Bước đầu nghiên cứu lưu giữ giống vi tảo trong nitơ lỏng (-1960C) phục vụ sản xuất giống hải sản.

I Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Vi tảo biển nguồn thức ăn tơi sống quan trọng đợc sử dụng rộng rãi trại sản xuất giống nhân tạo nhuyễn thể, giáp xác cá Chúng nguồn thức ăn chủ yếu cho loại động vật phù du nh Copepoda, Rotatoria loài lại nguồn thức ăn cho cá động vật khác Đối với cá loại giáp xác nh tôm, nhu cầu thức ăn tảo giới hạn giai đoạn vòng đời Ngợc lại, động vật nhuyễn thể hai mảnh vỏ vi tảo nguồn thức ăn suốt hoạt động sống (Dơng Đức Tiến, 2000) [16] Hàm lợng chất dinh dỡng có vi tảo cao (tính theo khối lợng khô), hàm lợng protein dao động từ 29-57%; lipid 7-25%; cacbonhydrat 5-32%; chất khoáng khác 6-39% (Thinh L V., 1999) [48] Đặc biệt, số axit béo mạch dài không no tổng hợp vi tảo yếu tố có ý nghĩa định cho sinh trởng tỷ lệ sống cá biển, tôm động vật thân mềm hai mảnh vỏ (De Pauw cs., 1994, trích theo Đặng Đình Kim, 2002) [11] nớc ta, vài năm trở lại đây, nghề nuôi trồng hải sản phát triển mạnh, nhiều công trình nghiên cứu sản xuất giống nuôi lớn số loài nhuyễn thể cá biển thành công có triển vọng đa vào sản xuất đại trà Trong tơng lai nghề nuôi đối tợng phát triển mạnh đòi hỏi lợng vi tảo lớn Vì vậy, việc lu giữ giống tảo việc làm cần thiết Hiện nay, phơng pháp lu giữ giống thông thờng nớc ta lu giữ giống ngắn hạn ánh sáng yếu, nhiệt độ thấp môi trờng lỏng bán lỏng có đáy thạch Thời gian lu giữ kéo dài từ vài ngày đến tháng, tuỳ loài tảo phơng pháp lu giữ khác Tuy nhiên, thời gian lu giữ dài tảo chậm thích nghi với môi trờng nuôi cấy lại Bên cạnh đó, loài vi tảo khác yêu cầu nhiệt độ, ánh sáng, môi trờng dinh dỡng trình lu giữ khác Thêm nữa, trạm sản xuất giống động vật biển nớc ta, điều kiện lu giữ giống tảo phòng thí nghiệm hạn chế Do vậy, nguồn tảo giống có nguy cao bị lẫn tạp, nhiễm khuẩn, chất lợng thiếu ổn định Một phơng pháp lu giữ giống tảo dài hạn đợc biết đến giới lu giữ giống tảo dài hạn nhiệt độ thấp nitơ lỏng (-1960C) Trong suốt thập kỷ qua, hiểu biết ảnh hởng nhiệt độ thấp lên thể sinh vật đợc tăng lên đáng kể (Mortain-Bertrand ctv., 1990) [41] Nhiều sinh vật bao gồm thực vật bậc cao vi tảo đợc l giữ thành công nitơ lỏng (-1960C), nơi mà lu giữ đợc hàng nghìn năm (Bajai Reinert, 1977; Leeson ctv., 1984; Rall Fahy, 1985; Mazur ctv., 1992; trích theo Susanti, 1998) [46] Lu giữ vi tảo nitơ lỏng phơng pháp giữ giống dài hạn, chất lợng cao, có tính ổn định Việt Nam, phơng pháp lu giữ giống tảo sử dụng nitơ lỏng cha đợc nghiên cứu Do vậy, nghiên cứu ứng dụng phơng pháp cần thiết, nhằm góp phần nâng cao hiệu sản xuất trại sản xuất giống hải sản thông qua việc cung cấp nguồn giống tảo chất lợng cao ổn định Từ yêu cầu thực tế đó, cộng với cho phép trờng Đại học Nông nghiệp I Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 1, tiến hành nghiên cứu đề tài: Bớc đầu nghiên cứu lu giữ giống vi tảo nitơ lỏng (-1960C) phục vụ sản xuất giống hải sản Trong nghiên cứu tiến hành thử nghiệm loài vi tảo biển: Isochrysis galbana Nannochloropsis oculata 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Bớc đầu xây dựng quy trình kỹ thuật lu giữ giống vi tảo nitơ lỏng (-1960C) 1.3 Nội dung nghiên cứu - Xác định chất chống đông phù hợp để lu giữ lạnh loài vi tảo - Xác định nồng độ chất chống đông phù hợp để lu giữ lạnh hai loài vi tảo - Thăm dò số phong pháp khác lu giữ loài vi tảo nitơ lỏng III Phơng pháp nghiên cứu 3.1 Đối tợng địa điểm nghiên cứu - Đối tợng nghiên cứu: loài vi tảo Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana đợc lấy từ phòng lu giữ giống tảo thuộc Trạm nghiên cứu thực nghiệm NTTS Quý KimHải Phòng, loài đợc nhập từ Đan Mạch năm 1998 Tây Ban Nha năm 2002 - Chuẩn bị giống: Tảo đợc nuôi