Tìm hiểu về hệ thống phân tích sắc ký lỏng HPLC

Tìm hiểu về hệ thống phân tích sắc ký lỏng HPLC

I Khái niệm HPLC (High Performance Liquid Chromatography) phương pháp chia tách pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hay chất mang biến liên kết hóa học với nhóm chức hữu Phương pháp ngày sử dụng rộng rãi phổ biến nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả định lượng tốt, thích hợp tách hợp chất khó bay dễ phân hủy nhiệt Bản chất tách loại sắc ký dựa hấp phụ bề mặt pha tĩnh Cơ chế tách chế hấp phụ Vì tất tính chất động học hấp phụ bề mặt pha tĩnh có ảnh hưởng đến kết sắc ký hỗn hợp chất mẫu II Cấu tạo Các phận máy HPLC mô tả sơ đồ nguyên tắc chung: Hình Sơ đồ máy HPLC Bình chứa dung môi pha động Bình đựng dung môi thường làm thủy tinh thể tích thay đổi từ 100ml - 2l Bình làm thủy tinh màu chứa chất nhạy với ánh sáng, bình phải thật kín pha động chất bay Ví dụ aceton, methanol,…Nếu không nồng độ bị thay đổi Đôi phải có hệ thống khử khí vài dung môi hòa tan khí khí oxygen, người ta khí siêu âm hay cách sục khí Helium vào (He tan dung môi đẩy khí khác khỏi dung môi) Pha động dung môi để rửa giải chất tan (chết phân tích) khỏi cột tách để thực trình sắc ký Pha động HPLC dung môi hữu đơn methanol, acetonitrile, benzene, n-hexene, water, hỗn hợp hai ba dung môi trộn vào theo tỉ lệ phù hợp Ví dụ như: hỗn hợp methanol với nước theo tỉ lệ 70 methanol/ 30 nước, acetonitrile với nước theo tỉ lệ 80/20… Nó dung môi nước có chứa chất đệm pH, chất tạo phức, chất làm chậm… với nồng độ định Nói chung với loại sắc ký có hệ dung môi (pha động) rửa riêng thích hợp với nó, để thu kết tốt Sau pha tĩnh pha động yếu tố thứ hai định hiệu suất tách sắc ký hỗn hợp mẫu Nghĩa hệ pha, pha động pha tĩnh hai yếu tố trình sắc ký Hai yếu tố giữ vai trò định thời gian lưu giữ chất mẫu hiệu tách sắc ký Nói chung, pha động ảnh hưởng đến vấn đề sau tách sắc ký chất: - Độ chọn lọc hệ pha Thời gian lưu giữ chất tan Hiệu lực cột tách Độ phân giải chất pha tĩnh - Độ rộng peak sắc ký Do đó, với pha tĩnh chọn rồi, lại chọn dung môi có thành phần phù hợp, ta có hiệu tách sắc ký hỗn hợp mẫu tốt pha tĩnh chọn Vì vậy, pha động yếu tố linh động phải thỏa mãn số điều kiện sau đây: - Pha động phải trơ pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh theo tính chất trình sắc ký Không có tương tác phụ với pha tĩnh - để sinh sản phẩm khác làm phức tạp cho trình sắc ký Pha động phải hòa tan chất mẫu Có làm cho chất mẫu vận chuyển tốt từ đầu cột đến cuối cột tách thực trình rửa - giải Pha động phải bền vững theo thời gian, nghĩa không bị phân hủy hay thay - đổi không theo ý muốn chạy sắc ký Pha động phải có độ tinh khiết cao, để đảm bảo không bị nhiễm bẩn phân tích gây sai số cho kết phân tích Nghĩa chất để pha chế pha động - phải có độ tinh khiết cao Phải nhanh đạt cân trình sắc ký, cân hấp phụ, phân - bố, trao đổi ion, tùy theo chất loại sắc ký Phải phù hợp với loại detector dùng để phát chất phân tích Ví dụ detector UV-Vis pha động phải suốt vùng phổ đó, hay detector - huỳnh quang pha động phải tính chất huỳnh quang Điều kiện cuối pha động phải có tính kinh tế, không hiếm, không đắt Đó yêu cầu cần thiết hệ pha động kỹ thuật tách HPLC cho phân tích hỗn hôp mẫu định