Bước đầu tìm hiểu sự đề kháng kháng sinh từ các vi khuẩn trong môi trường

MỤC LỤC Trang Trang tựa Error! Bookmark not defined Nhận xét giáo viên hướng dẫn Error! Bookmark not defined Lời cảm tạ iii Tóm tắt luận văn Error! Bookmark not defined Mục lục i Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách bảng x Danh sách hình xi Danh sách sơ đồ xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích .2 1.3 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN 2.1 Vi khuẩn môi trường .3 2.1.1 Vai trò vi khuẩn môi trường 2.1.2 Giới thiệu số vi khuẩn môi trường 2.1.2.1 Acinetobacter spp 2.1.2.2 Aeromonas spp 2.1.2.3 Pseudomonas spp 2.1.2.4 Stenotrophomonas maltophilia 12 2.2 Giới thiệu sơ lược kháng sinh 13 2.2.1 Khái niệm 13 2.2.2 Các nhóm thuốc kháng sinh 14 2.2.2.1 Nhóm beta - lactam 14 2.2.2.2 Nhóm aminoglycoside 15 2.2.2.3 Nhóm polypeptide 15 2.2.2.4 Nhóm tetracycline 16 2.2.2.5 Nhóm phenicol 16 2.2.2.6 Nhóm macrolide 17 2.2.2.7 Nhóm sulfonamide 17 2.2.2.8 Nhóm diaminopyrimidine 17 2.2.2.9 Nhóm quinolone 18 2.2.2.10 Các nhóm khác 18 2.3 Sự đề kháng kháng sinh 18 2.3.1 Nguyên nhân đề kháng kháng sinh 19 2.3.1.1 Đề kháng tự nhiên 19 2.3.1.2 Đề kháng thu nhận 19 2.3.2 Các chế đề kháng kháng sinh vi khuẩn 20 2.3.2.1 Sản xuất enzyme làm bất hoạt kháng sinh 20 2.3.2.2 Ngăn chặn kháng sinh xâm nhập qua thành tế bào .20 2.3.2.3 Thay đổi điểm tác động 20 2.3.2.4 Phát sinh đường chuyển hóa 21 2.3.2.5 Sản xuất nhiều chất cạnh tranh với kháng sinh 21 2.3.2.6 Đề kháng chéo 21 2.4 Các phương pháp xác định độ mẫn cảm vi khuẩn kháng sinh .21 2.4.1 Phương pháp định tính 21 2.4.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết phản ứng 21 2.4.1.2 Chọn lựa đĩa kháng sinh .23 2.4.1.3 Quy trình kiểm tra chất lượng 23 2.4.2 Phương pháp định lượng 26 2.5 Những nghiên cứu liên quan đến đề kháng kháng sinh môi trường 27 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 3.1 Thời gian địa điểm .29 3.1.1 Thời gian 29 3.1.2 Địa điểm 29 3.2 Nội dung nghiên cứu tiêu theo dõi 29 3.3 Vật liệu 30 3.3.1 Đối tượng khảo sát 30 3.3.2 Thiết bị dụng cụ 30 3.3.3 Môi trường 30 3.3.4 Các hóa chất 31 3.3.5 Đĩa giấy tẩm kháng sinh 31 3.4 Phương pháp tiến hành 31 3.4.1 Cách lấy mẫu bảo quản mẫu 31 3.4.1.1 Mẫu nước .31 3.4.1.2 Mẫu đất 32 3.4.2 Phân lập chủng vi khuẩn từ môi trường 33 3.4.2.1 Qui trình phân lập Aeromonas spp Pseudomonas spp 33 3.4.2.2 Qui trình phân lập Pseudomonas spp Acinetobacter spp .37 3.4.2.3 Qui trình phân lập Stenotrophomonas maltophilia 39 3.4.3 Thực kháng sinh đồ 41 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 42 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Kết phân lập định danh Aeromonas spp., Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia từ mẫu nước mẫu đất 43 4.1.1 Tỉ lệ phát Aeromonas spp môi trường nước 43 4.1.2 Tỉ lệ phát Acinetobacter spp môi trường nước đất 44 4.1.3 Tỉ lệ phát Pseudomonas spp môi trường nước đất 46 4.1.4 Tỷ lệ phát Stenotrophomonas maltophilia môi trường đất 48 4.1.5 Sự tương thích kết phân lập đề tài với kết kiểm chứng Đại học Tufts, Hoa Kỳ 49 4.2 Kết thực kháng sinh đồ 49 4.2.1 Kết thực kháng sinh đồ gốc Aeromonas spp 50 4.2.2 Kết thực kháng sinh đồ gốc Acinetobacter spp 51 4.2.3 Kết thực kháng sinh đồ gốc Pseudomonas spp 52 4.2.4 Kết thực kháng sinh đồ gốc Stenotrophomonas maltophilia 53 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 5.1 Kết luận .55 5.2 Đề nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Phụ lục 61 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AA : Aeromonas Agar TSI : Tryple Sugar Iron Agar MCK : MacConkey NA : Nutrient Agar Đ/Đ : Đỏ/ Đỏ Đ/NC : Đỏ/ Nguyên chất Đ/V : Đỏ/ Vàng YSA – CN : Yersinia - cefsulodin novobiocin APUA : Alliance for Prudent Use of Antibiotic MHA : Muller – Hinton Agar PBG : Peptone Beef extract Glycogen MIC : Minimal inhibitory concentration MRVP : Methy Red Voges Proskauer DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Phân biệt loài Aeromonas