bình thủy tinh 1l, nút kín không thấm nớc hấp tiệt trùng Các điều kiện nuôi: Cờng độ ánh sáng: 4.000lux Chu kỳ chiếu sáng: 24/24h, Độ mặn: 270/00 Nhiệt độ ổn định 20-250C sục khí liên tục Mật độ ban đầu nuôi cấy tảo N oculata x 106 tb/ml tảo I galbana x 105 tb/ml Thu mẫu: mẫu tảo đa vào lu giữ đợc thu pha logarit, đảm bảo tế bào có sức sống khỏe Qua thực nghiệm nuôi nhiều lần loài vi tảo N oculata I galbana cho thấy, tảo đạt mật độ cực đại vào ngày thứ chu kỳ nuôi, tơng ứng 28-30 triệu tb/ml tảo N oculata 10-12 triệu tb/ml tảo I galbana Do vậy, tảo đợc thu hoạch vào cuối ngày thứ đầu ngày thứ 5, thời điểm tảo đạt mật độ tối đa, để sử dụng cho thí nghiệm lu giữ giống tảo nitơ lỏng - Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm đợc tiến hành Viện Nghiên Cứu Nuôi trồng thuỷ sản & Trạm nghiên cứu thực nghiệm NTTS Quý Kim, Hải Phòng 3.2 Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm Nguồn nớc Nớc biển sử dụng cho nuôi cấy đợc lấy từ nơi có nguồn nớc có độ mặn từ 22-300/00, pH = 7,5-8,5 Nớc sử dụng cho việc lu giữ giống thí nghiệm bình tam giác đợc tiệt trùng nồi hấp 1200C; 1,5at (thời gian 15 phút) đợc đun sôi vòng 15 phút 2.2 Vệ sinh dụng cụ nuôi Các dụng cụ thuỷ tinh nh ống nghiệm (có nút bông), bình tam giác có nút (50ml, 100ml, 250ml, 500ml, 1.000ml), pipet đợc tiệt trùng tủ sấy nhiệt độ 150-1600C 2h 3.3 Môi trờng dinh dỡng sử dụng nuôi cấy tảo NaNO3: NaH2PO4.H2O: (Na2HPO412H2O.CT) FeCl3.6H2O: Na2EDTA: Na2SiO3.9H2O: Vitamin: B1(Thiamin HCl): B12(Cobalamine): Biotin: 84,148mg 10,000mg 2,900mg 10,000mg 50,000mg 0,200mg 1,000àg 1,000àg Nguyên tố vi lợng CuSO4.5H2O: ZnSO4.7H2O: CoCl2.6H2O: MnCl2.4H2O: NaMoO4 2H2O: Nớc biển: Pha chế môi trờng nuôi: 0,0196mg 0,0440mg 0,2000mg 3,6000mg 0,0126mg đến lít Để đơn giản, thuận tiện cho việc pha chế môi trờng nuôi tảo, dung dịch gốc có nồng độ đậm đặc đợc chuẩn bị để sử dụng lâu dài Mỗi loại môi trờng bao gồm số dung dịch gốc pha nớc cất Từng thành phần đa lợng đợc pha riêng, kim loại vi lợng pha chung, nồng độ gấp 1000 lần công thức môi trờng nuôi giữ chai nhỏ bổ sung vitamin sử dụng Lợng dùng: 1ml dung dịch gốc cho 1lít nớc Tiệt trùng autoclave dới áp suất 1,5at 30 phút Các dung dịch gốc đợc bảo quản điều kiện lạnh tối, trì chất lợng, sử dụng thời hạn tháng Bố trí thí nghiệm 4.1 Thí nghiệm chọn chất chống đông phù hợp (Thí nghiệm 1) Thí nghiệm đợc tiến hành với loại chất chống đông khác (DMSO, Glycerol Methanol) nồng độ khác ( 5%, 10%, 15%) Cách tiến hành nh sau: Tảo đợc lu giữ phải có chất lợng tốt, quần thể tảo cuối pha logarit (lúc tảo chuẩn bị đạt mật độ tối đa, mật độ tảo bắt đầu gia tăng chậm lại) Tảo thu hoạch trớc đa vào lu giữ giống đợc ly tâm điều kiện nhiệt độ 200C, tốc độ 1.000-1.500vòng/phút 5-10 phút Dịch tảo thu đợc với mật độ khoảng 10-15 x 108 tb/ml tảo Nannochloropsis oculata 15-20 x 107 tb/ml tảo Isochrysis galbana Dung dịch bảo quản đợc chuẩn bị gồm chất chống đông nớc biển khử trùng (độ muối 270/00) theo tỷ lệ 1: Sau thêm chất chống đông vào bình tam giác có chứa tảo cần lu giữ cách thêm từ từ 15 phút chia làm lần, thời gian cân 30 phút Sau dịch tảo đợc chuyển vào cọng chứa mẫu (0,5ml) Các cọng mẫu đợc giữ tủ lạnh nhiệt độ 40C 2h, tiếp tục nhiệt độ - 200C 20phút -800C 20phút Sau cọng mẫu đợc chuyển nhanh chóng vào canister bình nitơ lỏng (- 1960C) bảo quản dài hạn Các mẫu tảo bảo quản nitơ lỏng sau khoảng thời gian khác 1, 7, 14, 28 ngày đợc đa giải đông nhanh nớc ấm 400C tan hoàn toàn Sau mẫu tảo đợc nuôi cấy 100ml môi trờng dinh dỡng f2, chứa bình tam giác tích 250ml, với điều kiện nuôi nh công thức đối chứng (không qua bảo quản): Cờng độ ánh sáng: 4.000lux Chu kỳ chiếu sáng: 24/24h, Độ mặn: 270/00 Nhiệt độ ổn định 20-250C Đánh giá tốc độ sinh trởng quần thể tảo để