CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT

 Dựa trên sự khác nhau rõ rệt về độ tan của các chất trong một dung môi ở các nhiệt độ khác nhau  Chất rắn được hòa tan với lượng dung môi nóng tối thiểu mà ở đó độ tan của chúng ở 2

+ ái lực hóa học giữa các thành phần trong 1 hỗn hợp

 Trong ngành Dược, các đối tượng phân tích thường là những hỗn hợp phức tạp: cây thuốc,

thuốc, dịch cơ thể,… → nhiều chất gây nhiễu → thường phải qua giai đoạn tách để loại để lấy riêng chất cần định lượng

 Ví dụ:

 Xác định hàm lượng tinh dầu trong vỏ bưởi,

 Đinh lượng paracetamol trong nước tiểu, …

-ii- Khối lượng và mật độ  Ly tâm

-iii- Biến đổi

trạng thái một) Vật lý  Chưng cất

B QUÁ TRÌNH TÁCH DỰA VÀO KÍCH THƯỚC

 Dựa vào vật liệu có lỗ mà qua đó chất cần phân tích hay chất nhiễu đi qua

1- Phương pháp lọc (filtration)

 Tách pha lỏng khỏi pha rắn

 Giữ tạp lại giấy lọc

 Tách chất phân tích dạng kết tủa khỏi dung dịch

a Chất liệu dùng để lọc

-i- Khái niệm

 Là những vật liệu dạng sợi hay dạng chất xốp dùng giữ chất rắn lại và cho chất lỏng đi

 Thủy tinh (phễu lọc

thủy tinh xốp/bông thủy

 Không chịu được một số dung môi hữu cơ

 Ví dụ: màng lọc cellulose acetat (0.45 hay 0.22  m) lọc dung dịch

mẫu trước khi phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

b Các kỹ thuật lọc

-i- Lọc ở áp suất thường

 Phễu thủy tinh

 Giấy lọc

-ii- Lọc ở áp suất giảm (lọc chân không)

 Phễu lọc thủy tinh xốp

 Cốc lọc thủy tinh xốp

 Dịch lọc hứng vào bình nón có vòi hút nối với bơm chân không

2- Phương pháp thẩm phân (dialysis)

 Sự dụng màng bán thấm có cấu tạo từ cellulose:

 lỗ hạt 1-5 nm

 Cho các phân tử nhỏ và trung bình đi qua

 Giữ lại các phân tử lớn

 Chất tan từ dung dịch trong pha A thấm qua màng sang pha B cho tới khi nồng độ của các chất đó trong 2 pha bằng nhau

 Ứng dụng: tách protein, hormone, enzyme (kích thước lớn) ra khỏi dịch sinh học có chứa

các chất muối khoáng hòa tan (kích thước nhỏ, qua được màng thẩm tích)

3- Phương pháp sắc ký rây phân tử - sắc ký thẩm thấu gel (size-exclusion

 Các chất tan trong pha động khi đi qua gel này bằng kỹ thuật thẩm thấu

 Dùng trong sinh hóa, tách các phân tử có kích thước lớn: protein, các carbohydrate, …

C PHƯƠNG PHÁP LY TÂM - QUÁ TRÌNH TÁCH DỰA VÀO KHỐI LƯỢNG VÀ TỶ TRỌNG (CENTRIFUGATION)

 Dùng sức ly tâm (lực ly tâm) để làm lắng tủa

 m: khối lượng tiểu phân chất kết tủa

 R: bán kính vòng quay hay cánh tay đòn

 Tăng tốc độ lắng, tăng số vòng quay n

Thành phần Lực ly tâm (g) Số vòng quay (n) Thời gian (phút)

 Ví dụ: tách hỗn hợp protein, AND, RNA khi mật độ của chúng khác nhau Phân tử có mật

độ càng lớn càng lắng sâu xuống ống ly tâm (mật độ: ARN>AND>protein)

D QUÁ TRÌNH TÁCH DỰA VÀO BIẾN ĐỔI TRẠNG THÁI

c Phương pháp kết tinh lại

 Tinh chế chất rắn

 Dựa trên sự khác nhau rõ rệt về độ tan của các chất trong một dung môi ở các nhiệt độ khác nhau

 Chất rắn được hòa tan với lượng dung môi nóng tối thiểu mà ở đó độ tan của chúng ở 2 trạng thái nóng &

lạnh khác nhau đáng kể

 Quá trình làm lạnh sẽ giúp xuất hiện những mầm tinh thể kết tinh

 Chất rắn tinh khiết sau khi kết tinh lọc  tách ra khỏi hỗn hợprửa sạch lại loại bỏ tạp chất hòa

tansấy khô loại dung môi

 Nguyên tắc chọn dung môi:

 Không tương tác hóa học với chất cần tinh chế ở cả điều kiện nóng và lạnh

 Hòa tan rất ít chất cần tinh chế khi làm lạnh

 Chất phân cực dễ tan trong dung môi phân cực và ngược lại

 ứng dụng: trong tổng hợp hóa dược tinh chế làm sạch mẫu sau khi tổng hợp aspirin,

acetanilide, acid benzoic, …

 Định lượng Cu trong hỗn hợp đồng thau có lẫn tạp chất là Sn

 Hòa tan mẫu với acid mạnh, SnO2 được loại khỏi hỗn hợp bằng cách lọc

E QUÁ TRÌNH TÁCH DỰA VÀO TỶ LỆ GIỮA CÁC PHA

1- Các phương pháp chiết (extraction)

 Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn/hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn

hợp cần nghiên cứu

 Cơ chế tách: bằng chuyển pha dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha Avà B không hòa tan lẫn được

vào nhau

 Thường gặp: chiết hoạt chất từ dung dịch nước vào dung môi hữu cơ

 Mục đích: tách riêng từng phần hay hoàn toàn chất cần nghiên cứu ra khỏi các thành phần gây trở ngại có

 dung môi có tỷ trọng nhỏ hơn nước: ether, benzene, hydrocarbur, …

 dung môi có tỷ trọng lớn hơn nước: chloroform, tetrachloride carbon, dichloroetan, …

2- Phương pháp sắc ký

 Sắc ký là một quá trình trong đó các chất tan được tách riêng ra bởi quá trình dịch chuyển

khác nhau về động lực học của các chất này trong một hệ thống >=2 pha

 Pha động:

 chuyển động một cách liên tục và theo một hướng nhất định

 Các chất riêng biệt thể hiện linh độ khác nhau về:

+ sự phân bố,

+ sự hấp phụ, + + điện tích, kích thước phân tử, + + độ hòa tan, áp suất hơi

 Chỉ có các phân tử pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký

 Các chất khác nhau có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình chuyển

động dọc theo hệ sắc ký hế lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp

thụ và phản hấp thụ

 Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký

so với các chất thương tác yếu hơn pha này

A CHIẾT LỎNG-LỎNG

1- Một số thông số sử dụng trong chiết lỏng-lỏng

a Hệ số phân bố K

 Lắc dung dịch A chứa chất tan S với dung môi B (dung môi chiết) thì khi quá trình phân bố

S vào 2 pha trên đã đạt tới trạng thái cân bằng có Hệ số phân bố

+ Là hằng số ở một nhiệt độ xác định và trong những điều kiện lý tưởng

+ Đặc trưng cho một chất tan và một cặp dung môi xác định A và B

+ Phụ thuộc vào nhiệt độ, áp suất, tính chất của chất tan và dung môi

+ K càng lớn, quá trình chiết càng hiệu quả

Ether etylic nước + HF 0,001



 Giả sử chất tan được phân bố giữa hai pha

 S1 (pha 1) S𝐾 2 (pha 2)

 K= [𝑆]1

[𝑆]2

 Pha 1 (thể tích V1) có chứa m mol chất tan S được chiết bằng pha 2 (thể tích V2)

 Gọi q1 là % S còn lại trong pha 1, nồng độ S trong pha 1: 𝑚 ∗𝑞1

𝑉1

 (1-q1) là % S được chiết sang pha 2, nồng độ S trong pha 2:

2

) 1 1 (

) 1 1

(

V

m q

V

m q

1

1 V KV

V

q  

 Nếu loại pha 2 cũ đi và thay bằng pha 2 mới và lắc lại với pha 1, phần chất tan còn lại sau

khi cân bằng (Tiến hành chiết lần 2):

2 ) 2 1

1 2 1

V q

KV V

V q

 Sau n lần chiết với V2, S còn lại trong pha 1:

n

KV V

V n

 Chất B có hệ số phân bố giữa nước/ete là 2 Ban đầu có 200ml dung dịch B/nước

 Hỏi phải chiết bao nhiêu lần, mỗi lần 100ml ete để lấy được hết B ra? (xem chiết kiệt khi

H = 99.9%)

b Hệ số phân bố biểu kiến KD – hệ số phân chia D

 Điều kiện không lý tưởng:

C

C K

  CB,  CA: tổng nồng độ các dạng khác nhau của chất tan trong B và A

 KD: không bắt buộc là hằng số

 B là một base hữu cơ:

 BH+ chỉ tồn tại trong pha nước BH+ <=====> B + H+

 Pha 1: pha nước

 Pha 2: pha DMHC

 Khi lắc 2 pha với nhau và khi cân bằng:

1 1

2

][][

][







BH B

B D

 Ta có:

1

2

][

][

][][][

][][

H B

K a



][ 







H K

K K

D

a

a

 Hệ số phân chia phụ thuộc vào pH

 HA là một acid và A không tồn tại trong dung môi hữu cơ

2

][]

[

][

HA A

HA D

][][

HA

H A

][

H Kx D

a

hệ số phân chia phụ thuộc pH

 Ví dụ: Dung dịch nước của một amin 0,010 M có K = 3, Kb = 1 x 10 -5 , 50 ml dung dịch trên được chiết bằng 100 ml dung môi  Lượng amin chiết vào pha hữu cơ ?

)100,1100,1(

)100,10,3(

10 9

)100,10,3(

8 9







H K

V n

c Hiệu suất chiết – độ chiết – hệ số chiết

  QB: toàn bộ lượng QB của S chiết được vào pha hữu cơ

 QAO: lượng chất tan S trong dung dịch nước ban đầu

2- Các phương pháp chiết lỏng-lỏng

a Chiết đơn:

 hiệu suất chiết thấp

 Hiệu suất chiết:

'1

11

V

V K

 hiệu suất chiết cao hơn nhưng tốn nhiều thời gian, công sức

 hệ số phân bố không đủ lớn, phải chiết nhiều lần

 sau khi chiết một lần, trong dung dịch còn lại một lượng chất tan đáng kể thì thường cho vào một lượng dung môi chiết mới và chiết tiếp

 Chiết n lần, VB ml dung môi/lần: n

k

R

)'1(

11

V

V K

k'

 Chiết n lần, VB ml dung môi/n lần: n

A

B D

V

V n K

 Phòng thí nghiệm: chiết gián đoạn hay chiết liên tục

 Dịch chiết được đun sôi liên tục để chu hồi dung môi chiết B và cho dung môi thu hồi liên tục chảy vào dung dịch A cần chiết

 Tiết kiệm dung môi nhưng do dịch chiết bị đun nóng liên tục có thể làm biến đổi chất tan

S

c Chiết ngược dịng

 hiệu suất chiết rất cao, tách được nhiều chất



-i- Nguyên tắc

 dung mơi chiết và dung dịch chiết chạy ngược chiều và tiếp xúc với nhau chặt chẽ

 quá trình xảy ra liên tục

-ii- Mục tiêu

 tách hai hay nhiều chất tan bằng một loạt sự phân chia giữa hai pha lỏng – lỏng

-iii- Phân loại

mợt) Chiết gián đoạn qua nhiều bước

 Giả sử cĩ hai chất tan A và B trong hỗn hợp AB đang tồn tại ở pha dưới L (lower phase),

được chiết bằng pha trên U (upper phase)

Bước 2: Pha U0 được chuyển vào ống có L2 mới

Pha U1 được chuyển vào ống có L1 cũ

Pha U2 mới được đổ lên pha L0 cũ



 Sau khi cân bằng ở mỗi ống sự phân chia theo DA = 4, DB = 1

 Sau 5 bước gộp các ống 0, 1 và 2 vào lọ I và các ống 4 và 5 vào lọ II Ta có:



 Mức độ tinh khiết của A: [A]/([A] + [B]) và B: [B]/([A] + [B])

 Nhận xét: A càng ngày càng cách xa B khi số bước càng tăng

hai) Chiết liên tục qua nhiều bước

 Sơ đồ minh họa chiết ngược dòng liên tục từ sơ đồ chiết gián đoạn qua nhiều bước

 Với:

+ Pha trên U di động dọc theo pha dưới L bất động

+ Pha trên gọi là pha động MP (Mobile Phase)

+ Pha dưới gọi là pha tĩnh SP (Stationary Phase)

 Khi pha trên di động dọc theo pha dưới:

𝑀𝑃 𝑙𝑢ô𝑛 𝑙𝑢ô𝑛 𝑡𝑖ế𝑝 𝑥ú𝑐 𝑣ớ𝑖 𝑆𝑃 𝑚ớ𝑖.