Bảng 2.2 Một số đặc điểm nhóm Aeromonas di động Bảng 2.3 Đặc điểm sinh hóa số loài Pseudomonas 10 Bảng 2.4 Các bệnh cảm nhiễm Pseudomonas động vật 11 Bảng 2.5 Đường kính vòng vô khuẩn 24 Bảng 3.1 Bảng phân bố lấy mẫu nước số lượng mẫu 32 Bảng 3.2 Bảng phân bố lấy mẫu đất 33 Bảng 4.1 Tỉ lệ phát Aeromonas spp loại môi trường nước 44 Bảng 4.2 Tỉ lệ phát Acinetobacter spp loại môi trường nước 45 Bảng 4.3 Tỉ lệ phát Acinetobacter spp môi trường đất 44 Bảng 4.4 Tỉ lệ phát Pseudomonas spp loại môi trường nước 47 Bảng 4.5 Tỷ lệ phát Pseudomonas spp môi trường đất 48 Bảng 4.6 Tỉ lệ phát S maltphilia môi trường đất 48 Bảng 4.7 Sự tương thích kết phân lập đề tài với kết kiểm chứng Đại học Tufts, Hoa Kỳ 49 Bảng 4.8 Kết thực kháng sinh đồ với chủng Aeromonas spp phân lập 50 Bảng 4.9 Kết thực kháng sinh đồ với chủng Acinetobacter spp phân lập 51 Bảng 4.10 Kết thực kháng sinh đồ với chủng Pseudomonas spp phân lập522 Bảng 4.11 Kết thực kháng sinh đồ với chủng Stenotrophomonas maltophilia phân lập 53 DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 3.1 Hình thái vi khuẩn Aeromonas kính hiển vi 35 Hình 3.2 Các phản ứng sinh hóa để phân lập Aeromonas 35 Hình 3.3 Phản ứng di động không di động thạch 35 Hình 3.4 Hình thái vi khuẩn Pseudomonas kính hiển vi 36 Hình 3.5 Các phản ứng sinh hóa phân lập Pseudomonas .36 Hình 3.6 Hình thái vi khuẩn Acinetobacter kính hiển vi 38 Hình 3.7 Các phản ứng sinh hóa phân lập Acinetobacter 39 Hình 3.8 Vi khuẩn S maltophilia mọc gần đĩa kháng sinh 40 Hình 3.9 Phản ứng sinh ure (-) gelatin (+) 41 Hình 4.10 Kết thực kháng sinh đồ 42 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Qui trình phân lập Aeromonas Pseudomonas từ môi trường 33 Sơ đồ 3.2 Qui trình phân lập Pseudomonas spp Acinetobacter spp từ môi trường 37 Sơ đồ 3.3 Qui trình phân lập S maltophilia đất 39 Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vi khuẩn phổ biến tự nhiên, chúng có mặt khắp nơi: đất, nước, không khí, thể động thực vật dạng cộng sinh với sinh vật khác Bên cạnh vi khuẩn gây bệnh chiếm tỉ lệ nhỏ so với tổng số vi khuẩn có môi trường vi khuẩn không gây bệnh có ích chiếm tỉ lệ lớn Hiện nay, tình hình lạm dụng kháng sinh để điều trị nhiễm khuẩn nhân y thú y quan tâm Kháng sinh sử dụng cách bừa bãi: dùng không liều lượng, không khoảng cách lần, dùng không cần thiết, chọn kháng sinh không phù hợp, v.v… Ngoài việc dùng kháng sinh để phòng trị bệnh cho gia súc, nhà chăn nuôi dùng chất kích thích tăng trưởng chăn nuôi nuôi trồng thủy sản Kháng sinh trộn vào thức ăn với nồng độ thấp nhằm giúp thú mau lớn, tăng trọng nhanh gây tích lũy kháng sinh thể thải môi trường bên Điều tạo nên chủng vi khuẩn mang gen kháng thuốc sống sót, nhân lên lan tràn môi trường Hơn nữa, vi khuẩn không gây bệnh hay gây bệnh hội từ tồn trữ tính kháng thuốc truyền lại cho vi khuẩn khác Chính thế, có nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc tăng lên cộng đồng như: Aeromonas spp có nguồn gốc từ môi trường thủy sản, tác nhân lây nhiễm mà ngày mang tính đa kháng thuốc; Staphylococcus aureus đề kháng với penicillin, methicillin, penicillin hệ thứ 3; Acinetobacter baumanii kháng gentamicin, polymixin; Pseudomonas aeruginosa fluoroquinolone, imipenem (Marshall ctv, 2009) kháng ceftazidime, Với mục đích bước đầu tìm hiểu đề kháng kháng sinh với số gốc vi khuẩn phân lập từ môi trường (đất nước), điển hình vi khuẩn: Aeromonas spp., Acinotobacter spp., Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia từ đưa nhận xét tình hình đề kháng kháng sinh gốc vi khuẩn Chúng thực đề tài “Bước đầu tìm hiểu đề kháng kháng sinh từ vi khuẩn môi trường” với đồng ý khoa Chăn Nuôi Thú Y – Trường Đại học Nông Lâm hướng dẫn TS Hồ Thị Kim Hoa, BSTY Lê Hữu Ngọc Nghiên cứu phần nghiên cứu APUA (the Alliance for Prudent Use of Antibiotic - tổ chức nghiên cứu vấn đề đề kháng kháng sinh) xây dựng phát triển liệu mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn cộng sinh – nơi tồn trữ gen kháng kháng sinh 