tìm chất chống đông phù hợp Thiết kế thí nghiệm: Chất chống đông (A) Loài tảo (B) 0% (đối chứng) 5% (A2) 10% (A3) 15% (A4) Nannochloropsis oculata (1) A1B1 A 2B A 3B A4B1 Isochrysis galbana (2) A2B1 A 2B A 3B A4B2 4.2 Thí nghiệm chọn nồng độ chất chống đông phù hợp (Thí nghiệm 2) Dựa vào kết thí nghiệm xác định đợc chất chống đông phù hợp để sử dụng cho thí nghiệm Nồng độ chất chống đông thí nghiệm đợc bố trí mức độ dao động hẹp Thiết kế thí nghiệm: Nồng độ chất chống đông (A) Loài (B) A1 A2 A3 Nannochloropsis oculata (1) A1B1 A2B1 A 3B Isochrysis galbana (2) A 1B A2B2 A 3B 4.3 Thí nghiệm bảo quản lạnh vi tảo nitơ lỏng theo cách khác (Thí nghiệm 3) Cách 1: Phơng pháp làm lạnh đợc thực theo chơng trình Canavate J P, Lubian LM ( 1995a) với tốc độ hạ nhiệt nh sau: Bớc 1: Hạ từ nhiệt độ phòng (20-250C) xuống - 300C, tốc độ hạ nhiệt 10C/phút Bớc 2: Hạ từ - 300C xuống - 500C, tốc độ hạ nhiệt 30C/phút Sau mẫu tảo đợc chuyển vào giữ canister bình nitơ lỏng Cách 2: Các mẫu tảo đặt cách bề mặt nitơ lỏng khoảng 4cm phút, sau chuyển vào giữ canister bình nitơ lỏng Cách 3: Theo phơng pháp thí nghiệm 2: Làm lạnh cọng mẫu tảo nhiệt độ 40C 2h tủ lạnh, tiếp đến - 200C 20 phút - 800C 20 phút tủ lạnh sâu, sau chuyển vào canister bình nitơ lỏng Chất chống đông sử dụng (rút từ thí nghiệm 1) Nồng độ chất chống đông sử dụng (rút từ thí nghiệm 2) Phơng pháp xác định tiêu Phơng pháp xác định mật độ: buồng đếm hồng cầu Neaubouer cải tiến Lợng mẫu tảo đợc lấy 5ml/lần đợc cố định dung dịch Lugol (đối với tảo Isochrysis galbana) Cách pha nh sau: 20g Potasium Iot (KI) + 10g I2 + 200ml H2O cất Lấy ml dung dịch Lugol cho vào 100ml nớc mẫu tảo Cách đếm: Lắc mẫu tảo, dùng pipet paster nhỏ giọt vào vị trí buồng đếm, để lắng từ đến phút cho tảo ổn định, sau dùng lamen đậy nhẹ nhàng (nếu có xuất bọt khí phải làm lại), để lắng lúc đa vào thị trờng kính hiển vi để đếm Đếm thị kính x 10, vật kính x 40 Mỗi mẫu tảo đợc đếm lần Mật độ tế bào đợc tính theo công thức: D= A x a x 104 Trong đó: D: Mật độ tế bào (tb/ml) A: Số tế bào đếm đợc toàn diện tích ô đếm (tb/0,0001ml) a: Hệ số pha loãng dung dịch tảo (nếu có) 104: Số nhân tính số tế bào 1ml Lợng giống cấy vào lô thí nghiệm để có mật độ ban đầu nh dự kiến đợc tính theo công thức: v= Trong đó: dxV D V = Vm + v v: Dung tích tảo giống cần lấy (ml) V: Dung tích thí nghiệm (ml) Vm: Dung tích môi trờng (ml) d: Mật độ tảo ban đầu (tb/ml) D: Mật độ tảo nguồn giống (tb/ml) Chỉ tiêu để xác định tốc độ sinh trởng quần thể tảo: Thời gian cực đại (TGCĐ) Mật độ cực đại (MĐCĐ) Mẫu tảo để xác định mật độ sau 24h/lần Xác định yếu tố môi trờng - Độ muối đợc đo khúc xạ kế (Refractometer) Trớc đo dùng nớc cất chỉnh máy chuẩn 00/00 - pH: đo pH môi trờng máy đo pH WTW 330 Đức - Đo cờng độ ánh sáng máy đo cờng độ ánh sáng Đức Nguồn sáng sử dụng dàn đèn neon - Nhiệt độ: đo nhiệt độ nhiệt kế rợu 1000C Xử lý số liệu Các số thống kê (giá trị trung bình, độ lệch chuẩn) đợc xử lý chơng trình Data analysis Excel 97 Phơng pháp phân tích phơng sai (ANOVA) so sánh mức trung bình tiêu chuẩn Duncan mức P < 0,05 dùng phần mềm Stah để xử lý 10 4.3.2 Isochrysis galbana Kết thí nghiệm lu giữ lạnh tảo Isochrysis galbana sử dụng 10% Glycerol phơng pháp dùng chơng trình nhiệt (Phơng pháp 1) phơng pháp hạ nhiệt độ thông qua thiết bị tủ lạnh, tủ lạnh sâu (Phơng pháp 2) đợc thể Bảng 4.8a, 4.8b, 4.8c Hình 4.8a, 4.8b, 4.8c 100.0 ĐC PP1 PP2 Mật độ (x 10 tb/ml) 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 Thời gian (ngày) Hình 4.8a: Khả tái phát triển tảo I galbana sau ngày lu giữ nitơ lỏng phơng pháp 100.0 Mật độ (x 10 tb/ml) ĐC PP1 80.0 PP2 60.0 40.0 20.0 0.0 Thời gian (ngày) Hình 4.8b: Khả tái phát triển tảo I galbana sau 14 ngày lu giữ nitơ lỏng phơng pháp 33 Mật độ (x 