Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men SACCHAROMY CEREVISIAE, ứng dụng lên men vang táo mèo

ảnh hưởng của tỉ lện dịch quả và hàm lượng đường đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng S.. mở đầu *Lí do chọn đề tài Rượu vang wine,vine là sản phẩm được tạo thành trong quá trình l

Lời cảm ơn Nghiên cứu khoa học là một công việc cần thiết của thế hệ trẻ, đặc biệt với mỗi sinh viên Để đạt được mục đích và hoàn thành nội dung của đề tài không thể tự bản thân mỗi sinh viên thực hiện, mà cần có sự tạo điều kiện của nhà trường, của khoa và sự hướng dẫn tận tình của thầy giáo, cô giáo

Bằng tấm lòng thành kính em xin được bày tỏ tấm lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo, tiến sĩ Đinh Thị Kim Nhung Qua đây em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn vi sinh vật học trường ĐHSP Hà Nội 2 đã giúp đỡ

em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khoá luận này

Hà Nội, ngày tháng năm 2007

Sinh viên

Trần Thị Thu Huyền

LêI CAM §OAN T«i xin cam ®oan ®©y lµ nghiªn cøu cña riªng t«i, c¸c sè liÖu, c¨n cø kÕt qu¶ thùc nghiÖm nªu trong kho¸ luËn lµ trung thùc

§Ò tµi nµy ch­a tõng ®­îc c«ng bè trong bÊt k× c«ng tr×nh nµo kh¸c

Hµ Néi, th¸ng 5 n¨m 2007

TrÇn ThÞ Thu HuyÒn

Danh mục các chữ viết tắt, kí hiệu, bảng, biểu đồ

1 Danh mục các chữ viết tắt, kí hiệu

Bảng 3.3.1 ảnh hưởng của pH đến sinh sản và phát triển của chủng

S cerevisiae (x106 TB/ml)

Bảng 3.3.2 ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh sản và phát triển của chủng

S cerevisiae

Bảng 3.3.3 ảnh hưởng của tỉ lện dịch quả và hàm lượng đường đến sự

sinh trưởng và phát triển của chủng S cerevisiae D1 Bảng 3.3.4 ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ đến sự sinh trưởng và phát

triển của chủng S cerevisiae D1 (x106TB/ml) Bảng 3.3.5 ảnh hưởng của peptôn đến sự sinh trưởng và phát triển của

chủng S cerevisiae D1 (x106TB/ml) sau 24 giờ Bảng 3.3.6 ảnh hưởng của nông độ NaCl đến sự sinh trưởng và phát triển

của chủng S cerevisiae D1 (x106TB/ml) sau 96 giờ

Bảng 3.3.7 ảnh hưởng của KH2PO4 đến sự sinh trưởng và phát triển của

chủng S cerevisiae D1 Bảng 3.3.8 ảnh hưởng của hàm lượng men giống đến quá trình lên men

vang táo mèo Bảng 3.4.1 Kết quả nghiên cứu rượu thành phẩm

3 Danh mục các đồ thị, biểu đồ

Đồ thị 3.1.2.2 Động thái phát triển của chủng nấm men S cerevisiae Đồ thị 3.3.6 Biểu diễn biến động số lượng tế bào của chủng đến sự sinh trưởng và phát triển chủa chủng S cerevisiae D1 ở các nồng độ NaCl

khác nhau

Đồ thị 3.4.1 Động thái của quá trình lên men vang táo mèo

Biểu đồ 3.1.2.4 biểu diễn hàm lượng CO2 thoát ra của chủng nấm men

S cerevisiae Biểu đồ 3.3.6 Biểu diễn hàm lượng đường sót và hàm lượng cồn của chủng