1.2 Mục đích Phân lập số vi khuẩn (Aeromonas spp., Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia) môi trường xác định mức độ đề kháng kháng sinh gốc vi khuẩn phân lập theo phương pháp khuếch tán thạch 1.3 Yêu cầu Thu thập mẫu nước thải chăn nuôi, nước ao nuôi cá, nước sông, mẫu đất trồng rau cỏ gần khu vực chăn nuôi từ tỉnh Tp Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Long An, Bình Dương, Tiền Giang, Tây Ninh Phân lập giữ gốc vi khuẩn: Aeromonas spp., Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia Thử kháng sinh đồ với gốc vi khuẩn phân lập Chương TỔNG QUAN 2.1 Vi khuẩn môi trường 2.1.1 Vai trò vi khuẩn môi trường Vi khuẩn môi trường tồn nhiều dạng khác nhau, vi khuẩn gây bệnh, vi khuẩn có lợi vi khuẩn hội Vi khuẩn gây bệnh chiếm tỷ lệ nhỏ đóng vai trò quan trọng gây nhiều ý cộng đồng Do việc sử dụng kháng sinh để phòng điều trị bệnh nhiễm khuẩn cách bừa bãi mà gây xuất nhiều chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh tạo nên nguy hiểm cho toàn cầu Từ gây khó khăn công tác điều trị nhân y thú y Vi khuẩn phát tán lan truyền gen đề kháng vào môi trường nhiều cách Như nguồn nước thải ô nhiễm từ trại chăn nuôi không xử lý; ngấm vào đất, mạch nước ngầm, thải vào ao nuôi cá, thải sông Hoặc phân bón động vật nguồn hỗn hợp chất dinh dưỡng hữu vô cho nông nghiệp nitơ, phospho; nhiên phân động vật chứa thành phần hóa học khác kim loại nặng, kích thích tố, hợp chất kháng khuẩn mà có từ thức ăn chăn nuôi cách sử dụng thuốc thú y Từ dẫn đến việc gia tăng số lượng vi khuẩn đề kháng kháng sinh môi trường Bên cạnh đó, vi khuẩn sống đất nước tham gia tích cực vào trình phân giải xác hữu biến chúng thành CO2 hợp chất vô dùng làm thức ăn cho trồng Các vi khuẩn cố định nitơ thực việc biến khí nitơ (N2) không khí thành hợp chất nitơ (NH3, NH4) cung cấp cho trồng Vi khuẩn có khả phân giải hợp chất khó tan chứa P, K, S tạo vòng tuần hoàn tự nhiên như: chu trình cacbon, nitơ, phospho lưu huỳnh Chúng tham gia vào việc phân giải chế phẩm công nghiệp, phế thải đô thị có vai trò quan trọng việc bảo vệ môi trường Ví dụ: Pseudomonas có Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian thực đề tài “Bước đầu tìm hiểu đề kháng kháng sinh từ vi khuẩn môi trường” có kết luận sau: - Phân lập thành công vi khuẩn Aeromonas spp., Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia theo qui trình APUA cung cấp điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam với tỷ lệ phân lập Aeromonas spp môi trường nước 45,16%; Acinetobacter spp môi trường nước 70,97% đất 74,3%; Pseudomonas spp môi trường nước 32,26% đất 12,82%; S maltophilia môi trường đất 51,28% Và tương thích kết luận định danh đạt 90,63% so với kiểm định phòng thí nghiệm Đại học Tufts, Hoa Kỳ - Trong gốc Aeromonas spp phân lập nhạy cảm cao với nitrofurantoin, chloramphenicol, gentamicin, ciprofloxacin, doxycycline (100%) lại nhạy cảm với ampicillin 15,4%, cephalexin 46,2% Các gốc Acinetobacter spp nhạy cảm cao với gentamicin, doxycycline (98%), ciprofloxacin 96%, tetracycline 90,2% nhạy cảm với nitrofurantoin 29,4%, ampicillin 25,5%, rifampicin 31,4%, cephalexin 31,4%, chloramphenicol 45,1% Các gốc Pseudomonas spp nhạy cảm với ciprofloxacin 100%, doxycycline 94,1%, gentamicin 88,2% đề kháng cao với kháng sinh như: nitrofurantoin 100%, ampicillin 100%, cephalexin 88,2%, rifampicin 82,4%, trimethoprim/ sulfamethoxazole 64,7%, chloramphenicol 64,7% Các gốc S maltophilia nhạy cảm cao với ciprofloxacin, doxycycline (100%), tetracycline 90% đề kháng với cephalexin 100%, nitrofurantoin 95%, ampicillin 60%, rifampicin 55% 55 5.2 Đề nghị - Có số gốc vi khuẩn sau thời gian giữ giống điều kiện ngăn đá tủ lạnh bị chết, Aeromonas spp Do nên cẩn thận thao tác cần có tủ lạnh – 800C để đảm bảo - Cần có test sinh hóa cho kết xác như: API test - Chưa định danh đến loài mà xác định đến chủng - Qua việc thực kháng sinh đồ với số chủng phân lập từ môi trường cho thấy mức độ đề kháng cao số kháng sinh như: ampicillin, cephalexin, nitrofurantoin Điều cho ta thấy cần có quản lý chặc chẽ việc sử dụng kháng sinh để tránh gia tăng đề kháng kháng sinh môi trường 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học thủy sản - Phần - Bệnh truyền nhiễm động vật thủy sản Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản Đào Thị Thanh Huê, 2009 LVTN Tìm hiểu khả gây bệnh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens cá tra Luận văn tốt nghiệp đại học Khoa Thủy Sản trường Đại học Nông Lâm t.p Hồ Chí Minh, Việt Nam Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2009 Bài giảng Hóa Dược Trường Đại Học Nông Lâm, Tp HCM Lương Đức Phẩm, 2009 Cơ Sở Vi Sinh Trong Công Nghệ Bảo Vệ Môi Trường Nhà xuất giáo dục 572 trang Nguyên Công Tráng, 2007 Phân lập định danh vi khuẩn ếch Thái Lan bệnh Luận văn tốt nghiệp đại học Khoa Thủy Sản trường Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Đức Lượng, 2004 Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học tập Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp HCM Nguyễn Hoàng Thu Trang, 2007 Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn tính đề kháng kháng sinh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa nước uống Luận văn tốt nghiệp đại học Khoa Công Nghệ Sinh trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Tô Minh Châu, Trần Thị Bích Liên, 2001 Bài giảng vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Trường Đại Học Nông Lâm, Tp HCM Trần Linh Thước, 2004 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nhà xuất giáo dục 232 trang 10 Trần Thị Thu Hằng, 2003 Dược lực học Tái lần thứ Nhà xuất y học 738 trang 57 11 Võ Thị Chi Mai Ngô Thị Quỳnh Hoa, 2004 Nhiễm khuẩn Stenotrophomonas maltophilia (1999 – 2002) Tạp chí Y học, Tập 8, Số 1: 36 – 38 12 Võ Thị Trà An, 2007 Kháng sinh cho vật nuôi Nhà xuất Đà Nẵng 184 trang Tài liệu nước Abulhamd A T, 2009 Characterization of Aeromonas hydrophila Isolated from Aquatic Environments Using Phenotypic and Genotyping Methods Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 5(6): 923-931 Alexander M, Ismail F, Jackman P J H, Noble W C, 1984 Fingerprinting Acinetobacter Strains From Clinical Sources by Numerical Analysis of Electrophoretic Protein Patterns J Med Microbiol – vol 18 (1984) 55-64 Auling G, Pilz F, Busse H J, Karrasch S, Streichan M, Schon G (1991) Analysis of The Polyphosphate-accumulating Microflora in Phosphorus-eliminating, Anaerobic-aerobic Activated Sludge Systems by Using Diaminopropane as a Biomarker for Rapid Estimation of Acinetobacter spp Appl Environ Microbiol 57:3585-3592 Baquero F, Martine JL, Canton R, 2008 Antibiotics and antibiotic resistance in water environment Current Opinion in Biotechnology 2008, 19:260–265 Baumann P, 1968 Isolation of Acinetobacter from Soil and Water Journal of Bacteriology, July 1968, p 39-42 Bergey D H, Holt J H, 1994 Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Berg G, Roskot N, and Smalla K, 1999 Genotypic and Phenotypic Relationships between Clinical and Environmental Isolates of Stenotrophomonas maltophilia Journal of Clinical Microbiology Nov 1999, p 3594–3600 Bifulco J M, Shirey J, and Bissonnette G K, 1989 Detection of Acinetobacter spp in Rural Drinking Water Supplies Applied and Environmental Microbiology, Sept 1989, p 2214-2219 58 Bollet C, Regli A D, and Micco P D, 1995.A Simple Method for Selective Isolation of Stenotrophomonas maltophilia from Environmental Samples Appl Environ Microbiol 61:1653-1654 10 Boswell C D, Dick R E, Eccles H, Macaskie LE (2001) Phosphate Uptake and Release by Acinetobacter johnsonii in Continuous Culture and Coupling of Phosphate Release to Heavy Metal Accumulation J Ind Microbiol Biotechnol 26:333-340 11 Collins C H, Lyne P M Grange J M, 1989 Collins and Lyne’s Microbiological Methods 12 Dworkin M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer K H, Stackebrandt E, 2006 The Prokaryotes A Handbook on the Biology of Bacteria Volume 