10 tb/ml) 100.0 ĐC PP1 80.0 PP2 60.0 40.0 20.0 0.0 Thời gian (ngày) Hình 4.8c: Khả tái phát triển tảo I galbana sau 28 ngày lu giữ nitơ lỏng phơng pháp Kết sau ngày lu giữ nitơ lỏng phơng pháp khác nhau, tảo I galbana đa nuôi cấy lại phát triển tốt Mật độ đạt cực đại phơng pháp cao phơng pháp 2, tơng ứng 49,6 44,0 x 105 tb/ml sau ngày nuôi, so với đối chứng 89,7x 105 tb/ml sau ngày nuôi, Tuy nhiên, hiệu hai phơng pháp không khác rõ rệt (P> 0,05) Hiệu hai phơng pháp lu giữ lạnh tảo đợc kiểm tra thông qua xem xét khả tái phát triển chúng sau 14 28 ngày lu giữ nitơ lỏng Kết thu đợc tơng tự nh lu giữ nitơ lỏng sau ngày, Mật độ đạt cực đại Phơng pháp 1; tơng ứng 48,5; 44,2 x 105 tb/ml sau ngày nuôi 44,0; 38,5 x 105 tb/ml sau ngày nuôi Sự sai khác hiệu hai phơng pháp lu giữ nghĩa thống kê (P> 0,05) Nh vậy, phơng pháp lu giữ phơng pháp đợc xem có hiệu Tuy nhiên, dùng phơng pháp đơn giản hơn, dễ thao tác 34 Bảng 4.8a: Khả tái phát triển tảo I galbana sau ngày lu giữ nitơ lỏng phơng pháp ĐC PP1 Mật độ Mật độ Ngày PP2 (x 105 tb/ml) SD (x 105 tb/ml) Mật độ SD (x 105 tb/ml) SD 15,1 1,1 6,8 0,4 5,7 0,6 27,3 2,2 10,1 0,8 9,1 0,6 35,6 2,8 15,3 0,6 14,3 0,8 61,5 6,8 21,3 2,0 22,1 0,5 89,7 5,4 29,8 2,2 30,3 1,6 68,8 5,2 38,2 2,6 42,6 1,7 49,6 4,3 44,0 3,0 38,5 3,1 37,2 2,8 Bảng 4.8b: Khả tái phát triển tảo I galbana sau 14 ngày lu giữ nitơ lỏng phơng pháp ĐC PP1 Mật độ Ngày (x 105 tb/ml) PP2 Mật độ Mật độ SD (x 105 tb/ml) SD (x 105 tb/ml) SD 15,1 1,1 5,9 0,4 5,8 0,4 27,3 2,2 9,7 0,6 9,1 1,1 35,6 2,8 15,8 0,7 14,3 1,2 61,5 6,8 22,5 0,8 20,8 1,6 89,7 5,4 29,8 2,1 28,5 1,8 68,8 5,2 40,1 2,2 40,6 2,5 48,5 3,2 44,2 2,6 37,6 3,1 35,9 3,1 35 Bảng 4.8c: Khả tái phát triển tảo I galbana sau 28 ngày lu giữ nitơ lỏng phơng pháp ĐC PP1 Mật độ Mật độ Ngày (x 105 tb/ml) PP2 SD (x 105 tb/ml) Mật độ SD (x 105 tb/ml) SD 15,1 1,1 4,9 0,1 3,7 0,1 27,3 2,2 8,2 0,6 6,3 0,2 35,6 2,8 11,6 1,1 11,9 0,6 61,5 6,8 17,8 1,2 15,6 0,8 89,7 5,4 24,4 1,6 23,6 1,6 68,8 5,2 34,8 3,2 30,0 1,8 44,0 3,6 38,5 2,6 32,1 1,6 27,6 2,2 36 V Kết luận đề xuất 5.1 Kết luận Chất chống đông có hiệu tảo N oculata DMSO 5% tảo I galbana Glycerol 10% Lu giữ hai loài vi tảo N oculata I galbana nitơ lỏng phơng pháp sử dụng chơng trình hạ nhiệt máy tính điều khiển có hiệu Tuy nhiên, sai khác hiệu phơng pháp sử dụng chơng trình hạ nhiệt phơng pháp sử dụng thiết bị tủ lạnh, tủ lạnh sâu không rõ rệt (P> 0,05) Kết khả tái phát triển loài vi tảo không chênh lệch lớn sau bảo quản với thời gian khác Lần đầu tiên, việc xây dựng quỹ vi tảo biển đợc đề cập việc nghiên cứu kỹ thuật lu giữ giống tảo N oculata I galbana nitơ lỏng Bớc đầu xây dựng quy trình công nghệ lu giữ giống dài hạn loài vi tảo nitơ lỏng 5.2 Đề xuất ý kiến Cần nghiên cứu thêm hiệu phơng pháp lu giữ tảo có sử dụng chơng trình hạ nhiệt với tốc độ làm lạnh khác Đồng thời nghiên cứu lu giữ nitơ lỏng với loài vi tảo có giá trị kinh tế khác Bên cạnh cần xem xét đánh giá chất lợng vi tảo sau bảo quản với thời gian khác giữ giống lâu dài Nghiên cứu biến động nhiệt độ theo nấc bình nitơ lỏng để từ nghiên cứu phơng pháp lu giữ tảo cách hạ nitơ lỏng phơng pháp đơn giản, dễ thao tác có hiệu kinh tế 37 Phụ lục 1: Kết lu giữ tảo N oculata nitơ lỏng sử dụng chất chống đông 1.1 Thí nghiệm chọn chất chống đông phù hợp nồng độ 5% Kết lu giữ sau ngày Nitơ lỏng Bảng thống kê Mức DC DMSO Glycerol MeOH Số ngày 9 Trung bình 20.817 16.689 14.911 15.811 DL (Hchỉnh) 6.896 8.235 7.480 8.034 HSBĐ 0.980 1.072 1.073 1.040 Min 9.700 5.800 5.600 5.600 Max 28.300 27.500 25.300 26.300 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn Mức Sai số Toàn BTd 29 32 Tổng BF 137.587 1744.255 1881.842 BF tbình 45.862 60.147 Ftn Flt 0.763 2.934 Kết lu giữ sau ngày Nitơ lỏng Bảng thống kê Mức