòng trừ sâu hại cây trồng mới chỉ tập trung trong nghiên cứu khảo sát, đánh giá tiềm năng của tác nhân vi rút NPV, sản xuất tạo chế phẩm theo hướng thủ công với yêu cầu kỹ thuật công nghệ không quá cao Tuy nhiên, định hướng nghiên cứu khai thác nguồn vi rút NPV đã được quan tâm nhiều trong những năm gần đây

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 Đối tượng, phạm vi và dụng cụ, hóa chất, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các mẫu sâu khoang nhiễm vi rút được thu thập ngoài đồng ruộng

- Nguồn vi rút NPV được phân lập từ sâu nhiễm bệnh thu ngoài đồng

- Dòng tế bào sâu khoang phân lập từ mô tiền phôi của trưởng thành

sâu khoang và nhân nuôi trong phòng thí nghiệm

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài tập trung nghiên cứu thu thập, chọn lọc nguồn vi rút NPV có hoạt lực trừ sâu khoang cao và đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố như: môi trường, nhiệt độ, pH, v.v đến mức độ lây nhiễm của vi rút NPV trên tế bào sâu khoang đã nhân nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm

2.1.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

+ Dụng cụ nuôi sâu: lồng nuôi sâu, chậu nhựa, khay nhựa, đĩa petri, bô

can, ống tuýp, pank, kéo, chổi lông, giấy thấm, bông thấm nước,

+ Các dụng cụ phục vụ cho nuôi cấy, như: pipet các mức, đầu côn các

loại, ống falcon loại 50ml và 15ml, khay 12 giếng, bình nuôi cấy lọc khuẩn loại 25 cm2, v.v

+ Các loại hóa chất dùng phân lập vi rút: SDS (Sodium Dodecyl

Sulfate), Tryphto broth, Na2CO3, NaOH, nước cất hai lần, v.v

+ Các loại môi trường: Môi trường nuôi nhân tế bào và các môi trường

phụ trợ trong nuôi nhân của hãng In-vitrogen (Mỹ) cung cấp Bao gồm ExcellTM 420 serum free (Sigma), Schneider (Sigma), TC - 100 BML-TC/10 (Sigma), TNM- FH (Sigma), IPL-41 (Sigma), Grace (Gibco), v.v Huyết thanh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27

Fetal bovine serum (FBS) (Gibco), photphatse buffer saline pH 7,2 (1X) (PBS) (Gibco), dimethyl sulfoxide 10% (DMSO) (Gibco), trypan blue 0.4%, trypsin-EDTA 10X (Gibco), v.v

+ Các loại kháng sinh đặc dụng: Kháng sinh Gentamicine (50mg/ml)

(Gibco), Streptomycin (1gram), Penicilin (1.000.000 IU), kháng nấm Fungizone (250µg/ml) (Gibco), dung dịch KCl 0,001% Các hóa chất có liên quan như: cồn 70%

+ Các thiết bị phục vụ thí nghiệm: Buồng cấy vô trùng (Mỹ), máy lắc

để bàn N-Biotek (Hàn Quốc), máy li tâm 3.000 vòng/phút (Nhật), tủ nuôi tế bào Binder (Mỹ), tủ lạnh sâu -800C (Mỹ), tủ lạnh thường, micropipette các loại 200µl, 1ml, 2ml, 5ml, kính hiển vi soi nổi Zeiss (Đức), kính hiển vi soi ngược Nikon Ti-U (Nhật Bản), kính hiển vi quang học (Nhật), buồng đếm hồng cầu (Đức) v.v

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài thực hiện tại Trung tâm Đấu tranh sinh học, Viện Bảo vệ thực vật, phường Đức Thắng, quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội

Đề tài được thực hiện từ tháng 10/2013 đến 10/2014

2.2 Nội dung nghiên cứu của đề tài

2.2.1 Nghiên cứu phân lập, làm thuần và chọn lọc tạo thực liệu vi rút NPV

có hoạt lực cao đối với sâu khoang

- Thu thập nguồn thực liệu sâu non sâu khoang nhiễm vi rút NPV ngoài đồng ruộng

- Phân lập và đánh giá, chọn lọc nguồn vi rút NPV sâu khoang có hoạt lực trừ sâu khoang cao

