Tìm hiểu về hệ thống phân tích sắc ký lỏng HPLC

Tìm hiểu về hệ thống phân tích sắc ký lỏng HPLC

I. Khái niệm

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ

Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có

độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc

dễ phân hủy nhiệt

Bản chất chính của sự tách trong loại sắc ký này là dựa trên sự hấp phụ bề mặt của pha tĩnh Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ Vì thế tất cả các tính chất động học hấp phụ của bề mặt pha tĩnh đều có ảnh hưởng đến kết quả của sự sắc ký một hỗn hợp chất mẫu

II. Cấu tạo

Các bộ phận cơ bản của một máy HPLC được mô tả trong sơ đồ nguyên tắc chung:

Hình 1 Sơ đồ máy HPLC

1. Bình chứa dung môi và pha động

Bình đựng dung môi thường làm bằng thủy tinh thể tích thay đổi từ 100ml - 2l Bình làm bằng thủy tinh màu nếu chứa những chất nhạy với ánh sáng, bình phải thật kín nếu pha động là những chất bay hơi Ví dụ như aceton, methanol,…Nếu không nồng độ sẽ bị thay đổi

Đôi khi phải có hệ thống khử khí vì vài dung môi có thể hòa tan khí trong khí quyển nhất là oxygen, người ta cũng có thể khí bằng siêu âm hay bằng cách sục khí Helium vào (He ít tan trong dung môi nhưng có thể đẩy các khí khác ra khỏi dung môi)

Pha động là dung môi để rửa giải chất tan (chết phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký Pha động trong HPLC có thể là dung môi hữu cơ đơn như methanol, acetonitrile, benzene, n-hexene, water, hay cũng có thể là hỗn hợp của hai hoặc ba dung môi được trộn vào nhau theo những tỉ lệ phù hợp Ví dụ như: hỗn hợp methanol với nước theo tỉ lệ 70 methanol/ 30 nước, acetonitrile với nước theo

tỉ lệ 80/20… Nó cũng có thể là dung môi nước có chứa các chất đệm pH, chất tạo phức, chất làm chậm… với nồng độ nhất định

Nói chung với mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi (pha động) rửa riêng thích hợp với nó, để có thể thu được kết quả tốt nhất Sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu Nghĩa là trong một

hệ pha, thì pha động và pha tĩnh là hai yếu tố chính của quá trình sắc ký Hai yếu tố này giữ vai trò quyết định thời gian lưu giữ của các chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký

Nói chung, pha động có thể ảnh hưởng đến những vấn đề sau của sự tách sắc ký của các chất:

- Độ chọn lọc của hệ pha

- Thời gian lưu giữ của các chất tan

- Hiệu lực của cột tách

- Độ rộng của peak sắc ký

Do đó, với một pha tĩnh đã chọn rồi, nếu như chúng ta lại chọn được một dung môi

có thành phần phù hợp, thì ta sẽ có hiệu tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu là tốt nhất đối với một pha tĩnh đã chọn

Vì vậy, pha động là một yếu tố linh động và phải thỏa mãn một số điều kiện sau đây:

- Pha động phải trơ đối với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh theo bất kì một tính chất nào trong quá trình sắc ký Không có sự tương tác phụ với pha tĩnh

để sinh ra những sản phẩm khác làm phức tạp cho quá trình sắc ký

- Pha động phải hòa tan được chất mẫu Có như thế mới làm cho chất mẫu được vận chuyển tốt từ đầu cột đến cuối cột tách khi thực hiện quá trình rửa giải

- Pha động phải bền vững theo thời gian, nghĩa là không bị phân hủy hay thay đổi không theo ý muốn khi chạy sắc ký

- Pha động phải có độ tinh khiết cao, để đảm bảo không bị nhiễm bẩn phân tích gây sai số cho kết quả phân tích Nghĩa là các chất để pha chế pha động phải có độ tinh khiết cao

- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký, như cân bằng hấp phụ, phân

bố, trao đổi ion, tùy theo bản chất từng loại sắc ký

- Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích Ví dụ detector UV-Vis thì pha động phải trong suốt vùng phổ đó, hay detector huỳnh quang thì pha động phải không có tính chất huỳnh quang

- Điều kiện cuối cùng là pha động phải có tính kinh tế, không hiếm, không quá đắt

Đó là yêu cầu cần thiết đối với một hệ pha động trong kỹ thuật tách HPLC cho phân tích hỗn hôp mẫu nhất định

2. Pha tĩnh

Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách sắc ký một hỗn hợp chất phân tích