Pha tĩnh Pha tĩnh HPLC chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách sắc ký hỗn hợp chất phân tích Nó chất rắn xốp có kích thước hạt nhỏ Song dù dạng pha tĩnh HPLC phải thỏa mãn yêu cầu sau đây: Phải trơ bền vững với điều kiện môi trường sắc ký, phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích, để đảm bảo chế tách theo chất pha tĩnh, hay không chất phân tích cần tách Có khả tách chọn lọc hỗn hợp chất tan định điều kiện sắc ký định Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt có đặc trưng độ xốp không bị thay đổi hay biến dạng trình sắc ký, không bị phân rả áp suất cao trình sắc ký Cân động trình sắc ký phải xảy nhanh lặp lại tốt Có đảm bảo thu kết tách tốt Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất, nghĩa đường kính hạt lớn so với hạt nhỏ không chênh lệch 10% 85% số hạt phải nằm vùng có kích thước trung bình Có cột tách có hiệu cao Đó yêu cầu chung pha tĩnh kỹ thuật HPLC Trong sắc ký hấp phụ pha đảo, pha tĩnh thường silica alkyl hóa, phân cực hay không phân cực Pha động hệ dung môi phân cực Bơm Mục đích để bơm pha động vào cột thực trình chia tách sắc ký Bơm phải đạt áp suất cao khoảng 250 - 600bar tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 10ml/phút Gồm phận sau: - Đầu bơm có hai van điều tiết, van có lỗ nhỏ với bi Các van - đảm bảo cho việc hút pha động từ thân bơm vào cột sắc kí an toàn Thân bơm có pittông để chuyển động lại Khi pittông tiến tới, bi đóng lỗ phía cột lại bi khác nhấc để pha động vào than, pittông lùi lại bi đóng bình đựng dung môi mở lỗ phái cột để pha dao động vào cột sắc ký Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy Với dung tích l bóp - 100µl Có cách lấy mẫu vào cột : - Tiêm mẫu thủ công (tiêm tay) Tiêm mẫu tự động (Autosample) Cột sắc ký Cột dùng sắc ký lỏng thường ống làm thép không rỉ làm thủy tinh đặc biệt (chỉ dùng áp suất khoảng 60psi) Cột trái tim trình sắc ký, cột yếu tố quan trọng định đến kết trình sắc ký hỗn hợp mẫu Cột tách có nhiều kích thước khác thường có chiều dài từ 10-25 cm, đường kính 2-5 mm Đầu dò (detector) sắc ký lỏng hiệu cao Là phận phát chất chúng khỏi cột cho tín hiệu ghi sắc ký đồ để định tính định lượng Tùy theo tính chất chất phân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp Tín hiệu đầu dò thu là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,… Khi cho chất tan ngang qua tế bào đo, đầu dò tạo nên tín hiệu điện Mọi thay đổi độ lớn vật lý chất tan chuyển đổi thành xung điện đọc máy ghi Sự giải đáp đầu dò tỉ lệ với lượng chất tan hay nồng độ chất tan tế bào, lặp lại độc lập với chất rửa giải (trừ trường hợp rửa giải với gradient đổi với vài loại đầu dò) Đầu dò tốt phải cho kết bền, nhanh, lặp lại Nó phải có độ nhạy tốt với nồng độ không biến đổi chất lượng tách Dựa vào tính chất mẫu chất cần phân tích mà ta có loại detector sau: Detector UV-Vis Detector huỳnh quang Detector điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn Detector khối phổ Detector diode phát quang diode mảng… Detector UV-Vis: - • Đây loại phổ biến HPLC Nguyên tắc cho pha động từ cột chảy qua ống đo (flowcell) nhỏ có chùm xạ đơn sắc UV/VIS chiếu qua Sự hấp thu xạ chất tan hàm phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C theo định