2.2.2 Đánh giá hiệu lực gây chết sâu non sâu khoang của các nguồn NPV

đã được lựa chọn

- Đánh giá hiệu lực gây chết sâu non sâu khoang của các nguồn vi rút NPV đã được chọn lọc

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28

- Đánh giá hiệu lực gây chết sâu non sâu khoang của các nguồn vi rút NPV chọn lọc đã được nuôi nhân trên tế bào sâu khoang

2.2.3 Lây nhiễm nhân tạo vi rút NPV trên tế bào sâu khoang

- Xác định nồng độ tế bào thích hợp cho lây nhiễm

- Xác định nồng độ vi rút thích hợp cho lây nhiễm

- Xác định thời gian ủ lây nhiễm vi rút thích hợp

- Xác định môi trường lây nhiễm vi rút thích hợp

- Xác định nhiệt độ thích hợp cho lây nhiễm

- Xác định pH lây nhiễm vi rút thích hợp

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu phân lập, làm thuần và chọn lọc tạo thực liệu vi rút NPV

có hoạt lực cao đối với sâu khoang

Các thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp đã được chỉ dẫn của Grzywacz D và cs (1996) Ngoài ra, có tham khảo thêm phương pháp của các tài liệu khác (Chen và Yao, 1996; Federici, 1997; Lynn, 2003)

2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Thu thập, phân lập sâu khoang nhiễm NPV ngoài đồng

Địa điểm thu thập mẫu sâu khoang bị bệnh được thực hiện tại Đông Anh, Mê Linh và Tân Phong Sâu bị bệnh sau khi thu thập được đem về phòng thí nghiệm tại Trung tâm Đấu tranh sinh học, viện Bảo vệ thực vật để tiến hành phân lập

Phương pháp phân lập vi rút NPV được tiến hành như sau:

- Nguồn sâu nhiễm bệnh NPV tự nhiên ngoài đồng ruộng được đem về phòng xử lý sơ bộ qua cồn, nghiền lọc và ly tâm trong dung dịch SDS 0,1% hoặc ngâm nước sau 10 ngày

- Sau đó, tiến hành ly tâm với tốc độ 1.500 vòng/phút trong thời gian 10 phút, thu phần cặn lắng, lọc bỏ bã và phần dịch nổi bên trên

- Bổ sung nước cất và lắc trong 5 phút, ly tâm 1500 vòng/phút trong 10

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29

phút Sau đó lặp lại bước ly tâm từ 1-2 lần nữa

- Thu cặn, bỏ phần dịch nổi, bổ sung dung dịch SDS 0,1%, lắc trong 5 phút, sau đó ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 10 phút

- Bỏ phần dịch nổi, thu phần cặn lắng, bổ sung nước cất 2 lần, lắc trong 5 phút, ly tâm 1500 vòng/phút trong 10 phút

- Bỏ phần dịch nổi, thu phần cặn,bổ sung dung dịch SDS 0,1%, lắc trong

5 phút, sau đó ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 10 phút

- Bỏ phần dịch nổi, thu phần cặn lắng, bổ sung nước cất 2 lần, lắc trong

- Sau ly tâm thu phần cặn màu trắng

Sau khi phân lập được nguồn vi rút NPV thu được từ sâu khoang nhiễm bệnh ngoài đồng ruộng, tiến hành nhiễm trở lại trên sâu khỏe được nuôi nhân bằng thức ăn sạch Hàng ngày kiểm tra tình hình nhiễm bệnh của sâu và thu các mẫu sâu nhiễm vi rút NPV điển hình

Theo dõi hàm lượng thể vùi và tỷ lệ sâu chết sau các ngày nhiễm vi rút trên sâu bị nhiễm bệnh NPV

Phương pháp xác định hàm lượng thể vùi

Tiến hành dùng micropipet lấy 1ml dịch thể vùi của vi rút NPV sau khi

đã được phân lập rồi pha loãng từ 2- 3 lần tùy theo hàm lượng thể vùi nhiều hay ít Sau đó nhuộm màu bằng Tryphan Blue và kiểm tra mật độ thể vùi trên buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi Đếm số lượng thể vùi có trong 5 ô nhỏ rồi tính trung bình Sau đó tính hàm lượng tế bào theo công thức như sau:

Hàm lượng thể vùi (OB/ml) = (a x 4000 x 1000)/H