Nó là những chất rắn xốp và có kích thước hạt nhỏ Song dù ở dạng nào thì pha tĩnh trong HPLC cũng phải thỏa mãn những yêu cầu cơ bản sau đây:

Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không có phản ứng hóa học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích, để đảm bảo cơ chế của

sự tách là đúng theo bản chất chính của pha tĩnh, hay không mất chất phân tích cần tách

Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký nhất định

Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt là có đặc trưng độ xốp của nó và không bị thay đổi hay biến dạng trong quá trình sắc ký, không bị phân rả dưới áp suất cao của quá trình sắc ký

Cân bằng động của quá trình sắc ký phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt Có như thế mới đảm bảo thu được kết quả tách tốt

Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất, nghĩa là đường kính của các hạt lớn nhất so với các hạt nhỏ nhất không chênh lệch nhau quá 10% và trên 85% số hạt phải nằm trong vùng có kích thước trung bình Có như thế cột tách mới có hiệu quả cao

Đó là yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật HPLC

Trong sắc ký hấp phụ pha đảo, pha tĩnh thường là các silica đã alkyl hóa, do đó nó

ít phân cực hay không phân cực Pha động là hệ dung môi phân cực

3. Bơm

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Bơm phải đạt được áp suất cao khoảng 250 - 600bar và tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 10ml/phút

Gồm các bộ phận như sau:

- Đầu bơm có hai van điều tiết, mỗi van có một lỗ nhỏ với một bi Các van này đảm bảo cho việc hút pha động từ thân bơm vào cột sắc kí được an toàn

- Thân bơm có một pittông để chuyển động đi lại Khi pittông tiến tới, một bi đóng lỗ phía cột lại và bi khác nhấc ra để pha động đi vào than, khi pittông

lùi lại một bi đóng bình đựng dung môi và mở lỗ ở phái cột để pha dao động vào cột sắc ký

4. Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy Với dung tích của l bóp là 5 - 100µl

Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột :

- Tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay)

- Tiêm mẫu tự động (Autosample)

5. Cột sắc ký

Cột dùng trong sắc ký lỏng thường là một ống làm bằng thép không rỉ hoặc làm bằng thủy tinh đặc biệt (chỉ dùng khi áp suất khoảng 60psi)

Cột là trái tim của một quá trình sắc ký, cột là một yếu tố quan trọng quyết định đến kết quả của quá trình sắc ký của một hỗn hợp mẫu Cột tách có nhiều kích thước khác nhau thường có chiều dài từ 10-25 cm, đường kính trong 2-5 mm

6. Đầu dò (detector) trong sắc ký lỏng hiệu năng cao

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc

ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất phân tích

mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp

Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…

Khi cho chất tan đi ngang qua tế bào đo, đầu dò sẽ tạo nên những tín hiệu điện Mọi

sự thay đổi về độ lớn vật lý của chất tan sẽ được chuyển đổi thành xung điện và có thể đọc được trên máy ghi

Sự giải đáp của đầu dò tỉ lệ với lượng chất tan hay nồng độ chất tan trong tế bào, lặp lại và độc lập với chất rửa giải (trừ trường hợp rửa giải với gradient đổi với vài loại đầu dò) Đầu dò tốt là phải cho kết quả bền, nhanh, lặp lại Nó cũng phải có độ nhạy tốt với cùng nồng độ và không biến đổi chất lượng tách

Dựa vào tính chất của mẫu chất cần phân tích mà ta có các loại detector sau:

- Detector UV-Vis

- Detector huỳnh quang

- Detector điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn

- Detector khối phổ

- Detector diode phát quang và diode mảng…

Đây là loại phổ biến nhất trong HPLC Nguyên tắc của nó là cho pha động từ cột được chảy qua một ống đo (flowcell) nhỏ có một chùm bức xạ đơn sắc UV/VIS chiếu qua Sự hấp thu bức xạ của chất tan là một hàm phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C của nó theo định luật Lambert - Beer:

D = εlC

Ở đây:

D là đại lượng mật độ quang;

l là chiều dài của cell;

ε là hệ số hấp thu phân tử và là hằng số cho một chất tan và bước sóng Đơn vị của ε phụ thuộc vào thứ nguyên của l và C Trong hê SI thứ nguyên của C

là mol m-3, l là mét nhưng trong thực tế C được đo với mol dm-3 còn l là cm nên ε là

dm3 mol-1 cm-1.