6: Proteobacteria: Gamma Subclass p1193 13 Francisco R, Alpoim M C, Morais P V (2002) Diversity of ChromiumResistant and -Reducing Bacteria in a Chromium-Contaminated Activated Sludge J Appl Microbiol 92:837-43 14 Freney J, Hansen W, Etienne J, Vandenesch J and Fleurette' J, 1988 Postoperative Infant Septicemia Caused by Pseudomonas luteola (CDC Group Ve1) and Pseudomonas oryzihabitans (CDC Group Ve-2) Journal of Clinical Microbiology, June 1988, p 1241-1243 15 Goñi-Urriza M, Pineau L, Capdepuy M, Roques C, Caumette P and Quentin C, 2000 Antimicrobial resistance of mesophilic Aeromonas spp isolated from two European rivers Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2000) 46, 297-301 16 Haleem D A E, 2003 Acinetobacter: Environmental and Biotechnological Applications African Journal of Biotechnology Vol (4), p 71-74, April 2003 17 Harris N B, Rogers D G, 2001 Septicemia associated with Stenotrophomonas maltophilia in a West African dwarf crocodile (Osteolaemus tetraspis subsp tetraspis) J Vet Diagn Invest 13:255–258 (2001) 59 18 Idomir M, Nemet C, Pascu A, Ardeleanu M, 2009 Acinetobacter spp – Pathogenic Role and Resistance to Antibiotics Bulletin of the Transilvania University of Brasov Vol (51) – 2009 Series VI: Medical Sciences 19 Miles D Kerr K G, 1998 Microbiological and Clinical Aspects of Infection Associated with Stenotrophomonas maltophilia Journal of Clinical Microbiology, Nov 1999, p 3594–3600 20 Monfort P and Baleux B, 1991 Distribution and survival of motile Aeromonas spp in brackish water receiving sewage treatment effluent Appl Environ Microbiol 57(9):2459-2467 21 Palleroni N J 1992 Present situation of the taxonomy of aerobic pseudomonads In:E Galli, S Silver, and B Witholt (Eds.) Pseudomonas: Molecular Biology and Biotechnology ASM Press Washington, DC 105–115 22 Percival S L, Chalmers R M, Embrey M, Hunter P R, Sellwood J, Jones P W, 2004 Microbiology of Waterborne Diseases p 24 23 Quinn P.J, Carter M E, Markey B K, Cater G R, 1998 Clinical Veterinary Microbiology 24 Qureshi A, Mooney L, Denton M, Kerr G K, 2005 Stenotrophomonas maltophilia in Salad Emerging Infectious Diseases www.cdc.gov/eid Vol 11 25 Uchino M, Kosako Y, Uchimura T and Komagata K, 2000 Emendation of Pseudomonas straminea Iizuka and Komagata 1963 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2000), 50, 1513–1519 26 Vicent A D et al, 1989 Serotypes and Pyocin Types of Pseudomonas aeruginosa Isolated from Natural Waters Letters in Applied Microbiology 1990, p 77-80 27 Wagner M, Erhart R, Manz W, Amann R, Lemmer H, Wedi D, Schleifer KH (1994) Development of an rRNA-targeted Oligonucleotide Probe Specific for The Genus Acinetobacter and Its Application For In Situ Monitoring in Activated Sludge Appl Environ Microbiol 60:792-800 60 Phụ lục Dung dịch đệm phosphate (APUA, 2009) Dung dịch đệm 0.04M KH2PO4 Na2HPO4 (pH 6.0) 4,79 g KH2PO4 0,681 g Na2HPO4 Hòa tan l nước cất Môi trường tăng sinh • Môi trường Baumann’s (APUA, 2009) Pha theo thành phần Sodium acetate 2g KNO3 2g MgSO4 7H2O 0.2g Hòa tan 1lít dung dịch đệm 0.04M KH2PO4Na2HPO4 (pH 6.0) Sau đem hấp tiệt trùng 1210C/15phút • Môi trường BHI_Oxoid_CM0225 (Môi trường đông khô) Cân 37g môi trường khô pha vào 1000 ml nước cất, đun nhẹ cho tan Cho vào ống nghiệm, ống 0.5 ml, hấp tiệt trùng 1210C/ 15 phút Môi trường dinh dưỡng • Môi trường canh NB_Oxoid_CM0067 có bổ sung methionine Khuấy tan 13g môi trường đông khô NB thêm 50mg methionine 1000ml nước cất Đun sôi để hòa tan hoàn toàn môi trường Hấp tiệt trùng autoclave 1210C/ 15phút • Môi trường NA_Oxoid_CM0003 (Môi trường đông khô) Cân 28g môi trường khô pha với 1000 ml nước cất, đun cách thủy cho tan agar (hoặc đun microwave) Sau đem hấp tiệt trùng 1210C/15 phút, lấy để môi trường nguội khoảng 450C, lắc trước đổ vào đĩa petri tiệt trùng (khoảng 18 – 20 ml/đĩa) Môi trường phân lập • Môi trường MacConkey_Himedia_M082 (Môi trường đông khô) 61 Cân 55g môi trường khô hòa tan 1000ml