S cerevisiae D1 sau 96 giờ lên men của chủng ở các nồng độ NaCl

khác nhau Đồ thị 3.3.7 Biểu diễn hàm lượng đường sót và hàm lượng cồn của chủng

S cerevisiae D1 sau 96 giờ lên men ở các nồng độ KH2PO4 khác nhau

4 Danh mục các ảnh

ảnh 1: Khuẩn lạc Saccharomyces cerevisiae trên môi trường thạch đĩa ảnh 2: Hình thái tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trên kính hiển

vi quang học x1000 lần

mở đầu

*Lí do chọn đề tài

Rượu vang (wine,vine) là sản phẩm được tạo thành trong quá trình lên men các loại nước trái cây không qua trưng cất, giữ được mùi thơm và hương vị đặc trưng của từng loại hoa quả

Ngành sản xuất rượu vang đã được con người sử dụng và sản xuất từ rất lâu phổ biến ở Pháp, Trung Quốc ở Việt Nam ngành sản xuất rượu vang đã được con người sử dụng nhiều phát triển với tốc độ nhanh nhưng thành phần vẫn khó

được thị trường tiếp nhận, do ứng dụng công nghệ vi sinh và sản xuất vang chưa

được phổ biến nhiều, việc nghiên cứu một số chủng vi khuẩn áp dụng trong lên men vang đã được đề cập đến nhưng còn ít Nước ta do có khí hậu nhiệt đới nên các cây ăn quả rất phong phú, đa dạng, trong đó có nhiều loại quả có thể là nguồn nguyên liệu tốt cho sản xuất rượu vang Đặc biệt ở miền núi phía Tây Bắc nước ta có cây táo mèo cho quả có hương vị rất thơm ngon và đặc trưng

Nhưng hiện nay số lượng quả táo mèo chủ yếu để ăn tươi, ngoài ra còn

được dùng để ngâm sirô Tuy nhiên số lượng mang đi tiêu thụ vẫn không đáng kể

so với sản lượng quả hằng năm (30-35%) số lượng còn lại thường bị bỏ phí do khó vận chuyển hoặc giá thành quá rẻ Hầu hết người trồng quả táo mèo có thu nhập không cao, đời sống gặp nhiều khó khăn

Vì vậy việc nghiên cứu, sử dụng quả táo mèo để sản xuất rượu vang là cần thiết và có phù hợp với thực tiễn Việt Nam Chính vì vậy chúng tôi đã tiến hành

đề tài : “ Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của nấm men lên men vang táo mèo”

*Mục tiêu của đề tài

- Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo

- Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của nấm men lên men vang táo mèo

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vang từ quả táo mèo

*Đối tượng nghiên cứu

Quả táo mèo (Docynia indica), họ hoa hồng (Rosaceae) chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae thuần khiết phân lập được từ quả táo mèo Chúng tôi

đã tiến hành phân lập được mẫu và chọn ra một chủng Saccharomyces cerevisiae

có khả năng lên men tốt hơn cả, xác định tên khoa học của chủng là

Saccharomyces cerevisiae D 1

*ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đề tài

Đề tài nghiên cứu của chúng tôi nhằm đáp ứng các nhu cầu khoa học về ý nghĩa lí luận và thực tiễn như sau:

Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá của

chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae D 1 có khả năng lên men vang táo mèo

Công trình của chúng tôi mang ý nghĩa thực tế đó là tạo nguồn tiêu thụ quả táo mèo nhằm nâng cao thu nhập cho bà con các dân tộc vùng cao

Chương 1 Tổng quan về tài liệu 1.1 Khái quát chung về rượu vang

1.1.1 Các loại rượu vang

Rượu vang là loại nước thơm ngon giàu chất bổ dưỡng với hương thơm trái cây còn giữ được trong rượu Sự đa dạng về các loại rượu vang là kết quả của sự biến đổi sinh hoá khi lên men Người ta thường chia rượu vang thành hai loại chính là vang không gaz và vang có gaz Trong hai loại chính này rượu vang lại

được chia thành nhiều loại theo màu sắc và lượng đường có trong rượu

- Theo màu sắc có vang trắng và vang đỏ

- Theo hàm lượng có vang khô (ít đường), vang ngọt (nhiều đường) và vang nửa khô

1.1.2 Nguyên liệu sản xuất rượu vang

Rượu vang theo đúng nghĩa được sản xuất từ nước ép quả nho, cho lên men không qua trưng cất ở nước ta với khí hậu nhiệt đới gió mùa không thích hợp cho cây nho phát triển tốt, nhưng lại là xứ sở của nhiều loại hoa thơm, quả ngọt