DC DMSO Glycerol MeOH Số ngày 9 Trung bình 20.817 16.133 14.756 15.389 DL (Hchỉnh) 6.896 8.490 7.420 7.490 HSBĐ 0.331 0.526 0.503 0.487 Min 9.700 5.700 5.600 6.100 Max 28.300 27.800 25.000 26.100 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn Mức Sai số Toàn BTd 29 32 Tổng BF 151.219 1703.839 1855.059 BF tbình 50.406 58.753 Flt Ftn 0.858 2.934 1.2.Thí nghiệm chọn chất chống đông phù hợp nồng độ 10% Kết lu giữ sau ngày Nitơ lỏng Bảng thống kê Mức DC DMSO Glycerol MeOH Số ngày 10 10 10 Trung bình 20.717 15.430 14.220 14.060 DL (Hchỉnh) 6.962 8.166 7.054 7.126 38 HSBĐ 0.336 0.529 0.496 0.507 Min 9.100 4.600 4.700 4.900 Max 28.800 26.500 23.100 24.600 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn Mức Sai số Toàn BTd 32 35 Tổng BF 200.130 1747.369 1947.499 BF tbình 66.710 54.605 Flt Ftn 1.222 2.901 Kết lu giữ sau ngày Nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày Trung bình 20.717 DC 15.160 DMSO 10 13.910 Glycerol 10 14.140 MeOH 10 DL (Hchỉnh) 6.962 8.103 6.895 6.889 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn BTd Tổng BF 208.144 Mức 1688.305 Sai số 32 1896.449 Toàn 35 HSBĐ 0.336 0.535 0.496 0.487 BF tbình 69.381 52.760 Min 9.100 4.600 4.800 4.900 Ftn Max 28.800 26.100 23.200 23.900 Flt 1.315 2.901 1.3 Thí nghiệm chọn chất chống đông phù hợp nồng độ 15% Kết lu giữ sau ngày Nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày Trung bình 20.067 DC 11 11.627 DMSO 11 10.718 Glycerol 12 13.133 MeOH DL (Hchỉnh) 6.900 6.291 6.172 6.590 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn BTd Tổng BF Mức 377.481 Sai số 36 1492.398 Toàn 39 1869.879 HSBĐ 0.344 0.541 0.576 0.502 BF tbình 125.827 41.456 Min 8.700 3.900 3.400 4.200 Ftn Max 27.400 20.100 19.200 22.500 Flt 3.035 So sánh Duncan (so trung bình ứng với mức nhân tố) DC MeOH DMSO 20.067 13.133 11.627 a b b 2.866 Glycerol 10.718 b Kết luận: Có sai khác giá trị trung bình DC chất chống đông, nhng sai khác giá trị trung bình chất chống đông Kết lu giữ sau ngày Nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày Trung bình DC 20.067 DMSO 11 10.927 Glycerol 11 9.882 MeOH 12 12.775 DL (Hchỉnh) 6.900 5.864 5.426 6.342 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn BTd Tổng BF HSBĐ 0.344 0.537 0.549 0.496 BF tbình 39 Min 8.700 3.500 3.200 4.200 Ftn Max 27.400 19.800 17.200 22.000 Flt Mức Sai số Toàn 36 39 446.877 1318.754 1765.631 148.959 36.632 So sánh Duncan (so trung bình ứng với mức nhân tố) DC MeOH DMSO 20.067 12.775 10.927 a b b 4.066 2.867 Glycerol 9.882 b Kết luận: Có sai khác giá trị trung bình DC chất chống đông, nhng sai khác giá trị trung bình chất chống đông 40 Phụ lục 2: Kết lu giữ tảo I galbana nitơ lỏng sử dụng chất chống đông Kết lu giữ sau ngày Nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày Trung bình DL (Hchỉnh) DC 49.891 25.474 DMSO 19.112 14.008 Glycerol 33.300 20.519 MeOH 18.273 13.319 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn BTd Tổng BF Mức 4247.779 Sai số 24 8433.357 Toàn 27 12681.140 HSBĐ 0.511 0.733 0.616 0.729 BF tbình 1415.926 351.390 Min 16.613 4.643 4.887 4.643 Max 81.223 40.167 56.167 39.280 Flt Ftn 4.030 So sánh Duncan (so trung bình ứng với mức nhân tố) DC Glycerol DMSO 49.891 33.300 19.112 a ab b 3.009 Methanol 18.273 b Kết luận: Có sai khác giá trị trung bình DC với DMSO, Methanol, nhng sai khác giá trị trung bình DC với Glycerol, chất chống đông Kết lu giữ sau ngày Nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày Trung bình DL (Hchỉnh) DC 49.891 25.474 DMSO 18.563 13.981 Glycerol 28.625 17.448 MeOH 17.241 11.953 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn BTd Tổng BF Mức 4310.985 Sai số 24 7405.768 Toàn 27 11716.750 HSBĐ 0.511 0.753 0.610 0.693 BF tbình 1436.995 308.5737 So