Cell based screening assay for inhibitors of porcine circovirus type2 (PCV2) replication 2

  4. DISCUSSION                          Discussion                          Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 58        4. DISCUSSION    PCV2  is  a  widespread  virus  that  causes  an  array  of  diseases  and  syndromes  in  pigs  (PCVAD)  (Grau‐Roma et al., 2010). Currently, the only antiviral strategy is prevention by vaccination and no drug  exists for controlling the disease by limiting viremia. Thus, there is an unmet need to develop antivirals  that could effectively inhibit PCV2 replication and this study was aimed at addressing this issue through  the  establishment  of  a  primary  screening  assay  in  an  effort  to  facilitate  drug  discovery  against  PCV2  replication. The assay was developed by monitoring the expression of Rep protein through IFA to assess  PCV2 replication. Screening assays in drug discovery are generally divided  into cell‐based and cell‐free  formats.  In  this  study,  a  whole‐cell  approach  was  chosen  for  development  primarily  because  of  availability  of  materials;  cell  lines  and  virus  stocks  were  readily  available  and  protocols  were  already  established. Before commencing, materials had to be standardized by obtaining a uniform batch of (1)  stable  cell  line  highly  permissive  to  infection  and  supports  high  titer  growth  of  the  virus,  (2)  large  amounts of antibodies that effectively recognize the target, and (3) large volume of infectious, high titer  virus.  Two  cell  lines  considered  for  the  screening  assay  were  PK15‐C1  and  3D4/31  because  of  their  widespread use in producing PCV2 in cultures. Porcine kidney (PK15) cells are the most widely used for  growing PCV2 according to literature survey. Moreover, a cell line derived from a subpopulation of PK15  cells  that  were  shown  highly  permissive  to  PCV2  infection  had  been  previously  generated  (Zhu  et  al.,  2007) and was mainly used in this study. The porcine‐derived transformed monocytic cell line 3D4/31,  is  another cell line chosen because it had been previously utilized in studies of PCV2 infection biochemistry  and dynamics (Misinzo et al., 2005; Misinzo et al., 2006), thus showing that the cells are permissive to  PCV2  infection.  Cell  line  optimized  for  use  in  the  screening  assay  should  be  permissive  to  infection,  support viral replication and exhibit high infection rates with the virus. 3D4/31 and PK15‐C1 cells were  grown  in  monolayer  and  incubated  with  stock  PCV2.  Infected  cells  at  early  time  points,  i.e.  24  and  48  HPI, did not show signs of CPE, consistent with the literature (Allan et al., 1998). Significant cell death  Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 59        4. DISCUSSION    th was observed from 72 HPI onwards; on the 4  day following infection 50% of cells had died, and on the  8th  day  90%  had  lifted  off.  To  determine  whether  PCV2  infection  caused  these  observations,  medium  obtained from both cell lines grown with the virus was subjected to either PCR or IFA. PCV2‐specific PCR  of DNA extracted from virus‐containing media resulted to the amplification of a 250 bp portion of the  virus ORF2 (Liu et al., 2005). Moreover, harvested media used to infect freshly seeded cells resulted to  positive staining for Rep protein by IFA. These observations confirmed presence of PCV2 in the collected  media from both cell lines but it was insufficient proof of virus replication within cells.  To confirm PCV2 replication, infected cell lysates were probed for Rep protein by western blot  and  detected  in  situ  by  IFA.  The  two  splice  variants  of  Rep  protein  –  Rep  (37  kDa)  and  Rep’  (20  kDa),  were  detected  by  Western  blot  in  PK15‐C1  but  not  in  3D4/31  lysates.  When  infected  cells  were  processed for IFA, however, both cell lines stained positive for Rep expression, although infection rates  were significantly less for 3D4/31 than PK15‐C1 cells. Furthermore, 3D4/31 cells exhibited less than 5%  infection rate at the highest MOI tested (15, corresponding to infection with 105 TCID50), while PK15‐C1  exhibited  at  least  10%  infection  rate  at  the  lowest  MOI  (0.17,  corresponding  to  infection  with  103  TCID50).  These  data  confirm  that  both  cells  supported  PCV2  replication,  although  PK15‐C1  was  more  permissive  to  PCV2  infection  compared  to  3D4/31.  