Đây là nguồn nguyên liệu phong phú phục vụ cho ngành công nghiệp chế biến rượu vang (mơ, táo, dứa, vải)

1.1.3 Thành phần của rượu vang

Thành phần chủ yếu của rượu vang bao gồm:

- Cồn etanol, do lên men tự nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn aldehit, este Độ cồn của rượu từ 10-120

- Chất bổ dưỡng: đường trong rượu vang từ 62g/l – 132g/l chủ yếu là

đường fructoz, glucozo và một ít galactoz

- Axit vô cơ và axit hữu cơ: axit oxalic, axit malic,

- Trong rượu vang chứa một lượng phong phú các loại muối với hàm lượng thấp nhưng giữ vai trò quan trọng, làm tăng hương vị của rượu, tăng giá trị dinh dưỡng của rượu

- Rượu vang giàu vitamin: vitamin có trong nước quả không bị quá trình lên men phân huỷ mà nó chỉ điều chỉnh lại thành phần

1.2 Một số đặc tính sinh học của tế bào nấm men Saccharomyces

1.2.1 Sơ lược về nấm men

Nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh

sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên như trong đất, trong nước, không khí và đặc biệt có mặt rất nhiều trên bề mặt nhiều loại quả

Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng Sinh khối của chúng rất giàu prôtêin, vitamin, lipid Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí Vì vậy, nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh mì, sản xuất protein sinh khối, gây hương nước chấm, sản xuất chất béo Tuy nhiên, một số nấm men độc hại, làm nhiễm các quy trình công nghệ và gây hư hỏng sản phẩm

1.2.2 Hình thái, kích thước và cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces

- Tế bào nấm men đa số có cấu tạo hình cầu, hình trứng hoặc hình ô van Hình dạng này có thể thay đổi phụ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào

- Kích thước tế bào khoảng 3-10 mx 5-12m Nấm men có màu trắng

đục, vàng hoặc hồng nhạt, bề mặt tế bào thường khô và căng, có thể dính riêng lẻ hoặc dính nhau thành chuỗi

1.2.3 Cấu tạo

Nấm men có cấu tạo đơn bào mang đầy đủ tính chất của một cơ thể sống Chúng có cấu tạo gồm màng, chất nguyên sinh và nhân

1.2.3.1 Màng

Màng tế bào có cấu tạo chủ yếu là hemi xenluloza chiếm 70% trọng lượng khô của tế bào, 6- 7% protein Ngoài ra màng tế bào còn chứa lipid, đường khử, nitơ, các axit amin và các chất khoáng

1.2.3.2 Nguyên sinh chất

- Màng nguyên sinh chất: Có chức năng chủ yếu là chủ động điều hoà việc hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào

- Chất nguyên sinh của tế bào nấm men:

+ Ribôxôm: bao gồm 2 loại là Ribôxôm 80S (trong tế bào chất) và Ribôxôm 70S (trong ti thể)

+ Ti thể có dạng hạt Kích thước khoảng 0.2- 0.6m có màng bọc trong suốt, tính thấm cao Kích thước và hình dáng có thể thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và trạng thái sinh lí của tế bào Ti thể được bao bọc bởi hai lớp màng cấu tạo bởi protein và lipid và trên đó có rất nhiều hạt nhỏ gọi là hạt cơ bản (ôxixôm)

Số lượng ti thể trong tế bào nấm men từ 10-20, chúng tham gia vào quá trình sinh trưởng tế bào sự hình thành và nảy chồi của bào tử

- Trong tế bào nấm men có chứa một hệ thống không bào được hình thành

từ thể golgi hay mạng lưới nội chất Không bào có tính thấm cao và là nơi tích luỹ các sản phẩm của trao đổi chất Không bào có chứa một hệ thống keo, trong