luật Lambert - Beer: D = εlC Ở đây: D đại lượng mật độ quang; l chiều dài cell; ε hệ số hấp thu phân tử số cho chất tan bước sóng Đơn vị ε phụ thuộc vào thứ nguyên l C Trong SI thứ nguyên C mol m-3, l mét thực tế C đo với mol dm -3 l cm nên ε dm3 mol-1 cm-1 Định luật Lambert – Beer chùm sáng bị hấp thu đơn sắc, hệ thống detector thường không cung cấp chùm tia đủ đơn sắc mà dải hẹp chùm tia quanh giá trị bước sóng chọn Một ống đo (flow cell) UV detector có đường kính khoảng mm chiều dài ánh sáng qua khoảng 10 mm, thể tích chứa khoảng µl Hệ thống thu nhận xử lý số liệu Đó trạm liệu đại tiếp nhận lưu giữ tín hiệu phát từ detector in sắc ký đồ hoàn chỉnh với chiều cao, diện tích đỉnh, thông số định tính mẫu biến số phương pháp Chúng sử dụng để lập chương trình sắc ký, kiểm soát hầu hết biến số theo dõi thường xuyên thời gian vận hành dài người trông coi Với tiến công nghệ thông tin, phận thu nhận xử lý số liệu cùa hệ thống HPLC thường máy vi tính đại có khả ghi nhận, lưu giữ, biên tập, xử lý thông tin hiệu Nhờ phần mềm cài đặt tương thích với chương trình detector khác nhau, máy vi tính hỗ trợ hiệu cho việc định tính, định lượng chất phân tích dựa vào sở liệu cài sẵn Nguyên tắc hoạt động hệ thống bơm cao áp bơm liên tục qua cột với tốc độ dòng điều chỉnh Khi mẫu tiêm vào loop theo dòng dung môi vào cột Quá trình tách sắc ký xảy cột Sau mẫu chất tách khỏi cột đầu dò ghi nhận tín hiệu chuyển thành tín hiệu điện thể peak lên sắc ký đồ III Nguyên tắc hoạt động Mẫu chất lỏng hòa tan dung môi thích hợp, đưa vào buồng bơm mẫu sau bơm tự động vào cột tách Quá trình tách xảy Do cấu tử chất phân tích có lực khác với pha tĩnh, chúng di chuyển dọc cột với tốc độ khác Sau cấu tử tách khỏi thoát khỏi cột vào detector, tín hiệu ghi lại, chuyển thành tín hiệu điện Tín hiệu khuyếch đại chuyển sang phận ghi Các tín hiệu xử lý chuyển sắc kí đồ Trên sắc ký đồ nhận được, có tín hiệu ứng với cấu tử tách gọi peak • - Quá trình tách sắc ký: Là vận chuyển phân bố liên tục chất phân tích từ đầu cột đến cuối - cột Quá trình tách dựa vào tính chất hóa học, vật lý hóa lý chất Dựa - trình hấp phụ giải hấp phụ Xảy liên tục pha: pha tĩnh chất lỏng chất rắn có nhiệm vụ giữ chất phân tích, pha động chất lỏng (1 chất hỗn hợp nhiều chất) có - nhiệm vụ hòa tan di chuyển chất phân tích Chất phân tích phân bố pha, pha động chảy qua cột - tách với tốc độ định Hiệu trình tách phụ thuộc nhiều vào tương tác chất pha tĩnh pha động Ví dụ: Tách hỗn hợp gồm hai chất A B: Mẫu chứa A B tiêm vào cột Khi cho chất rửa giải bắt đầu chảy qua cột, phần mẫu hòa tan pha động di chuyển phần đầu cột Ở cấu tử A B tự phân bố hai pha Tiếp tục cho pha động qua cột đẩy phần hòa tan chạy xuống phân bố pha động pha tĩnh xảy Đồng thời phân bố dung môi pha tĩnh diễn vị trí mẫu lúc đầu Việc thêm tiếp dung môi mang phân tử hòa tan chạy xuống cột loạt liên tiếp chuyển biến hai pha Bởi di chuyển chất tan xảy pha động, nên tốc độ trung bình di chuyển chất tan phụ thuộc vào phần thời gian chất tan nằm pha Phần thời gian nhỏ chất tan bị lưu giữ mạnh pha tĩnh (cấu tử B ví dụ trên) lớn chất tan (cấu tử A) có lưu giữ pha động mạnh Sau thời gian phân tử chất A B tách khỏi Phân loại IV Dựa vào khác chế tách chiết sử dụng HPLC, người