High  infection  rate  was  observed  in  PK15‐C1  cells   infected at low MOI (0.17), while a low infection rate was observed in 3D4/31  infected at high MOI (15).  As a result, PK15‐C1 cells were chosen for optimizing the screening platform.   Before concluding that 3D4/31 cells are not permissive to PCV2 infection, however, caveat must  be considered.  One possible explanation for the observed disparity in infection rates between the two  cell  lines  is  differential  virus  adaptation.  PCV2  used  in  the  experiment  had  undergone  more  than  10  passaged and expanded in PK15‐C1, and was more adapted to it compared to 3D4/31 cells.   Meanwhile,  PCV2 had been passaged less than five times in the monocytic cells. Lower adaptation possibly resulted  Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 60        4. DISCUSSION    to less infection and consequently reduced levels of replication. This hypothesis is supported by previous  studies  (Yu  et  al.,  2007)  where  tissues  and  cells  collected  from  PCV2‐infected  pigs  were  stained  for  presence  of  PCV2  antigens.  The  group  concluded  that  monocytic  cells  were  a  main  site  of  viral  persistence  but  not  for  viral  replication.  Further  adaptation  of  the  virus  would  be  needed  to  increase  infection rates in 3D4/31 cells, but this is already beyond the scope of this study.  Growth curve for PK15‐C1 was established to determine the time point at which DNA replication  at S phase occurs. Whole genome content was extracted and the quantity was plotted against duration  of incubation. It was observed that PK15‐C1 cells have DNA doubling time of 15.5 hours, and subsequent  infections  with  PCV2  were  performed  less  than  15.5.  hours  post‐seeding.  Previous  studies  on  PCV2  infection dynamics revealed that PCV2 replication is dependent on enzymes expressed at S phase and  viral replication occurs normally after mitosis (Tischer et al., 1987). To expedite infection, cells have to  be infected prior to mitosis, preferably before S phase. Alternatively, infected cells could be treated to  glucosamine  to  circumvent  the  need  to  participate  in  cellular  mitosis  prior  to  onset  of  viral  genome  replication.   The second prerequisite before commencing the screening assay is large volumes of antibody.  The monoclonal antibody #4 was previously generated by conventional hybridoma technology and was  shown to recognize both splice variants of the Rep protein (Meng et al., 2010). Medium collected from  several rounds of hybridoma cell culture was pooled (1 liter) and frozen in small volumes. Aliquots were  tested  for  Rep  protein  recognition  by  western  blot  and  yielded  positive  results  with  strong  staining.  Antibodies were used only once for uniformity of results. FITC‐conjugated antibodies used in the study  were also purchased in large volumes (10 ml) of the same batch and lot to reduce variability between  experiments. Antibodies were tested  and found capable of recognizing its target.  Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 61        4. DISCUSSION    The third pre‐condition that must be satisfied was production of large volume of infectious PCV2  with high titer. Initial attempts to produce high  titer virus were unsuccessful and titer did not exceed  104  TCID50/ml.  It  was  observed  that  virus  production  in  roller  bottles  also  did  not    improve  titer.  Superinfection of persistently infected PK15‐C1 cells was found to  reduce viral titers, because treatment  with trypsin was lethal to infected cells. This was in contrast to previously observed titer enhancement  by superinfection, where a three‐fold increase in virus titer was obtained (Allan et al., 1998; O'Dea et al.,  2008). This disparity in results from superinfection studies could be attributed to the difference in cell  lines used in this study compared with those done by Allan et al. and O’Dea et al. These groups used the  parental  PK15  cells  comprised  of  a  heterogenous  mixture  of  slow‐  and  fast‐growing  cells  displaying  a  wide range of PCV2 infection permissivity, while this current study used the subclone PK15‐C1, which is  mainly comprised of slow‐growing cells highly permissive to PCV2 infection (Zhu et al., 2007). Virus titer  was  significantly  enhanced  (100‐fold)  only  when  pooled  virus  medium  was  concentrated  by  ultracentrifugation;  titer  reached  106  TCID50/  ml  and  infection  rate  in  PK15‐C1  using  the  concentrated  virus was greater than 50% when infected with 105 TCID50 (50 MOI).  