đó bao gồm cả điện tử enzim, protit, hidrat cacbon, các muối canxi, photpho, kali, Hình dạng của không bào thường thay đổi do sự co rút của chất nguyên sinh và sự thay đổi sức căng bề mặt giữa không bào và chất nguyên sinh Trong

không bào thường xảy ra các phản ứng oxi hoá khử, nhờ hệ thống enzim xitôcrôm oxydase trong không bào

1.2.3.3 Nhân

Khác với tế bào vi khuẩn tế bào nấm men có nhân thật, nhân có hình ôvan

hoặc hình tròn, được bao bọc bởi lớp màng nhân Khoảng 1 2.4 m  cấu tạo bởi protein, ADN, ARN và nhiều enzim Nhân quyết định tính di truyền và tham gia

điều khiển tất cả mọi hoạt động sống của tế bào nấm men

1.2.3.4 Sinh sản của tế bào nấm men

Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính) Bình thường tế bào nấm men sinh sản nảy chồi khi gặp điều kiện không thuận lợi một số có thể sinh sản theo cách tạo bào tử

Sinh sản vô tính: sinh sản nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất Khi

tế bào phát triển đến mức độ nhất định thì cơ thể của nó đâm ra một chồi nhỏ gọi

là mầm (hay chồi) Mầm (tế bào con) đâm ra ở vị trí lệch tâm trên một đầu của tế bào mẹ Cùng một lúc tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều chồi ở phía khác nhau, ở mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất nhân và chất nguyên sinh ở tế bào mẹ Sau khi nảy mầm tế bào con có thể tách ra khỏi tế bào mẹ sống độc lập cũng có thể không tách khỏi tế bào mẹ và tiếp tục nảy mầm tạo ra một lớp tế bào giống nhau

Sinh sản hữu tính là hình thức hợp nhất hai tế bào nấm men thành hợp tử

Tế bào này phát triển thành túi trong đó có giảm nhiễm để hình thành các bào tử

Nấm men sinh sản vô tính bằng nảy chồi hoặc phân đôi giữa quá trình này

có thể sinh sản hữu tính

1.2.4 Nấm men thuần chủng

Trong tự nhiên nấm men có mặt ở nhiều nơi đặc biệt trên bề mặt trái cây Tuy nhiên, không phải các nấm men này đều tốt mà có cả nấm men dại, độc hại Hiện nay công nghệ lên men với chủng thuần khiết đang được phổ biến rộng rãi Nấm men thuần chủng là nấm men được phát triển từ cùng một tế bào

đã được tuyển chọn trên môi trường HanSen

* Một số chủng hay dùng cho sản xuất rượu vang Saccharomyces vini chiếm tới 80% Saccharomyces Loại nấm men này có khả năng lên men glucozo,

fructoz, mantoz, glactoz, lactoz, peptoz, dextrin

Saccharomyces ovifomis được tách từ nước nho lên men tự nhiên, đặc biệt

loại này chịu được đường cao Saccharomyces cereviae dùng sản xuất bánh mì,

bia, rượu vang khi lên men đạt 10 – 20%V cồn

* Khả năng lên men đường của Saccharomyces :

Sự lên men : lên men rượu xảy ra qua một số giai đoạn trong thời kì đầu khi môi trường còn chứa nhiều hàm lượng oxy đã hoà tan, nấm men chủ yếu oxy hoá đường đến CO2 và H20 Trong giai đoạn cuối cùng của sự lên men, vì đường còn lại ít trong môi trường nấm men sẽ sử dụng các glicogen trong tế bào giảm dần

Tốc độ lên men của các chủng Saccharomyces lên men rượu bia là khác

nhau đối với mỗi loại đường Tốc độ lên men đường glucoz và fructoz nhanh hơn saccaroz Tốc độ lên men được xác định CO2 bay ra từ một thể tích môi trường nhất định trong một đơn vị thời gian