ta chia HPLC thành loại: Sắc ký phân bố hiệu cao (Partition chromatography) Sắc ký hấp phụ hiệu cao (Sắc kí lỏng - rắn LSC) Sắc ký trao đổi ion hiệu cao (IEC) Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography) Sắc kí loại theo cở (Size Exclusion Chromatography) Sắc kí phân bố hiệu cao Gồm hai loại phương pháp sắc ký lỏng – lỏng sắc kí pha liên kết a) Sắc kí lỏng lỏng (LLC) Pha tĩnh chất lỏng phủ bề mặt hạt chất mang (support) Pha tĩnh thường bị dung môi hòa tan dần làm cột dần hiệu lực nên phương pháp ngày sử dụng b) Sắc kí pha liên kết (Bonded phase Chromatography) Pha tĩnh gắn hóa học (liên kết) với chất mang (hạt silicagen) tạo nên hợp chất siloxan Nếu R nhóm phân cực octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl pha động dung môi phân cực H 2O, methanol, acetonitril có sắc kí pha đảo (hay sắc kí pha ngược) Ở pha tĩnh phân cực pha động, trái với truyền thống sắc kí trước pha tĩnh phân cực pha động Nếu R nhóm phân cực alkylamin –(CH2)nNH2 hay alkylnitril –(CH2)n-CN pha động dung môi phân cực hexan ta có sắc kí pha thuận Hiện sắc kí pha đảo dùng rộng rãi lí sau:  - Các phân tử không phân cực, phân cực, ion, ion hóa - tách cách hiệu Pha tĩnh có khoảng phân cực rộng để chọn lựa Nó cho phép chọn khoảng rộng chất rửa giải Các chất dung môi rửa giải thông dụng không đắt (nước, methanol acetonitril) - Kỹ thuật rửa giải gradient sử dụng mà không sợ hỏng pha tĩnh - Không có hạn chế áp suất pha động vào cột - Nó cho kết tách tốt với nhiều đối tượng tách Chọn pha: thường chọn pha tĩnh có tính phân cực giống với chất cần tách khác với pha động Các chất hữu có độ phân cực tăng theo thứ tự sau: Hydrocacbon no, ôlefin, hydrocacbon thơm, halogenua, sunfua, ête, dẫn xuất nitro, este = andehit = xeton, ancol = amin, sunfon, sunfoxit, amit, axit cacboxilic, nước Thứ tự rửa giải sắc kí pha thuận chất không phân cực trước đến chất phân cực mạnh Trong sắc kí pha đảo chất phân cực trước đến chất không phân cực sau  Ứng dụng Sắc kí lỏng phân bố hiệu cao dùng việc tách chất thuộc nhiều lĩnh vực như: - Thuốc kháng sinh, an thần, giảm đau, steroid Axit amin, protein, hydrat cacbon, lipid… Đường nhân tạo, chất chống oxi hóa, chất phụ gia, aflatoxin… 10 Chất thơm, chất điện hoạt, chất màu, hóa chất công nghiệp… Thuốc trừ sâu, diệt cỏ, phenol dẫn xuất phenol… Thuốc, chất độc, cồn máu… Sắc kí hấp phụ hiệu cao (sắc kí lỏng – rắn LSC) Là phương pháp phát triển sớm dùng phổ biến Trong phương pháp này, chất tan bị giữ bề mặt pha tĩnh tức chất hấp phụ bị dung môi đẩy (phản hấp phụ)  Pha tĩnh: pha tĩnh chất rắn mà bề mặt có chứa nhóm hidroxil phân cực bột mịn, silicagen nhôm oxit Ở chất bị phân cực  bị lưu giữ mạnh chậm rửa giải Pha động: dung môi không phân cực bảng cho ta dãy dung môi với sức rửa giải tăng dần từ xuống (thông số sức dung môi tăng dần) Dãy xếp theo khả đẩy chất khỏi nhôm oxit Nhưng với silicagen ta có dãy tương tự Muốn có dung môi có vị trí trung gian bảng ta dùng hỗn hợp dung môi theo tỉ lệ thích hợp Dung môi Ete dầu hỏa Hexan Heptan Xiclohexan Tetraclocacbon Ete propylic Toluene Benzene Ete etylic Clorofom Clometylen Dicloetan Aceton Dioxan Butanol Etyl acetat Acetonitril Pyridin Dimetylsunfoxit 0,01 0,01 0,01 0,04 0,18 0,28 0,29 0,32 