Định luật Lambert – Beer chỉ đúng khi chùm sáng bị hấp thu là đơn sắc, nhưng hệ thống detector thường không cung cấp chùm tia đủ đơn sắc mà chỉ một dải hẹp các chùm tia quanh giá trị bước sóng được chọn Một ống đo (flow cell) trong UV

detector có đường kính trong khoảng 1 mm và chiều dài ánh sáng đi qua khoảng 10

mm, như vậy thể tích chứa khoảng dưới 8 µl

7. Hệ thống thu nhận và xử lý số liệu

Đó là các trạm dữ liệu hiện đại tiếp nhận và lưu giữ các tín hiệu phát ra từ các detector và in các sắc ký đồ hoàn chỉnh với chiều cao, diện tích các đỉnh, các thông

số định tính mẫu và các biến số của phương pháp Chúng còn được sử dụng để lập chương trình sắc ký, kiểm soát hầu hết các biến số và theo dõi thường xuyên trong thời gian vận hành dài không có người trông coi

Với tiến bộ của công nghệ thông tin, hiện nay bộ phận thu nhận và xử lý số liệu cùa các hệ thống HPLC thường là các máy vi tính hiện đại có khả năng ghi nhận, lưu giữ, biên tập, xử lý thông tin hết sức hiệu quả

Nhờ các phần mềm cài đặt tương thích với các chương trình của các detector khác nhau, các máy vi tính hỗ trợ rất hiệu quả cho việc định tính, định lượng các chất phân tích dựa vào các cơ sở dữ liệu được cài sẵn

Nguyên tắc hoạt động của hệ thống bơm cao áp bơm liên tục qua cột với tốc độ dòng được điều chỉnh Khi mẫu được tiêm vào loop và theo dòng dung môi đi vào cột Quá trình tách sắc ký xảy ra trong cột Sau khi mẫu chất được tách ra khỏi cột thì được đầu dò ghi nhận tín hiệu và chuyển thành tín hiệu điện thể hiện từng peak lên sắc ký đồ

III. Nguyên tắc hoạt động

Mẫu chất lỏng được hòa tan trong một dung môi thích hợp, đưa vào buồng bơm mẫu sau đó được bơm tự động vào cột tách Quá trình tách xảy ra ở đây

Do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển dọc trên cột với tốc độ khác nhau

Sau khi các cấu tử tách ra khỏi nhau và thoát ra khỏi cột sẽ lần lượt đi vào detector,

ở đây tín hiệu được ghi lại, chuyển thành tín hiệu điện Tín hiệu này được khuyếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi Các tín hiệu được xử lý và chuyển ra ngoài một sắc kí đồ

Trên sắc ký đồ nhận được, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là peak

• Quá trình tách trong sắc ký:

- Là sự vận chuyển và phân bố liên tục của chất phân tích từ đầu cột đến cuối cột

- Quá trình tách dựa vào tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất Dựa trên 2 quá trình là hấp phụ và giải hấp phụ

- Xảy ra liên tục giữa 2 pha: pha tĩnh là chất lỏng hoặc chất rắn có nhiệm vụ giữ chất phân tích, pha động là chất lỏng (1 chất hoặc hỗn hợp nhiều chất) có nhiệm vụ hòa tan và di chuyển chất phân tích

- Chất phân tích luôn phân bố giữa 2 pha, trong đó pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định

- Hiệu quả của quá trình tách phụ thuộc rất nhiều vào tương tác giữa các chất trong pha tĩnh và pha động

Ví dụ: Tách một hỗn hợp gồm hai chất A và B:

Mẫu chứa A và B được tiêm vào cột Khi cho một chất rửa giải bắt đầu chảy qua cột, phần của mẫu được hòa tan trong pha động được di chuyển tại phần đầu của cột Ở đây các cấu tử A và B tự phân bố giữa hai pha Tiếp tục cho pha động đi qua cột thì nó sẽ đẩy phần hòa tan này chạy xuống dưới và một sự phân bố mới giữa pha động và pha tĩnh sẽ xảy ra Đồng thời sự phân bố giữa dung môi mới và pha tĩnh cũng diễn ra tại vị trí của mẫu lúc đầu Việc thêm tiếp dung môi sẽ mang các phân tử hòa tan chạy xuống cột trong một loạt liên tiếp các chuyển biến giữa hai pha Bởi vì sự di chuyển của chất tan chỉ xảy ra trong pha động, nên tốc độ trung bình của sự di chuyển chất tan phụ thuộc vào phần thời gian chất tan ấy nằm trong pha đó Phần thời gian này là nhỏ đối với chất tan bị lưu giữ mạnh bởi pha tĩnh (cấu

tử B trong ví dụ trên) và lớn đối với chất tan (cấu tử A) có sự lưu giữ trong pha động mạnh hơn Sau một thời gian các phân tử chất A và B dần dần được tách khỏi nhau