𝑆𝑃 𝑙𝑢ô𝑛 𝑙𝑢ô𝑛 đượ𝑐 𝑡𝑖ế𝑝 𝑥ú𝑐 𝑣ớ𝑖 𝑀𝑃 𝑚ớ𝑖

→ 2 𝑑ò𝑛𝑔 𝑛à𝑦 𝑐𝑕𝑢𝑦ể𝑛 độ𝑛𝑔 𝑛𝑔ượ𝑐 𝑐𝑕𝑖ề𝑢 𝑛𝑕𝑎𝑢

→ 𝑐𝑕ấ𝑡 𝑡𝑎𝑛 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑀𝑃 đượ𝑐 𝑝𝑕â𝑛 𝑐𝑕𝑖𝑎 𝑚ộ𝑡 𝑐á𝑐𝑕 𝑙𝑖ê𝑛 𝑡ụ𝑐 𝑔𝑖ữ𝑎 𝑕𝑎𝑖 𝑝𝑕𝑎

 2 chất tan có hệ số phân chia khác nhau giữa 2 pha sẽ dẫn tới linh độ của chúng trong

hệ khác nhau  có chất dịch chuyển với vận tốc nhanh có D lớn và có chất dịch chuyển vối vận tốc chậm hơn  chúng ngày càng xa cách trong quá trình phân chia ngược dòng

 Giả sử A được chiết bằng phân chia ngược dòng theo sơ đồ trên Phân đoạn A ở pha trên

là p% và ở pha dưới là q% Ta có p + q = 1





 Phân đoạn A ở mỗi ống sau mỗi bước di chuyển của pha động

 Phân đoạn f (fraction) trong ống r sau bước chiết n: p r q n r

r r n

(

!

 Với n lớn, ống chứa lượng chất A cao nhất (rmax): rmax # np

 Ví dụ: tính lượng chất tan A trong ống 4 sau 5 bước chiết (n=5)

+ A có D=4, p=4/5, q=1/5: 𝑓𝐴 = 5−4 !4!5! (4/5)4(5)5−41 = 0.40960

+ B có 𝑓𝐵 = 5−4 !4!5! (1/2)4(12)5−4 = 0.15625

 Ví dụ:

+ A có p = 4/5, sau 100 bước chiết ta có rmax =100 x 4/5 =80: ống 80

+ B có p = ½, sau 100 bước chiết ta có rmax = 100 x 1/2 = 50: ống 50

 Độ rộng của dải và năng suất phân giải

 Tách A và B bằng phân chia ngược dòng qua 100 bước chiết

 Với A ứng với ống thứ 80 là cực đại còn các ống ở về 2 phía sẽ cho f giảm dần, hình thành

độ rộng của dải

 Với B cũng vậy, ống thứ 50 cực đại



 Nhận xét: độ rộng của dải cũng như năng suất phân giải phụ thuộc vào:

+ Hệ số phân chia của chất tan trong hệ

+ Số bước chiết chiết tách (số đĩa lý thuyết trong sắc ký)

3- Ứng dụng của chiết lỏng-lỏng

a Chiết bằng dung mơi hữu cơ

 Nhiều phân tử CHC và một số ít chất VC cĩ độ tan trong dung mơi hữu cơ lớn gấp nhiều lần độ tan trong nước

 Các yếu tố ảnh hưởng:

 Cấu trúc phân tử

 Thuốc thử tạo phức mang điện tích: Au, Fe trong HBr tạo phức tan trong ether etylic

+ Khi chiết phân tử I2 từ dung dịch nước (dung dịch I3-) bằng CCl4, nồng độ I- càng cao, hiệu suất chiết I2 càng giảm

+ Các kim loại như Au, Fe, … trong dung dịch HBr sẽ tạo thành acid phức kim loại như HAuBr4, HFeBr4, … cĩ thể chiết bằng ether ethylic

 pH: anion và cation tan trong nước  khơng chiết được bằng dung mơi hữu cơ nhưng

dạng phân tử trung hịa của chúng thì chiết được ảnh hưởng của pH rất mạnh khi chất tan là acid hay base

+ Xà phịng/pH thấp tạo acid tan trong DMHC

+ Muối alcaloid/pH cao chuyển alcaloid base tan trong DMHC

b Chiết với Chelator kim loại

 Ion kim loại/nước + chất phối trí (ligand) hữu cơ chọn lọc  phức  chiết vào DMHC

 Chất phối trí (ligand) hay dùng:

][

)(

][

nướcPha

cơHữu

 Ví dụ: Định lượng Pb2+ trong nước bằng phản ứng tạo phức với dithizone





+ Dithizone trong ống C tạo phức đỏ với Pb++ và được chiết vào lớp hexan

+ Dithizone trong ống B tạo phức đỏ với các ion kim loại trong nước máy và đi vào lớp hexan

c Chiết với cặp ion

 Base (hay acid) + acid (hay base)/pha nước  cặp ion tan trong DMHC

: tác nhân tạo cặp ion (ion pair agent, IPA)