0,38 0,40 0,42 0,49 0,56 0,56 0,56 0,58 0,65 0,71 0,75 11 Rượu isopropylic Rượu etylic  0,82 0,88 Ứng dụng: Sắc kí hấp thụ dùng nhiều để tách chất tương đối phân cực, chất hữu không tan nước có phân tử lượng nhỏ khoảng 5000 Phương pháp mạnh hẳn phương pháp khác việc tách đồng phân Sắc kí trao đổi ion hiệu cao (IEC) Pha tĩnh chứa nhựa trao đổi lớn dạng bột mịn, pha động thường dung dịch nước Pha tĩnh hạt mang sẵn điện tích định, hạt tương tác với phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, hạt mang điện âm tiến trình gọi sắc ký trao đổi ion dương, tương tác với phân tử mang điện tích dương Ngược lại, hạt mang điện tích dương gọi sắc ký trao đổi ion âm, tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, protein dấu với cột chạy khỏi cột protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích protein này, ta tăng nồng độ ion pha động, ion phân tử protein tương tác với hạt mang điện tích Ví dụ, sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác dung dịch tách giải ion natri tranh bám vào cột với protein có điện tích dương, đó, protein mang điện tích dương phóng thích cột theo độ lớn điện tích  Ứng dụng Phương pháp dùng để tách ion vô hữu Ví dụ cho dung dịch hỗn hợp ion Ba2+, Ca2+, Zn2+, Mg2+ qua cột cationit axit mạnh ion bị lưu giữ cột Khi dùng dung dịch axit loãng để rửa giải ion khỏi cột Mg 2+ , Zn2+ , Ca2+ Ba2+ Có thể phát ion rửa giải khỏi cột nhờ detector đo độ dẫn điện Sắc kí cặp ion (Ion pair chromatography- IPC) 12 Phần lớn sắc kí cặp ion (IPC) nảy sinh hạn chế sắc kí trao đổi ion như: - Các cột có khuynh hướng hiệu cột LC khác Các cột thường không cho kết lặp lại mức độ Các cột thường bền Độ chọn lọc Trong ICP ta sử dụng sắc kí pha thuận lẫn sắc kí pha đảo, loại có mặt thuận lợi riêng Pha tĩnh sắc kí pha đảo gồm có pha tĩnh silic silan hóa sử dụ ng bình thường ví dụ pha liên kết C18 C8 Pha động ICP gồm dung dịch đệm nước (cộng với dung môi hữu methanol acetonitril cho phép tách pha tĩnh liên kết) ion đối có điện tích ngược dấu với ion phân tử mẫu Ví dụ, giả sử cần tách số axit hữu cơ, pha động đệm pH =7 để tất hợp chất mẫu nằm dạng RCOO - Ion đối trường hợp dùng ion tetrabutyl amoni (TBA+) Cột dùng ICP chuẩn bị giống sắc kí pha liên kết pha thuận  Pha phân bố Bảng sau tóm tắt vài hệ thống ICP báo cáo tài liệu với ứng dụng rõ pha động, pha tĩnh, ion đối pH nước Pha động Ion đối N,Ndimethyl protrilylin e Loại mẫu pH Cyclohexan/CHCl3 0,1 MHClO4 Các hỗn hợp tributyl phosphate, ethyl acetate, butanol, CH2Cl2, và/hoặc hexan ClO4- Các amin Đệm HPO42-/PO43- Butanol/ CH2Cl2/Hexan (Butyl)4N+ Các axit cacboxylic Picrate Các amin (Butyl)4N+ Các sunfoamit pH 5-6 pH 6-8,5 Pentanol/ CH2Cl2 và/hoặc CHCl3 Butanol / Heptane Các axit cacboxylic 13 0,2-0,25M Butanol/ CH2Cl2/Hexane HClO4 0,1M methaneButanol/ CH2Cl2/Hexane sunfonic acid pH 8,3 Butanol/ CH2Cl2/Hexane ClO4- Amin amin bậc CH3SO3- Các amin (Butyl)4N+ Các axit cacboxylic Bảng Các hệ thống sắc kí cặp ion pha thuận Những nguyên tắc chung việc kiểm soát tách ICP tương tự sắc kí pha đảo pha thuận  Vai trò ion đối: Trong sắc kí pha đảo, lực dung môi thay đổi thay đổi ion đối thay đổi nồng độ Sự tăng nồng độ ion đối dẫn đến tăng hệ số dung lượng k’ ICP pha đảo Trong sắc kí