sánh Duncan (so trung bình ứng với mức nhân tố) DC Glycerol DMSO 49.891 28.625 18.563 a b b Min 16.613 4.643 4.700 4.300 Ftn Max 81.223 38.500 51.200 35.100 Flt 4.657 3.009 Methanol 17.241 b Kết luận: Có sai khác giá trị trung bình DC với chất chống đông, nhng sai khác giá trị trung bình chất chống đông 41 Phụ lục 3: Kết lu giữ tảo N oculata nitơ lỏng sử dụng chất chống đông nồng độ khác Bảng thống kê Mức Số ngày DC DMSO3% 11 DMSO5% 10 DMSO8% 10 Trung bình 20.483 11.100 16.140 15.180 DL (Hchỉnh) 7.361 5.399 8.567 8.080 HSBĐ 0.359 0.486 0.531 0.532 Min 8.900 3.900 5.000 4.700 Max 28.600 18.700 28.100 26.300 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn Mức Sai số Toàn BTd 36 39 Tổng BF 360.755 1810.628 2171.383 BF tbình 120.2516 54.86753 42 Flt Ftn 2.192 2.892 Phụ lục 4: Kết lu giữ tảo N oculata nitơ lỏng số phơng pháp khác 4.1 Thí nghiệm Kết lu giữ sau ngày nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày Trung bình DL (Hchỉnh) DC 19.317 7.900 PP1 11.722 7.268 PP2 2.333 0.777 PP3 10.967 6.835 HSBĐ 0.409 0.620 0.333 0.623 Min 8.900 3.400 1.700 3.200 Max 29.800 23.600 3.200 21.900 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn Mức Sai số Toàn BTd Tổng BF 592.547 1247.539 1840.086 25 28 BF tbình 197.516 49.902 Flt Ftn 3.958 2.991 So sánh Duncan (so trung bình ứng với mức nhân tố) DC 19.317 a PP1 11.722 ab PP3 10.967 b PP2 2.333 b Kết luận: Có sai khác giá trị trung bình DC PP2, PP3, nhng sai khác giá trị trung bình DC PP1 PP1 với PP2, PP3 Kết lu giữ sau 14 ngày nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày Trung bình DL (Hchỉnh) DC 19.317 7.900 PP1 10 12.210 7.033 PP2 2.550 1.066 PP3 10 10.830 6.110 HSBĐ 0.409 0.576 0.418 0.564 Min 8.900 3.700 1.500 3.500 Max 29.800 23.100 3.700 20.200 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn Mức Sai số Toàn BTd Tổng BF 692.133 1096.668 1788.802 26 29 BF tbình 230.711 42.180 Flt Ftn 5.470 2.975 So sánh Duncan (so trung bình ứng với mức nhân tố) DC 19.317 a PP1 12.210 b PP3 10.830 b PP2 2.550 c Kết luận: Có sai khác giá trị trung bình DC phơng pháp, PP2 với PP1, PP3; nhng sai khác giá trị trung bình PP1 PP3 Kết lu giữ sau 28 ngày nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày DC Trung bình 19.317 DL (Hchỉnh) 7.900 43 HSBĐ 0.409 Min 8.900 Max 29.800 PP1 PP2 PP3 10 10 12.190 2.567 10.840 6.975 0.907 5.959 0.572 0.354 0.550 3.500 1.600 3.500 22.500 3.400 20.700 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn Mức Sai số Toàn BTd Tổng BF 600.782 1071.188 1671.970 25 28 BF tbình 200.261 42.848 Flt Ftn 4.674 2.991 So sánh Duncan (so trung bình ứng với mức nhân tố) DC 19.317 a PP1 12.190 b PP3 10.840 bc PP2 2.567 c Kết luận: Có sai khác giá trị trung bình DC với phơng pháp, PP1 với PP2; nhng sai khác giá trị trung bình PP3 với PP1, PP3 với PP2 2.Thí nghiệm Kết lu giữ sau ngày nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày DC PP1 11 PP2 PP3 11 Trung bình 19.917 13.518 3.025 13.445 DL (Hchỉnh) 8.373 7.600 1.124 6.847 HSBĐ 0.420 0.562 0.371 0.509 Min 7.100 4.800 1.700 4.500 Max 29.000 25.400 4.100 23.500 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn Mức Sai số Toàn BTd 28 31 Tổng BF 685.530 1400.759 2086.289 BF tbình 228.510 50.027 Ftn Flt 4.568 2.947 So sánh Duncan (so trung bình ứng với mức nhân tố) DC 19.917 a PP1 13.518 a PP3 13.445 a PP2 3.025 b Kết luận: Có sai khác giá trị trung bình DC, PP1,PP3 với PP2, nhng sai khác giá trị trung bình DC PP1, PP3 Kết lu giữ sau 14 ngày nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày Trung bình DL (Hchỉnh) 19.917 8.373 DC 13.045 7.585 PP1 11 2.950 0.896 PP2 12.917 6.783 PP3 12 44 HSBĐ 0.420 0.581 0.304 0.525 Min 7.100 4.500 1.800 4.100 Max 29.000 25.100 3.800 22.800 