Passage of concentrated virus in  PK15‐C1 cells  did  not significantly  alter the titer, and pooled virus media was  frozen  in  small  aliquots       (‐80o C) until further use.   Once  all  the  necessary  materials  had  been  obtained,  development  of  the  screening  assay  was  performed. Detection of PCV2 infection and replication through IFA of Rep protein is a well‐established  method  abundantly  found  in  the  literature  (Allan  et  al.,  1998;  Liu  et  al.,  2005;  Meng  et  al.,  2010).  Fluorescence  detection  system  was  adopted  over  colorimetric  detection  because  of  the  inherent  sensitivity  of  fluorescent  dyes.  The  IFA  had  been  shown  to  work  in  96‐well  plate  format  without  difficulty, and scaling down to the 384‐well plate format was expected to be straightforward. Optimizing  required tweaking three parameters: 1) cell seeding density, 2) MOI, and 3) duration of infection prior to  fixation.   Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 62        4. DISCUSSION    For uniformity of results, it was necessary to have an even  monolayer of cells per well and any  unnecessary  perturbation  that  might  lead  to  disruption  of  the  cell  sheet  must  be  avoided.  It  was  previously  observed  that  induction  with  glucosamine  leads  to  enhancement  of  infection  but  with  concomitant  cytotoxicity  (Tischer  et  al.,  1987;  Allan  and  Ellis,  2000).  It  was  therefore  prudent  to  test  whether the benefits outweighed the risks of glucosamine treatment in 384‐well plates. Comparison of  cells  treated  and  untreated  with  glucosamine  yielded  strong  evidence  for  cytotoxicity.  The  central  portion  of  treated  wells  was  devoid  of  cells  in  contrast  to  the  more  confluent  cell  sheets  observed  in  untreated wells. Significant glucosamine‐induced cytotoxicity was observed at various MOI (1, 2, 3, and  4) and different incubation periods (48 and 60  hours).  Similar results were obtained  at other seeding  densities.  Although  the  cytotoxicity  of  glucosamine  could  be  empirically  reduced  by  shortening  the  durationof cell contact and thorough washing with PBS prior to replacement with fresh media, doing this  was not an easy task. Due to the small area of the wells in 384‐well plates, however, glucosamine could  not  be  completely    removed  without  disrupting  the  cell  sheet.  Washing  with  buffer  also  resulted  to  mechanical disruption causing cells to lift off the wells. Most importantly, enhancement of infection was  not  observed  in  glucosamine‐induced  cells.  Infection  rates  in  cells  treated  with  glucosamine  were  not  significantly  higher  in  comparison  to  those  observed  in  untreated  cells.  Thus,  the  benefits  of  glucosamine induction did not   outweigh its inherent cytotoxicity  and was considered inessential to the  assay being developed. Further optimizations  precluded the use of glucosamine.  Aside  from  an  even  monolayer  of  cells,  another  important  prerequisite  for  the  assay  was  infection rate of at least 50%. It is necessary to achieve this minimum infection rate in untreated cells so  that  %  inhibition  of  replication  that  results  from  the  screening  would  yield  unequivocal  results.  Achieving this requirement depended on the interplay of three factors: (1) seeding density, (2) MOI at  the time of infection, and (3) duration of infection prior to fixation. Seeding at insufficient density would  result to low cell confluence at the time of assay; doing so at excessive density would result to very high  Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 63        4. DISCUSSION    density of cells growing on top of each other. Infection at excessively high MOI would result to greater  cell  death  and  consequently  larger  regions  devoid  of  cells  on  the  well;  conversely,  infection  with  insufficient  MOI  would  result  to  infection  rates  less  than  50%.  Balance  also  had  to  be  achieved  with  duration  of  infection.  Although  higher  infection  rates  could  be  achieved  if  cells  were  infected  for  a  longer  duration,   incubation for too long would result to most of the infected cells lifting off and  dying  as  a  consequence  of  virus‐induced  apoptosis  (Liu  et  al.,  2005).  On  the  other  hand,  prolonging  the  duration of  incubation of  cells  infected at low  MOI  would result to overgrowth and   and  formation of  multiple layers.   