IV. Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

- Sắc ký phân bố hiệu năng cao (Partition chromatography)

- Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (Sắc kí lỏng - rắn LSC)

- Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao (IEC)

- Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)

- Sắc kí loại theo cở (Size Exclusion Chromatography)

1. Sắc kí phân bố hiệu năng cao

Gồm hai loại phương pháp sắc ký lỏng – lỏng và sắc kí pha liên kết

a) Sắc kí lỏng lỏng (LLC)

Pha tĩnh là chất lỏng được phủ trên bề mặt của các hạt chất mang (support)

Pha tĩnh thường bị dung môi hòa tan và mất dần làm cột dần mất hiệu lực nên phương pháp này ngày càng ít được sử dụng

b) Sắc kí pha liên kết (Bonded phase Chromatography)

Pha tĩnh được gắn hóa học (liên kết) với chất mang (hạt silicagen) tạo nên hợp chất

cơ siloxan

Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl và pha động là dung môi phân cực như H2O, methanol, acetonitril thì có sắc kí pha đảo (hay sắc kí pha ngược) Ở đây pha tĩnh ít phân cực hơn pha động, trái với truyền thống của sắc kí trước đây là pha tĩnh phân cực hơn pha động Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin –(CH2)nNH2 hay alkylnitril –(CH2)n-CN và pha động là dung môi ít phân cực như hexan thì ta có sắc kí pha thuận Hiện nay sắc kí pha đảo được dùng rộng rãi vì những lí do sau:

- Các phân tử không phân cực, ít phân cực, ion, hoặc có thể ion hóa có thể được tách một cách hiệu quả

- Pha tĩnh có một khoảng phân cực rất rộng để có thể chọn lựa

- Nó cho phép chọn một khoảng rộng chất rửa giải

- Các chất dung môi rửa giải rất thông dụng và không đắt (nước, methanol và acetonitril)

- Kỹ thuật rửa giải gradient có thể được sử dụng mà không sợ hỏng pha tĩnh

- Không có hạn chế về áp suất pha động đi vào cột

- Nó cho kết quả tách tốt với rất nhiều đối tượng tách

 Chọn các pha: thường chọn pha tĩnh có tính phân cực giống với các chất cần tách

và khác với pha động Các chất hữu cơ có độ phân cực tăng theo thứ tự sau: Hydrocacbon no, ôlefin, hydrocacbon thơm, halogenua, sunfua, ête, dẫn xuất nitro, este = andehit = xeton, ancol = amin, sunfon, sunfoxit, amit, axit cacboxilic, nước Thứ tự rửa giải trong sắc kí pha thuận là các chất không phân cực ra trước rồi đến các chất phân cực mạnh hơn Trong sắc kí pha đảo các chất phân cực ra trước rồi đến các chất ít và không phân cực lần lượt ra sau

 Ứng dụng

Sắc kí lỏng phân bố hiệu năng cao được dùng trong việc tách các chất thuộc nhiều lĩnh vực như:

- Thuốc kháng sinh, an thần, giảm đau, steroid

- Axit amin, protein, hydrat cacbon, lipid…

- Đường nhân tạo, chất chống oxi hóa, chất phụ gia, aflatoxin…

- Chất thơm, chất điện hoạt, chất màu, hóa chất công nghiệp…

- Thuốc trừ sâu, diệt cỏ, phenol và các dẫn xuất phenol…

- Thuốc, chất độc, cồn trong máu…

2. Sắc kí hấp phụ hiệu năng cao (sắc kí lỏng – rắn LSC)

Là phương pháp phát triển sớm nhất và được dùng rất phổ biến Trong phương pháp này, chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ)

 Pha tĩnh: pha tĩnh là chất rắn mà trên bề mặt có chứa các nhóm hidroxil phân cực

như những bột mịn, silicagen và nhôm oxit Ở đây các chất càng bị phân cực càng

bị lưu giữ mạnh và ra chậm khi rửa giải

 Pha động: là một dung môi không phân cực bảng dưới cho ta một dãy các dung

môi với sức rửa giải tăng dần từ trên xuống (thông số sức dung môi tăng dần) Dãy này được xếp theo khả năng đẩy các chất ra khỏi nhôm oxit Nhưng với silicagen ta cũng có dãy tương tự Muốn có dung môi có vị trí trung gian không có trong bảng thì ta dùng hỗn hợp dung môi theo tỉ lệ thích hợp

Dung môi

Tetraclocacbon 0,18 Ete propylic 0,28

Dimetylsunfoxit 0,75