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn Mức Sai số Toàn BTd 29 32 Tổng BF 691.138 1434.422 2125.561 BF tbình 230.379 49.463 Flt Ftn 4.658 2.934 So sánh Duncan (so trung bình ứng với mức nhân tố) DC 19.917 a PP1 13.045 a PP3 12.917 a PP2 2.95 b Kết luận: Có sai khác giá trị trung bình DC, PP1,PP3 với PP2, nhng sai khác giá trị trung bình DC PP1, PP3 Kết lu giữ sau 28 ngày nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày Trung bình DL (Hchỉnh) DC 19.917 8.373 PP1 11 13.091 7.445 PP2 2.700 1.054 PP3 12 12.433 6.276 HSBĐ 0.420 0.569 0.390 0.505 Min 7.100 4.500 1.600 4.100 Max 29.000 25.200 3.700 21.500 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn BTd Tổng BF BF tbình Mức 608.536 202.845 Sai số 28 1340.324 47.869 Toàn 31 1948.86 So sánh Duncan (so trung bình ứng với mức nhân tố) DC PP1 PP3 19.917 13.091 12.433 a a a Flt Ftn 4.238 2.947 PP2 2.700 b Kết luận: Có sai khác giá trị trung bình DC, PP1,PP3 với PP2, nhng sai khác giá trị trung bình DC PP1, PP3 45 Phụ lục 5: Kết lu giữ tảo I galbana nitơ lỏng số phơng pháp khác Kết lu giữ sau ngày nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày DC PP1 PP2 Trung bình 49.667 26.200 25.663 DL (Hchỉnh) 28.291 15.279 15.083 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn BTd Tổng BF Mức 2459.497 Sai số 19 7228.352 Toàn 21 9687.85 HSBĐ 0.570 0.583 0.588 BF tbình 1229.749 380.440 Min 15.100 6.800 5.700 Max 89.700 49.600 44.000 Flt Ftn 3.232 So sánh Duncan (so trung bình ứng với mức nhân tố) DC PP1 49.667 26.200 a b 3.522 PP2 25.663 b Kết luận: Có sai khác giá trị trung bình DC với phơng pháp, nhng sai khác giá trị trung bình phơng pháp Kết lu giữ sau 14 ngày nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày Trung bình DL (Hchỉnh) DC 49.667 28.291 PP1 26.238 15.305 PP2 24.900 14.622 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn BTd Tổng BF Mức 2541.161 Sai số 19 7137.932 Toàn 21 9679.093 BF tbình 1270.581 375.681 Kết lu giữ sau 28 ngày nitơ lỏng Bảng thống kê Mức Số ngày Trung bình DL (Hchỉnh) 49.667 28.291 DC 22.225 13.958 PP1 19.650 12.249 PP2 Bảng phân tích phơng sai (mô hình cố định) Nguồn BTd Tổng BF Mức 3628.115 Sai số 19 6415.968 Toàn 21 10044.08 HSBĐ 0.570 0.583 0.587 Ftn Max 89.700 48.500 44.200 Flt 3.382 HSBĐ 0.570 0.628 0.623 BF tbình 1814.058 337.683 46 Min 15.100 5.900 5.800 Min 15.100 4.900 3.700 Ftn 3.522 Max 89.700 44.000 38.500 Flt 5.372 3.522 So sánh Duncan (so trung bình ứng với mức nhân tố) DC 49.667 a PP1 22.225 b PP2 19.650 b Kết luận: Có sai khác giá trị trung bình DC với phơng pháp, nhng sai khác giá trị trung bình phơng pháp Phụ lục Hình dạng tế bào tảo Isochrysis galbana Hình dạng tế bào tảo Nannochloropsis oculata 47 [...]... giữ trong nitơ lỏng có sử dụng tủ lạnh sâu để làm lạnh sơ bộ IV Kết quả nghiên cứu và thảo luận 4 1 Kết quả lu giữ tảo trong nitơ lỏng sử dụng các chất chống đông 4.1.1 Nannochloropsis oculata Trên thế giới có rất nhiều loại chất chống đông đợc sử dụng để lu giữ tảo trong nitơ lỏng Hiệu quả của mỗi chất chống đông phụ thuộc vào từng loài tảo Tuy vậy, 3 chất chống đông đợc dùng thông dụng trong lu giữ. .. ban đầu Dịch tảo Dung dịch bảo quản (chất chống đông + nớc biển theo tỷ lệ 1/1) Bình tam giác 50ml Thêm chất chống đông Lắc đều Để cân bằng trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Cách 1: Lu giữ trong nitơ lỏng có chạy chơng trình hạ nhiệt Cách 2: Các mẫu tảo đặt cách bề mặt Nitơ lỏng 4cm trong 1 phút, sau chuyển thẳng vào nitơ lỏng Nuôi cấy Xác định tốc độ sinh trởng quần thể tảo (MĐCĐ, TGCĐ) 12 Cách 3: Lu giữ. .. phát triển của tảo I galbana sau 1 ngày lu giữ trong nitơ lỏng với các chất chống đông 100 ĐC 5 Mật độ (x 10 tb/ml) D M SO 80 Glyce ro l M e th a n o l 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 