 Cơ sở của phương pháp

 chiết đo quang,

 acid màu,

 acid màu-base hữu cơ

 Ứng dụng trong kiểm nghiệm

 Chiết và đo quang: chlorpheniramin, loperamid, promethazine

 Chuẩn độ tạo cặp ion: dung dịch chuẩn độ là chất diện hoạt anion dùng định lượng alcaloid, chỉ thị vàng methyl, môi trường chloroform

 Định lượng alkaloid, phenothiazin, … ở dạng cation dựa trên phản ứng tạo cặp ion với lauryl sulfat (LS) hay dioctylsulfosuccinate (DOSS) với chỉ thị vàng methyl/chloroform chuyển sang đỏ

-i- Các IPA thường dùng

 Xanh bromothymol, xanh bromophenol, xanh bromocresol,…

 Dẫn chất sulfonic của naphthalen

 Dẫn chất sulfonic của fluorescein

 tetrabutylammonium (C4H9)4N+

 thuốc ion 𝐼𝑃𝐴 ion pair  chiết tách

-ii- Các ứng dụng trong kiểm nghiệm

một) Chiết và đo quang

 Cho ion cần định lượng tạo với một cặp ion trái dấu có màu rồi chiết vào dung môi hữu cơ

và đem đo quang

 Một số ion (alkaloid, phenothiazin) có hấp thụ tử ngoại nên có thể chiết vào dung môi hữu

cơ dưới dạng cặp ion và đem đo mật độ quang

hai) Chuẩn tạo cặp ion

 Dùng phương pháp này định lượng các anion là chất diện hoạt (dùng làm chất nhủ hóa trong dược phẩm và mỹ phẩm)

 Định lượng base hữu cơ quan trọng trong ngành dược: Định lượng alkaloid,

phenothiazin, … ở dạng cation dựa trên phản ứng tạo cặp ion với lauryl sulfat (LS) hay

dioctylsulfosuccinate (DOSS) với chỉ thị vàng methyl/chloroform chuyển sang đỏ

 Ví dụ:

 Định lượng chlorpheniramin meleat trong viên Padol forte bằng phép chiết đo quang

+ chlorpheniramin tạo cặp ion với helianthine ở pH 4.4-4.6

+ chiết vào chloroform

+ Dịch chiết chloroform màu vàng và cặp ion trong chloroform có độ hấp thụ ở 410nm

+ Khoảng nồng độ tuân theo địnhl luật Lambert-Beer từ 2-10  g/ml

+ Việc đo nồng độ hấp thụ của cặp ion trong chloroform phép định lượng chlorpheniramin

+ Sự có mặt của paracetamol không trở ngại cho phép định lượng

 Định lượng promethazine trong siro Promethazine bằng natri laurylsulfat trong hệ

2 pha nước-chloroform,

+ chỉ thị Jaune methyl

+ Natri laurylsulfat là chất chuẩn độ

+ Promethazine là chất cần chuẩn độ

+ Thực hiện như phương pháp chuẩn độ thể tích thong thường

+ Cặp ion hình thành được chiết vào pha hữu cơ

+ Kết thúc phản ứng, natri laurylsulfat thừa làm dung dịch có màu hồng

B CHIẾT PHA RẮN – SOLID PHASE EXTRACTION, SPE

 Đây là quá trình tách chất phân tích từ mẫu bằng một chất rắn, sau dó rửa giải bằng dung môi thích hợp

 Tinh chế dịch chiết trong cân bằng chiết lỏng – lỏng

 SPE được cài đặt vào hệ thống GC, MS hoặc HPLC-MS tạo thành hệ phân tích hoàn chỉnh ghép nối kỹ thuật tinh chế và phân tích

Pha thuận

Amino -CH2-(CH2)2-NH2  Dung môi hòa tan mẫu có

thể là dung môi hữu cơ hay

dung dịch có tính thân nước

Diol -(CH2)3-OCH2-CHOH-CH2OH Cyanopropyl -CH2-(CH2)2-CN

Nhựa trao đổi ion

Trao đổi cation (SCX) -R-C6H4-SO3H  Lưu giữ chất phân tích

trên pha rắn là do lực hút

tĩnh điện.[acid amin, protein]

Trao đổi anion (SAX) Dẫn chất amoni bậc 4: R4N+X

-b Pha không liên kết

 Ngoài pha liên kết, trong SPE pha thuận còn dùng pha không liên kết