ICP pha thuận pha đảo k’ thay đổi thay đổi loại ion đối (ví dụ thay pentasulfonat heptansunfonat chẳng hạn) Sự cộng thêm nhóm –CH2- dẫn đến k’ tăng lên khoảng 2.5 lần (ảnh hưởng lớn nồng độ ion đối thấp) Phân tử ion đối lớn giá trị k’càng lớn sắc kí pha đảo nhỏ sắc kí pha thuận  Độ phân cực dung môi Lực dung môi ICP pha thuận pha đảo thay đổi thay đổi độ phân cực pha động Trong hệ thống pha đảo, hỗn hợp nước với methanol acetonitril nói chung sử dụng pha động Khi phần trăm nước giảm xuống dung môi trở nên mạnh k’ mẫu giảm xuống o Các hỗn hợp butanol pentanol với CH2Cl2, CHCl3 có không thêm hexan pha động thường dùng sắc kí pha thuận ICP  Ảnh hưởng pH Giá trị k’ mẫu chịu tác động nhiều ICP thay đổi pH thay đổi dung môi dung môi khác (ví dụ từ acetat etyl thay butanol) 14 Nếu biết giá trị pKA axit pKB bazơ tách ta dự đoán lưu giữ tương đối hợp chất thay đổi theo pH Nói chung pH pha động trì hợp chất mẫu ion hóa hoàn toàn, tạo thành ion đối đạt cực đại Ví dụ tách axit pH pha động thấp anion mẫu X - nằm dạng HX dẫn đến số lượng mẫu nằm dạng ion đối pha tĩnh thấp  Ứng dụng ICP ứng dụng mẫu phân cực bazơ, ion, hợp chất có nhóm ion hóa Các mẫu nước, bao gồm dịch sinh lí, nhận quan tâm ICP Sắc kí loại theo cở (Size Exclusion Chromatography) Sắc kí loại theo cở hay gọi sắc kí gel công cụ mạnh cho phân tích chất có khối lượng phân tử lớn Chất nhồi cột cho sắc kí hạt nhỏ (cở 10 micromet) polime silica chứa mạng lưới lỗ đồng chất tan dung môi khuếch tán vào Trong lỗ phân tử bị bẫy cách hiệu bị tách từ dòng chảy pha động Thời gian cư ngụ trung bình lỗ phụ thuộc vào kích thước hiệu dụng phân tử Các phân tử có kích thước lớn so với kích thước trung bình lỗ chất nhồi không bị lưu giữ Còn phân tử có đường kính nhỏ đáng kể kích thước lỗ thâm nhập sâu vào sâu lỗ cần nhiều thời gian để khỏi lỗ, dẫn đến bị rửa giải sau Nằm hai loại phân tử có kích thước trung bình xâm nhập vào lỗ nhiều hay tùy thuộc đuồng kính chúng Chú y sắc kí loại theo cở khác với trường hợp xét trước đây, tương tác hóa học vật lí phân tử chất tan pha tĩnh  Chất nhồi cột Có hai loại: Các hạt polime silica có đường kính từ đến 10 micromet Loại sau cứng nên dễ nhồi cột, bền hơn, cho phép sử dụng khoảng rộng dung 15 môi bao gồm nước, cân thiết lập nhanh dung môi mới, bền nhiệt độ cao Những nhược điểm hạt silica có khuynh hướng lưu giữ chất tan hấp phụ có tiềm xúc tác cho phản ứng phân hủy phân tử chất tan Hầu hết sắc kí loại theo cở thực chất nhựa đồng trùng hợp divinyl benzene với styrene Kích thước lỗ loại polime kiểm soát mở rộng liên kết ngang liên quan đến phần trăm divinylbenzen sử dụng để sản xuất nhựa Vì có nhiều loại gel với kích cỡ lỗ khác Lúc đầu, nhựa đồng trùng hợp kỵ nước sử dụng với pha động dung môi không nước Hiện nay, gel ưa nước có sẵn (ví dụ poliacrylamide) dẫn dến sử dụng dung môi nước cho phép tách phân tử chất tan nước ví dụ loại đường Các loại silica hạt thủy tinh có kích thước lỗ trung bình khoảng 40 đến 2500 Ao có sẵn thị trường Để giảm hấp phụ, bề mặt chất thường chuyển hóa chất hữu V Một số đại lượng phân tích sắc ký Hệ số phân bố Cân cấu tử X hệ sắc ký mô tả phương trình sau: Hằng số cân K cho cân gọi tỉ lệ phân bố hay số phân bố (partition coefficient) tính sau: Với CS : nồng độ cấu tử pha tĩnh CM : nồng độ cấu tử pha động Hệ số K tùy thuộc vào chất pha tĩnh, pha động chất phân tích Thời gian lưu tR : thời gian lưu cấu tử từ vào cột đến tách ngồi cột tO : thời gian chất lực với pha tĩnh qua cột; 16 thời gian pha động từ đầu cột đến cuối cột gọi thời gian lưu chết tR' : thời gian lưu thật cấu tử tR’=tR-to Hình Thời gian lưu cấu tử phân tích Hệ số dung lượng k’ k’ định nghĩa theo công thức sau: Với VS : thể tích pha tĩnh VM : thể tích pha động Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất nhanh, cột khả giữ chất lại Nếu k’ lớn (tR lớn): chất cột lâu, thời gian phân tích lâu, mũi có khả bị tù Khoảng k’ lý tưởng - 5, phân tích hỗn hợp phức tạp, k’ chấp nhận khoảng rộng - 20 Hiệu Hiệu hay số đĩa lý thuyết N cột đặc trưng cho khả tách mũi sắc ký cấu tử cột N lớn, hiệu tách cao Số đĩa lý thuyết đo sắc ký đồ Người ta chứng minh được: 17 Hay Với W1/2 chiều rộng mũi sắc ký vị trí ½ chiều cao mũi (phút) W chiều rộng mũi sắc ký vị trí đáy mũi (phút) Độ chọn lọc Đặc trưng cho khả tách hai chất cột Độ phân giải Đây đại lượng biểu thị rõ ba khả cột sắc ký: giải hấp, chọn lọc hiệu tách Nó xác định qua phương trình sau: Hay VI Ứng dụng HPLC xem phương tiện để định tính, định lượng có độ nhạy cao, xác, giảm thời gian sắc ký, tốn mẫu, áp dụng cho hầu hết chất như: chất dễ bị phân hủy nhiệt độ, acid amin, protein, acid nucleic, cacbohydrat, kháng sinh, thuốc trừ sâu, chất vô cơ,… Thiết bị HPLC ngày phát triển đại nhờ phát triển nhanh chóng ngành chế tạo sản xuất thiết bị phân tích Để đảm bảo chất lượng kết phân tích nhiều loại tiêu mẫu khác nhau, đáp ứng nhu cầu phân tích đa dạng khách hàng, CASE đầu tư hệ thống HPLC đại hãng tiếng giới sản xuất thiết bị phân tích Shimadzu (model 10A, 20A), Agilent (LC 1200), Dionex (UltiMate 3000), Thermo, Mehtrom…với hầu hết đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), huỳnh quang (RF), khúc xạ (RI), đo độ dẫn (sắc ký ion 18 -IC), khối phổ (MS),… Các hệ thống HPLC có gắn chích mẫu tự động nhằm nâng cao tính xác phân tích đồng thời nhiều mẫu Hệ thống HPLC 10A : Hệ thống HPLC 20A Tài liệu tham khảo Bài giảng Phân tích thực phẩm https://en.wikipedia.org/wiki/High-performance_liquid_chromatography http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/lc/hplc.htm http://case.vn/vi-VN/34/96/118/details.case 19 [...]... (RI), đo độ dẫn (sắc ký ion 18 -IC), khối phổ (MS),… Các hệ thống HPLC này đều có gắn các bộ chích mẫu tự động nhằm nâng cao tính chính xác và có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu Hệ thống HPLC 10A : Hệ thống HPLC 20A Tài liệu tham khảo 1 2 3 4 Bài giảng Phân tích thực phẩm https://en.wikipedia.org/wiki/High-performance_liquid_chromatography http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/lc /hplc. htm http://case.vn/vi-VN/34/96/118/details.case... tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột N càng lớn, hiệu năng tách càng cao Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ Người ta chứng minh được: 17 Hay Với W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút) W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút) 5 Độ chọn lọc Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột 6 Độ phân