T hời gian (ngày ) Hình 4.4b: Khả năng tái phát triển của tảo I galbana sau 7 ngày lu giữ trong nitơ lỏng với các chất chống đông 21 Bảng 4.4a: Khả năng tái phát triển của tảo I galbana sau 1 ngày lu giữ trong nitơ lỏng với các... Kết quả nghiên cứu của Canavate và Lubian (1995b) [21] trên một loài tảo lục khác N gaditana cho biết, sử dụng 5%DMSO để lu giữ đã cho tỷ lệ sống 57% và sử dụng 5% Methanol cho tỷ lệ sống 48,7% sau 1 năm lu giữ trong nitơ lỏng Gần đây, Simpson, Hsiao and Blanch (2000) [45] công bố sử dụng 5%DMSO là tốt nhất để lu giữ tảo N gaditana trong nitơ lỏng 19 Bảng 4.3a: Khả năng tái phát triển của tảo N oculata... giữ chỉ có 2% Theo kết quả nghiên cứu của Montaini và ctv (1995) (trích theo Susanti, 1998) [46] cho biết, tỷ lệ sống của tảo I galbana sau giải đông đạt cao hơn 13%, khi lu giữ trong nitơ lỏng sử dụng chất chống đông DMSO và Glycerol, tuy nhiên không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa hai chất chống đông này 4.2 Thí nghiệm tối u nồng độ DMSO dùng lu giữ tảo trong nitơ lỏng Đối với mỗi chất chống... Tuy nhiên, sự sai khác về hiệu quả giữa các nồng độ chất chống đông không có ý nghĩa thống kê (P> 0,05) 4 3 Làm lạnh tảo trong nitơ lỏng bằng một số phơng pháp khác nhau 4.3.1 Nannochloropsis oculata Quy trình lu giữ lạnh tảo bằng nitơ lỏng bao gồm nhiều bớc khác nhau, trong đó có bớc làm lạnh mẫu tảo rất quan trọng và ảnh hởng lớn đến kết quả lu giữ Làm lạnh mẫu tảo có 2 phơng pháp khác nhau, đó là... mật độ đạt cực đại là 22,5 và 22,0 x 106 tb/ml ứng với sau 1 ngày và 7 ngày lu giữ trong nitơ lỏng Tiếp đến DMSO, mật độ đạt cực đại là 20,1 và 19,8x 106 tb/ml ứng với sau 1 ngày và 7 ngày lu giữ trong nitơ lỏng; sau cùng là Glycerol, mật độ cực đại đạt 19,2 và 17,2 x 106 tb/ml ứng với sau 1 ngày và 7 ngày lu giữ trong nitơ lỏng Tuy nhiên, thời gian đạt mật độ cực đại ở Methanol lại chậm hơn so với DMSO... lạnh trực tiếp (có nghĩa là đa thẳng mẫu tảo vào lu giữ trong nitơ lỏng) và phơng pháp làm lạnh 2 bớc (có nghĩa là mẫu tảo đợc làm lạnh sơ bộ sau đó mới đợc chuyển vào lu giữ trong nitơ lỏng) Cả hai phơng pháp này đã đem lại sự thành công cho nhiều loài tảo, tuy nhiên phơng pháp làm lạnh 2 bớc vẫn đợc khẳng định có hiệu quả hơn (Taylor và Fletcher, 1999) [47] Trong thí nghiệm này, dựa trên kết quả thí... nghiệm cho thấy, mật độ cực đại và thời gian đạt cực đại của tảo N oculata không sai khác nhau nhiều sau khi bảo quản ở các thời gian khác nhau 7, 14, 28 ngày Day và ctv (1997) [26] nghiên cứu ảnh hởng của bảo quản dài hạn các loài vi tảo đến sức sống của chúng cho biết, vi tảo đợc lu giữ đến 22 năm trong nitơ lỏng khi đa ra nuôi cấy lại trong môi trờng dinh dỡng thích hợp vẫn phát triển tốt, đồng... 26,1; 23,9; 23,2 x106tb/ml sau 9 ngày nuôi Nh vậy, sau khi lu giữ trong nitơ lỏng tảo đợc đa ra nuôi cấy trở lại, tảo chậm thích nghi với môi trờng, đòi hỏi thời gian lâu hơn, thời gian đạt mật độ cực đại ở cả 3 chất chống đông đều chậm hơn so với đối chứng 4 ngày Bảng 4.2b: Khả năng tái phát triển của tảo N oculata sau 7 ngày lu giữ trong nitơ lỏng với các chất chống đông ở nồng độ 10% ĐC DMSO Glycerol ... trồng Thuỷ sản 1, tiến hành nghiên cứu đề tài: Bớc đầu nghiên cứu lu giữ giống vi tảo nitơ lỏng (-1960C) phục vụ sản xuất giống hải sản Trong nghiên cứu tiến hành thử nghiệm loài vi tảo biển:... 1998) [46] Lu giữ vi tảo nitơ lỏng phơng pháp giữ giống dài hạn, chất lợng cao, có tính ổn định Vi t Nam, phơng pháp lu giữ giống tảo sử dụng nitơ lỏng cha đợc nghiên cứu Do vậy, nghiên cứu ứng dụng... hợp để lu giữ lạnh hai loài vi tảo - Thăm dò số phong pháp khác lu giữ loài vi tảo nitơ lỏng III Phơng pháp nghiên cứu 3.1 Đối tợng địa điểm nghiên cứu - Đối tợng nghiên cứu: loài vi tảo Nannochloropsis