Nấm men sử dung rộng rãi trong sản xuất là giống Saccharomyces

cerevisiae Thành phần gồm 75 % nước, 25% chất khô

1.3.Các biến động sinh lý, sinh hoá vi sinh khi lên men rượu vang, khả năng

lên men đường của Saccharomyces cerevisiae

Quá trình sản xuất rượu vang bắt đầu bằng công đoạn: đầu tiên nấm men sinh sản trong môi trường dịch quả Lúc đầu cần nhiều oxy, sau đó tạo điều kiện lên men rượu etylic yếm khí nhanh chóng, sự lên men rượu etylic được biểu diễn theo phương trình :

Quá trình lên men rượu xảy ra qua 5 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Là con đường biến đổi glucoza thành fructoza 1-6 điphotphat dưới sự xúc tác của enzim oxi izomêrase

Giai đoạn 2: Quá trình biến đổi fructoza 1-6 điphotphat tạo thành 3 photpho gloxerat và photphođioxi axêton nhờ xúc tác của enzim aldolase

Giai đoạn 3: Đầu tiên là 3 photpho glixeraldehit biến đổi thành

3 photphoglixerat và tiếp tục đổi thành 2 photpho glixerat nhờ xúc tác của enzim photphoglixero mutase Giai đoạn cuối cùng của giai đoạn này là sự biến đổi 2 photpho glixerat thành axit pirumic nhờ xúc tác của enzim andoza và photpho pherase

Giai đoạn 4: Axit pirumic phân cắt nhờ xúc tác của enzim cacboxylaza thành axetal dehyl, giải phóng CO2

Giai đoạn 5: Tạo thành etanol từ axetal dehil có sự xúc tác của alcolđêhylđrogennase

Tốc độ lên men được xác định bằng lượng CO2 bay ra từ một thể tích môi trường nhất định trong một đơn vị thời gian

Những rượu bậc cao có trong vang với số lượng không lớn nhưng đóng vai trò quyết định trong tạo hương rượu vang Các rượu bậc cao được tạo thành từ sự biến đổi đường, đạm từ các axit amin tương ứng ví dụ: amylic, propylic, izobutylic

1.4 Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rượu vang, bệnh vang

1.4.1 Nấm men

1.4.2 Nấm mốc

Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất rượu vang thùng chứa thiết

bị hoặc do bụi, không khí đưa đến như nấm mốc thuộc chi Rhizopus,

Aspergillus

1.4.3 Vi khuẩn

Trong nước hoa quả và nước rượu vang có thể có những dạng vi khuẩn có tính ổn định lớn với rượu và axit hữu cơ Chúng có thể gây ra những biến đổi sâu sắc trong rượu vang về vị chua, mùi, Và có loài gây làm đục cho vang, đó

thường là các loài vi khuẩn Acetobater xylium, Acetobater aceti Một số vi sinh

vật gây ra cơ chế làm lỏng vang khi tiếp xúc với không khí Do vậy, để bảo quản rượu vang người ta có thể dùng thanh trùng Pasteus nhưng nó làm giảm chất lượng rượu vang , phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản phổ biến như SO2(75-120mg/l)

1.4.4 Bệnh vang

Xuất hiện khi rượu vang tiếp xúc với không khí, được Pasteus phát hiện ra Khi đó nấm men dạng màng và vi khuẩn axetic làm chua rượu vang Các bệnh vang cũng có thể do các vi sinh vật lên men trong điều kiện hiếu khí

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men và lên men rượu vang

1.5.1 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men

1.5.1.1 Nguồn cacbon

Cacbon có trong tế bào chất thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzim axit nucleic và sản phẩm trao đổi chất Nguồn thức ăn chủ yếu của nấm men là hyđrat cacbon, nó đáp ứng 3 nhu cầu của nấm men là:

- Sản sinh năng lượng

- Tạo thành những tiền chất

- Thực hiện các quá trình oxy hoá khử để biến những tiền chất này thành sản phẩm trung gian, để xây dựng tế bào

1.5.1.2 Nguồn Nitơ và muối khoáng

- Nguồn nitơ: Nấm men cần nitơ để xây dựng tế bào

- Các nguyên tố của photpho, lưu huỳnh đóng vai trò quan trọng trong các quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men trong quá trình trao đổi chất ở tế bào nấm men các ion Ca2+, Mg2+, Fe2+ nằm trong thành phần của enzim hoạt động