nước cất Đun sôi để hòa tan hoàn toàn môi trường Sau hấp tiệt trùng autoclave 1210C/15 phút, lấy để nguội đến nhiệt độ khoảng 450C, lắc trước đổ vào đĩa petri tiệt trùng • Môi trường Aeromonas Agar_LABM_Lab 167 (Môi trường đông khô) Cân 45,5g môi trường cho vào 1(l) nước cất hấp tiệt trùng autoclave Để cho ngấm 10 phút, lắc trộn lẫn tiệt trùng cách đun sôi cách thủy đến agar tan hoàn toàn Lấy để nguội khoảng 470C, lắc đổ vào đĩa petri tiệt trùng Đây môi trường chọn lọc cho phân lập Aeromonas spp • Môi trường CHROMagar™ Acinetobacter agar (Notice 090910) (Môi trường đông khô) Môi trường bao gồm phần: thành phần (X096B) chất bổ sung (X096S) Có pH 6,9 ± 0,2 Cân 32,8g môi trường đông khô (X096B) vào 1(l) nước cất hấp tiệt trùng Sau thêm vào (g) chất bổ sung vào, lắc đun cách thủy agar tan hoàn toàn Lấy để nguội khoảng 500C, lắc đổ vào đĩa petri tiệt trùng Môi trường thực kháng sinh đồ • Mueller Hinton Agar_Himedia_M173 (Môi trường đông khô) Cân 38g môi trường hòa tan với 1(l) nước cất, đem hấp tiệt trùng 1210C/ 15 phút, sau đổ vào đĩa petri tiệt trùng autoclave đĩa 20 ml/ đĩa có đường kính 90 mm Môi trường thử nghiệm phản ứng sinh hóa • Phản ứng catalase Dùng dung dịch hydrogen peroxide (H2O2) 30% Kết quả: dương tính có tượng sủi bọt khí O2 tạo Ngược lại âm tính sủi bọt khí • Phản ứng Indol Thành phần: Tryptone 10g Sodium Chloride 5g 62 Pha với 1000 ml nước cất cho vào ống nghiệm, ống ml đậy nút lại Sau hấp tiệt trùng 1210C/15 phút Thuốc thử: Kovac’s cân theo chất sau: Paradimethylaminobenzadehyde 5g Isoamyl ahcohol 75ml Hydrochloride acid 25ml Kết quả: dương tính có xuất lớp màu đỏ bề mặt môi trường Ngược lại âm tính có màu vàng thuốc thử bề mặt môi trường • Phản ứng MRVP Thành phần Buffered Peptone 7g Dextrose 5g Dipotassium phosphate 1.5g Thuốc thử: a MR (Methyl Red) cân chất sau: Methyl Red 0.04g Ethanol 60ml b.VP (Voges – Proskauer) cân chất sau: α _Napthol 5g Alcohol 100ml c KOH 40% cân chất sau: Kalihydroxide (KOH) 40g Nước cất 100ml Kết quả: Phản ứng MR: dương tính môi trường có màu đỏ Ngược lại âm tính có màu vàng Phản ứng VP: dương tính môi trường có màu đỏ Ngược lại âm tính bề mặt môi trường không đổi màu 63 • Phản ứng citrate (Simmons Citrate Agar_Himedia_M099) Cân 24,2g môi trường khô pha với 1000ml nước cất Đun cách thủy cho tan agar (hoặc đun microwave khoảng phút), cho vào ống nghiệm, ống 3ml đậy nút lại Hấp tiệt trùng 1210C/ 15phút Hấp xong đặt ống nghiệm nằm nghiêng 150, cho môi trường đông lại Lưu ý: môi trường phải chuẩn bị trước sử dụng 24 Kết quả: dương tính môi trường chuyển sang màu xanh dương Ngược lại âm tính môi trường giữ nguyên màu • Phản ứng TSI (Triple Sugar Iron Agar_Oxoid_CM0003) Cân 64,6g môi trường pha với 1000 ml nước cất Đun cách thủy cho tan hoàn toàn agar (hoặc đun microwave khoảng phút), sau cho vào ống nghiệm, ống 5ml đậy nút lại Hấp tiệt trùng 1210C/ 15 phút Hấp xong đặt ống nằm nghiêng 250C, cho môi trường đông lại Lưu ý: Môi trường phải chuẩn bị trước sử dụng 24 Kết quả: có trường hợp - Đỏ/ Đỏ: vi khuẩn không lên men loại đường mà sử dụng peptone - Đỏ/Vàng: vi khuẩn lên men đường glucose, sử dụng peptone - Vàng/Vàng: vi khuẩn lên men glucose, lactose và/ sucrose Nếu có khí H2S xuất màu đen ống nghiệm Nếu có gas làm cho thạch nứt • Phản ứng Oxidase Phản ứng cần dung dịch 1% tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride Hoặc mua giấy tẩm sẵn tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride Nam Khoa để thử Kết quả: dương tính xuất màu xanh dương đậm Ngược lại không xuất màu xanh phản ứng âm tính Lưu ý: dung dịch nuôi cấy lâu cho kết không xác hoạt tính oxidase bị kìm hãm đường 64 • Phản ứng nitrate Thành phần: Beef Extract 3.0g Peptone 5.0g Potassium Nitrate 1.0g Cân 9.0g 1000 ml nước cất Đun sôi để tan hoàn toàn, cho vào ống nghiệm, ống 3ml đậy nút lại Hấp tiệt trùng 1210C/ 15 phút Thuốc thử a Dung dịch Sulphanilic acid (dung dịch A) Hòa tan 8g sulphanilic acid 1l acid acetic 5N b Dung dịch Alpha – naphthylamine (dung dịch B) Hòa tan 5g Alpha – naphthylamine 1l acid acetic 5N Kết quả: dương tính môi trường chuyển sang màu hồng Ngược lại dương tính môi trường không chuyển màu • Phản ứng tan chảy gelatinase (Collins Lyne, 1989) Môi trường NA có thêm 5% gelatine Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy vuông góc vào đĩa, ủ từ 18 – 24 nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn, sau cho dung dịch ammonium sulphate bão hòa vào Kết quả: dương tính xuất vòng sáng xung quanh khuẩn lạc khuẩn sản xuất gelatinase Ngược lại âm tính không xuất vòng sáng • Phản ứng urease (Urease _Himedia) Cân 1,87g hòa tan 90 ml nước cất Hấp tiệt trùng 1210C/ 15 phút Sau để nguội đến nhiệt độ 500C cho thêm vào ml urease 40% lắc hút vào ống nghiệm tiệt trùng 3ml Hoặc mua test MIU Nam Khoa để kiểm tra Kết quả: dương tính môi trường chuyển sang màu đỏ cánh sen Ngược lại phản ứng dương tính môi trường không đổi màu • Phản ứng di động Thành phần: Tryptone 10g NaCl 5g 65 Agar No.1 (Oxoid_LP0011) 3g Cân 18g hòa tan 1(l) nước cất Đun cách thủy cho tan agar (hoặc đun microwave khoảng phút) Hấp tiệt trùng 1210C/ 15 phút Sau đổ vào đĩa hấp tiệt trùng autoclave Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy vuông góc vào đĩa, ủ nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn quan sát di động theo mức độ thời gian từ 8, 12, 16, 24 Kết quả: dương tính vi khuẩn mọc lan xung quanh chỗ cấy Ngược lại âm tính vi khuẩn không mọc lan xung quanh Nhuộm Gram Cách tiến hành gồm bước sau: - Nhỏ nước hấp tiệt trùng lên phiến kính Tạo huyền phù vi khuẩn với giọt nước hơ nhẹ phiến kính để cố định mẫu - Phủ hoàn toàn vết bôi với thuốc nhuộm crystal violet Để yên 30 giây rửa trôi thuốc nhuộm dư nước - Phủ vết bôi với dung dịch iodine khoảng 30 giây lại rửa với nước - Rửa vết bôi nhanh qua cồn giây - Phủ hoàn toàn vết bôi với thuộc nhuộm Fuschin 30 giây rửa lại với nước - Thấm khô phiến kính Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát kính hiển vi với giọt dầu 66 Kết xử lý trắc nghiệm Chi – Square (a)So sánh tỷ lệ phát Aeromonas (b)So sánh tỷ lệ phát Pseudomonas spp loại môi trường nước spp loại môi trường nước CO NA KHONG Total 10 14 6.32 7.68 co khong Total NA 11 14 4.52 9.48 NC 4.97 6.03 11 NC 3.55 7.45 11 NS 2.71 3.29 NS 1.94 4.06 Total 14 17 Total 10 21 31 31 Chi-Sq = 0.509 + 0.242 + 1.694 + 0.807 + 0.452 + 0.215 = 3.919 DF = 2, P-Value = 0.14 Chi-Sq = 2.139 + 1.761 + 1.773 + 1.460 + 0.186 + 0.153 = 7.472 DF = 2, P-Value = 0.024 (c) So sánh tỷ lệ phát Acinetobacter (d) So sánh tỷ lệ phát Acinetobacter spp nước đất spp loại môi trường nước co khong Total NA 13 14 9.94 4.06 Co Khong Total Nước 22 31 22.59 8.41 NC Đất 29 10 28.41 10.59 7.81 NS 3.19 4.26 1.74 11 Total 51 19 39 70 Chi-Sq = 0.015 + 0.041 + 0.012 + 0.032 = 0.100 DF = 1, P-Value = 0.751 Total 22 31 Chi-Sq = 0.945 + 2.311 + 2.959 + 7.234 + 0.713 + 1.742 = 15.904 DF = 2, P-Value = 0.000 (e) So sánh tỷ lệ phát Pseudomonas spp nước đất Co Khong Total Nước 10 21 6.64 24.36 Đất 8.36 34 30.64 Total 15 31 39 55 70 Chi-Sq = 1.697 + 0.463 + 1.349 + 0.368 = 3.876 DF = 1, P-Value = 0.049 67 68 69 [...]... độ kháng sinh trong huyết tương có thể gặp 3 trường hợp: - Nếu MIC < nồng độ kháng sinh trong huyết tương, vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh khi MIC nồng độ kháng sinh an toàn trong huyết tương: Vi khuẩn đề kháng với kháng sinh đó - Nếu MIC ở khoảng giữa hai trường hợp trên: Vi khuẩn nhạy cảm trung gian với kháng sinh, nghĩa là vi khuẩn. .. sự đề kháng với kháng sinh cũng như bất kỳ gen liên quan đến tính trạng đề kháng thường gặp ở các chủng vi khuẩn đương thời Áp lực chọn lọc đối với sự đề kháng kháng sinh xuất phát từ nhiều nguồn như vi c sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho động vật, kháng sinh dùng với mục đích kích thích tăng trọng trong thức ăn gia súc Hiện tượng đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loài vi. .. kháng sinh phổ biến ở những nơi có thuốc kháng