giải Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự... nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo và sản xuất thiết bị phân tích Để đảm bảo chất lượng kết quả phân tích nhiều loại chỉ tiêu trên các nền mẫu khác nhau, đáp ứng được nhu cầu phân tích đa dạng của khách hàng, CASE cũng đã đầu tư các hệ thống HPLC hiện đại của các hãng nổi tiếng trên thế giới trong sản xuất thiết bị phân tích như Shimadzu (model 10A, 20A), Agilent (LC 1200), Dionex (UltiMate... điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, nếu hạt mang điện âm tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy... cho các phép tách các phân tử chất tan trong nước ví dụ các loại đường Các loại silica và hạt thủy tinh có kích thước lỗ trung bình của khoảng 40 đến 2500 Ao hiện có sẵn trên thị trường Để giảm sự hấp phụ, bề mặt của những chất này thường được chuyển hóa bởi những chất thế hữu cơ V 1 Một số đại lượng cơ bản trong phân tích sắc ký Hệ số phân bố Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả... 2 Thời gian lưu của cấu tử phân tích 3 Hệ số dung lượng k’ k’ được định nghĩa theo công thức sau: Với VS : thể tích pha tĩnh VM : thể tích pha động Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù Khoảng k’ lý tưởng là 2 - 5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp,... ICP được ứng dụng trong những mẫu phân cực như các bazơ, các ion, và các hợp chất có các nhóm ion hóa Các mẫu nước, bao gồm các dịch sinh lí, cũng nhận được sự quan tâm của ICP 5 Sắc kí loại theo cở (Size Exclusion Chromatography) Sắc kí loại theo cở hay còn gọi là sắc kí trên gel là một công cụ mạnh cho phân tích các chất có khối lượng phân tử lớn Chất nhồi cột cho sắc kí này là các hạt nhỏ (cở 10... của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích  Ứng dụng Phương pháp này được... axit cacboxylic Bảng Các hệ thống sắc kí cặp ion pha thuận Những nguyên tắc chung trong việc kiểm soát sự tách trong ICP tương tự như trong sắc kí pha đảo và pha thuận  Vai trò của ion đối: Trong sắc kí pha đảo, lực dung môi được thay đổi bởi thay đổi ion đối hoặc thay đổi nồng độ của nó Sự tăng nồng độ của ion đối dẫn đến sự tăng hệ số dung lượng k’ trong ICP pha đảo Trong sắc kí ICP pha thuận và... k’ tăng lên khoảng 2.5 lần (ảnh hưởng sẽ lớn hơn nếu nồng độ của ion đối thấp) Phân tử ion đối càng lớn thì giá trị k’càng lớn trong sắc kí pha đảo và càng nhỏ trong sắc kí pha thuận  Độ phân cực của dung môi Lực dung môi trong ICP pha thuận và pha đảo có thể được thay đổi bởi thay đổi độ phân cực của pha động Trong các hệ thống pha đảo, hỗn hợp nước với methanol hoặc acetonitril nói chung được sử dụng ... (RI), đo độ dẫn (sắc ký ion 18 -IC), khối phổ (MS),… Các hệ thống HPLC có gắn chích mẫu tự động nhằm nâng cao tính xác phân tích đồng thời nhiều mẫu Hệ thống HPLC 10A : Hệ thống HPLC 20A Tài liệu... chuyển hóa chất hữu V Một số đại lượng phân tích sắc ký Hệ số phân bố Cân cấu tử X hệ sắc ký mô tả phương trình sau: Hằng số cân K cho cân gọi tỉ lệ phân bố hay số phân bố (partition coefficient) tính... bị phân tích Để đảm bảo chất lượng kết phân tích nhiều loại tiêu mẫu khác nhau, đáp ứng nhu cầu phân tích đa dạng khách hàng, CASE đầu tư hệ thống HPLC đại hãng tiếng giới sản xuất thiết bị phân