Trong quá trình nuôi cấy, pH môi trường luôn bị biến đổi dẫn đến sự biến

đổi của nấm men trong quá trình sinh sản pH tăng trong giai đoạn cuối của quá trình lúc chất dinh dưỡng khan hiếm và hoạt lực enzim trong tế bào lớn Khi pH<3 thì quá trình lên men bị yếu đi Nếu pH>7 thì quá trình lên men bị dừng lại Khả năng lên men vang tốt là pH= 4 5

1.6.1.2 ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến quá trình phát triển của nấm men do các phản ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào đều chịu sự chi phối của nhiệt độ Với mỗi loại

nấm men có khoảng nhiệt độ phát triển thích hợp Quá trình lên men bắt đầu tốt

ở nhiệt độ 200C, ở 250C quá trình lên men xảy ra rõ rệt sau 12h, còn 17-180C xảy

ra sau 24h Quá trình lên men không diễn ra ở nhiệt độ dưới 100C Điều kiện nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển là 20-280C

1.6.2 ảnh hưởng của nồng độ cồn

Nồng độ cồn thích hợp cho rượu vang phát triển tốt 9-140 Quá trình lên men chậm lại khi hàm lượng cồn cao pH thích hợp nhát cho sự lên men là: 4-5

1.6.3 ảnh hưởng của nồng độ đường và áp suất thẩm thấu

Đường và các chất hoà tan khác trong môi trường tạo áp suất, áp suất thẩm thấu chênh lệch giữa tế bào nấm men và môi trường nuôi cấy Sự chênh lệch này làm cho các chất dinh dưỡng dễ hoà tan và thấm vào môi trường tế bào qua màng

và sản phẩm của tế bào hoà tan vào môi trường Tế bào không sinh trưởng được trong điều kiện nồng độ đường quá cao Khi nồng độ đường thấp thì tế bào phát triển chậm và ít nguồn nguyên liệu để nấm men chuyển hoá thành rượu Nấm men chỉ có khả năng lên men đường đơn giản monoxacarit áp lực CO2 cũng ảnh hưởng tới quá trình lên men

1.6.4 ảnh hưởng của hàm lượng giống

Men giống là tác nhân của của quá trình lên men Hàm lượng giống quá ít gây hiện tượng dễ nhiễm khuẩn hoặc không lên men mạnh, nếu hàm lượng giống quá cao lên men mạnh nhưng có sự cạnh tranh cơ chất Hàm lượng giống thích hợp là từ 8-10%

Chương 2

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Quả táo mèo (Docyni indica) được thu nhận từ hai vùng trồng nhiều ở

Việt Nam là Yên Bái(Trạm Tấu) và Sơn La

- Các chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch quả táo mèo có vị trí phân loại theo Yelinov N.P(1996) sau đây:

Các loại đường: glucoza, saccaroza, fructoza một số chất vô cơ, hữu cơ:

KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH, HCl, (NH4)2HPO4,(NH4)2SO4 Rượu etylic, pepton, agar, phenolphtalein, nước máy, cồn

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

- Dụng cụ: hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thuỷ tinh, phễu thuỷ tinh, que cấy, đèn cồn, cốc thuỷ tinh

- Thiết bị lên men: bình cầu, bình tam giác, nồi hấp, buồng vô trùng, tủ sấy, cân phân tích, kính hiển vi

2.1.4 Môi trường

Dựa vào tính chất của nấm men Sacchromyces cerevisiae chúng tôi chọn

môi trường vô cơ theo tỉ lệ sau:

2.1.4.1 Môi trường HanSen (MT1) g/l: môi trường phân lập và sơ tuyển chủng nấm men

2.1.4.3 Môi trường lên men (MT3):g/l

- Dịch siro hoa quả: 50g

+ Xác định tế bào trên buồng đếm Goriaev và hoạt hoá giống

- Xác định hàm lượng đường bằng đường kế

- Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH

- Quan sát tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại

1000 lần

- Các phương pháp phân tích:

+ Xác định hàm lượng axit trong dịch lên men bằng chuẩn độ NaOH 0,1N

+ Xác định độ cân bằng ancol kế rồi quy về độ cồn chuẩn 150C bằng phương pháp hoá học

- Xử lý số liệu bằng thống kê toán học

2.2.1 Phân lập và tuyển chọn khuẩn lạc nấm men trên môi trường thạch đĩa

Môi trường để tuyển chọn các khuẩn lạc nấm men là môi trường

HanSen (MT1) Dùng phương pháp phân lập trên hộp petri nhằm tuyển chọn một tập hợp tế bào nấm men của cùng một nòi có kích thước, hình thái, khả năng lên men như nhau

Cách tiến hành: Môi trường phân lập được khử trùng và phân vào các hộp Petri vô trùng để nguội theo phương pháp Pasteur: Dịch hoa quả đã được pha loãng 10-1-10-10 bằng nước cất Nhỏ một hai giọt huyền phù với độ pha loãng

10-9 lên bề mặt thạch dàn đều bằng bàn trang Gói kín và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 24-280C trong 4 ngày trên bề mặt xuất hiện các khuẩn lạc, với các đặc điểm trắng, bóng đặc trưng cho nấm men

2.2.2 Phương pháp hoạt hoá giống

Trước khi đưa vào môi trường lên men để có những tế bào to khoẻ, chúng tôi tiến hành hoạt hoá giồng bằng cách nuôi trên môi trường thạch ở 24-280C trong vòng 24 giờ

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men

* Phương pháp cân bình trọng lượng

Dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trường, có cùng một lượng tế bào nấm men của các giống khác nhau Sau 24 giờ lên men đem cân trọng lượng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại

* Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Goriave

Cấy giống vào môi trường nhân giống nuôi ở nhiệt độ 280C lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường Tuỳ mức độ giai đoạn phát triển mà tỉ lệ khác nhau

Dùng pipet lấy dịch pha loãng cho một giọt vào khe hở giữa lưới đếm kính, chú ý tránh tạo bọt khí sau đó đặt lá kính lên trên để yên 3-5 phút rồi tiến hành soi trên kính hiển vi ở vật kính 40 đếm số tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau

Cách tính số tế bào trong 1ml: M=A.50.B

Trong đó: M: Số tế bào trong 1ml dịch huyền phù

A: Số lượng tế bào trung bình trong 1 ô vuông

 nếu n <30

2(X i X)

Chủng nấm men Saccharomyces trên đối tượng là quả táo mèo được thu từ

Yên Bái và Sơn La

2.4 Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa sinh trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Chương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1 Phân lập, tuyển chọn và định loại chủng nấm men

3.1.1 Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo

Tác nhân chính thực hiện quá trình chuyển hoá đường trong dịch táo mèo

là nấm men Vì vậy, ta phải phân lập và tuyển chọn để lấy được chủng tốt nhất Các chỉ tiêu chúng tôi dựa vào để phân lập và tuyển chọn là:

- Chịu được độ cồn và độ axit cao

- Tốc độ phát triển nhanh chu kì lên men ngắn

- Có khả năng lên men tốt trong môi trường có hàm lượng đường cao

- Hương thơm tạo este đặc biệt, không sinh độc tố

- Dễ lắng trong khả năng cạnh tranh tốt với các vi sinh vật khác, ổn định lâu dài trong sản xuất

Từ dịch quả táo mèo tự nhiên chúng tôi đưa vào phân lập trên đĩa petri đã thu được 20 mẫu nấm men khác nhau 20 mẫu này đem thử hoạt lực lên men trong dịch táo mèo nhờ lượng CO2 thoát ra Mẫu nào cho hàm lượng CO.2 thoát ra càng nhiều thì hoạt lực lên men càng mạnh Qua nhiều lần tuyển chọn chúng tôi chọn được một mẫu nấm men có đường kính khuẩn lạc lớn, trắng bóng, lồi, bờ không răng cưa Được trình bày ở hình 3.1.a và hình 3.1.b