sinh được sử dụng nhiều và vi khuẩn đề kháng này ngày càng tăng trong môi trường Hơn 90% những chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ nước biển đề kháng hơn 1 loại kháng sinh, và 20% đề kháng ít nhất 5 loại kháng sinh Nghiên cứu đề kháng kháng sinh ở vi sinh vật trong nước là quan trọng, bởi vì nó cho biết mức độ thay đổi hệ sinh thái nước bởi hoạt động của con người... được cô lập như vi m màng trong tim do vi khuẩn Thường MBC = 2 – 8 lần MIC Đối với kháng sinh có MBC gần với MIC và dễ dàng đạt nồng độ bằng MBC trong huyết tương thì đó là các kháng sinh diệt khuẩn như penicillin, chloramphenicol, macrolide (Trần Thị Thu Hằng, 2003) 2.5 Những nghiên cứu liên quan đến sự đề kháng kháng sinh trong môi trường Sự xuất hiện đề kháng kháng sinh với các kháng sinh phổ biến... 2.3 Sự đề kháng kháng sinh Mặc dù vi c sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho người và thú đem lại nhiều thành công và có hiệu quả kinh tế, nhưng đồng thời đã tạo một áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn Vi c dùng kháng sinh sẽ luôn tạo ra một sự đề kháng với chính nó ở một mức độ nhất định trong quần thể vi khuẩn Bằng chứng rõ ràng nhất là khi kiểm tra các chủng vi khuẩn thời tiền kháng sinh, các. .. những vi khuẩn gây bệnh khác (Võ Thị Trà An, 2007) 2.3.1 Nguyên nhân của sự đề kháng kháng sinh Có hai dạng đề kháng kháng sinh 2.3.1.1 Đề kháng tự nhiên Do chúng không có cơ chế tế bào cần thiết cho kháng sinh phát sinh tác động Ví dụ: Enterobacteriaceae kháng vancomycin, vi khuẩn G+ kháng polymycin B, trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa và E coli còn đề kháng tự nhiên với penicillin G do kháng sinh. .. loài vi khuẩn gây bệnh cho người và gia súc đang là mối quan tâm lo lắng cho toàn xã hội Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng, một số trường hợp dẫn đến tử vong do vi khuẩn gây bệnh đề kháng với hầu hết 18 kháng sinh dùng trong lâm sàng Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng đề kháng với kháng sinh hay đa đề kháng còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc... nhập vào tế bào của vi khuẩn đó 2.3.1.2 Đề kháng thu nhận Do đột biến nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn hoặc do vi khuẩn nhận các vật liệu di truyền (gene) liên quan đến kháng thuốc từ vi khuẩn khác Loại đề kháng này chiếm khoảng 10 – 20% Do vi khuẩn có chu kì phát triển từ vài giây đến vài phút nên chúng rất linh hoạt trong biến đổi để phù hợp với những thay đổi của môi trường sống Đề kháng do đột biến... khi có sự tiếp xúc giữa các vi khuẩn với nhau nên gia tăng tỉ lệ và tốc độ đề kháng một cách đáng kể Giữa các vi khuẩn với nhau, gen kháng thuốc có thể được trao đổi qua 3 cách: (1) tải nạp là quá trình DNA được thực khuẩn thể sát nhập và chuyển cho một vi khuẩn khác; (2) biến đổi hay còn gọi là chuyển dạng là quá trình một đoạn DNA trần (có nguồn gốc từ một vi khuẩn chết) đi vào một tế bào vi khuẩn. .. với vancomycin và polymyxin Tuy nhiên, trên thực tế lâm sàng (in vivo), các kiểu đột biến này không đáng kể do hệ thống phòng vệ của cơ thể tiêu diệt đa số các chủng vi khuẩn đề kháng dạng này Các gen đề kháng có tính di truyền, rất nguy hiểm vì có tính chọn lọc cao tạo ra các chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong cộng đồng xã hội 19 Đề kháng ngoài nhiễm sắc thể: do thu nhận gen plasmid, chiếm tỉ lệ ... macrolide có tính sát khuẩn liều cao Phổ kháng khuẩn macrolide chủ yếu vi khuẩn G+, số vi khuẩn G- (Actinobacillus spp., Brucella spp., Campylobacter spp.) 2.2.2.7 Nhóm sulfonamide Các sulfonamide... sulfonamide Các sulfonamide sử dụng rộng rãi như: sulfaguanidin, sulfadiazim, sulfisoxazol, sulfamethoxazol, sulfadimethoxin Đối với nhiều vi sinh vật, acid para-aminobenzoic (PABA) chất cần thiết... tác dụng vi khuẩn kị khí thấm phụ thuộc O2 cần lượng Tác động streptomycin chống Mycobacteria cao so với kháng sinh khác nhóm vi c chống vi khuẩn khác 2.2.2.3 Nhóm polypeptide Kháng sinh nhóm