Initial tests  performed at low MOI (50%  infection  rates  in  cultures  also  needs  to  be  obtained.  Without  these,  assay  development  in  primary  screening  for  PCV2  replication  inhibitors  would not yield satisfactory results.                                                                   This is currently being done at the time of this manuscript revision. However due to time constraints, the results  of this experiment could not be included in this document  Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 72        5. BIBLIOGRAPHY                          Bibliography                              Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 73     5. BIBLIOGRAPHY    5.1 Journal Articles    Allan, G., McNeilly, F., Kennedy, S., Daft, B., Clarke, E., Ellis, J., Haines, D., Meehan, B., and Adair,  B. (1998). Isolation of porcine circovirus‐like viruses from pigs with a wasting disease in  the USA and Europe Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 10, 3‐10.    Allan,  G.,  and  Ellis,  J.  (2000).  Porcine  circoviruses:  a  review.  Journal  of  Veterinary  Diagnostic  Investigation 12, 3‐14.    Badgett,  M.,  Auer,  A.,  Carmichael,  L.,  Parrish,  C.,  and  Bull,  J.  (2002).  Evolutionary  dynamics  of  viral attenuation. Journal of Virology 76, 10524‐10529.    Blanchard, P., Mahé, D., Cariolet, R., Keranflec'h, A., Baudouard, M.A., Cordioli, P., Albina, E., and  Jestin,  A.  (2003).  Protection  of  swine  against  post‐weaning  multisystemic  wasting  syndrome (PMWS) by porcine circovirus type 2 (PCV2) proteins. Vaccine 21, 4565‐4575.    Chae, C. (2004). Postweaning multisystemic wasting syndrome: a review of aetiology, diagnosis  and pathology. The Veterinary Journal 168, 41‐49.    Chae,  C.  (2005).  A  review  of  porcine  circovirus  2‐associated  syndromes  and  diseases.  The  Veterinary Journal 169, 326‐336.    Chaiyakul,  M.,  Hsu,  K.,  Dardari,  R.,  Marshall,  F.,  and  Czub,  M.  (2010).  Cytotoxicity  of  ORF3  Proteins from a Nonpathogenic and a Pathogenic Porcine Circovirus Journal of Virology  84, 11440–11447.    Clark,  H.  (1978).  Rabies  viruses  increase  in  virulence  when  propagated  in  neuroblastoma  cell  culture. Science 199, 1072‐1075.    Cline,  J.,  Nelson,  J.,  Gerzon,  K.,  Williams,  R.,  and  Delong,  D.  (1969).  In  vitro  antiviral  activity  of  mycophenolic acid and its reversal by guanine type compounds  Applied Environmental  Microbiology 18, 14‐20.    Ebert, D. (1998). Experimental Evolution of Parasites. Science 282, 1432‐1436.    Ellis, J., Clark, E., Haines, D., West, K., Krakowka, S., Kennedy, S., and Allan, G.M. (2004). Porcine  circovirus‐2 and concurrent infections in the field. Veterinary Microbiology 98, 159‐163.    Ellis, J., Hassard, L., Clark, E., Harding, J., Allan, G., Willson, P., Strokappe, J., Martin, K., McNeilly,  F., Meehan, B., et al. (1998). Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning  multisystemic wasting syndrome. Can Vet J 39.    Faurez,  F.,  Dory,  D.,  Grasland,  B.,  and  Jestin,  A.  (2009).  Replication  of  porcine  circoviruses.  Virology Journal 6, 60‐67.    Fenaux, M., Halbur, P., Gil, M., Toth, T., and Meng, X. (2000). Genetic characterization of type 2  porcine  circovirus  (PCV‐2)  from  pigs  with  postweaning  multisystemic  syndrome  in  different  geographic  regions  of  North  America  and  development  of  a  differential  PCR‐ restriction  fragment  length  polymorphism  assay  to  detect  and  differentiate  between  infections with PCV‐1 and PCV‐2. Journal of Clinical Microbiology 38, 2494‐2503.    Fenaux,  M.,  Opriessnig,  T.,  Halbur,  P.,  Elvinger,  F.,  and  Meng,  X.  (2004).  Two  Amino  Acid  Mutations  in  the  Capsid  Protein  of  Type  2  Porcine Circovirus  (PCV2)  Enhanced  PCV2  Replication  In  Vitro  and Attenuated  the  Virus  In  Vivo Journal  of  Virology  78,  13440– 13446.    Feng, B., Simeonov, A., Jadhav, A., Babaoglu, K., Inglese, J., Shoichet, B., and Austin, C. (2007). A  High‐Throughput Screen for Aggregation‐Based Inhibition in a Large Compound Library.  Journal of Medicinal Chemistry 50, 2385‐2390.    Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 74     5. BIBLIOGRAPHY    Feng,  B.,  Toyama,  B.,  Wille,  H.,  Colby,  D.,  Colling,  S.,  May,  B.,  Prusiner,  S.,  Weissman,  J.,  and  Shoicet,  B.  (2008).  Small‐molecule  aggregates  inhibit  amyloid  polymerization.  Nature  Chemical Biology 4, 197‐199.    Ferrari,  M.,  Scalvini,  A.,  Losio,  M.N.,  Corradi,  A.,  Soncini,  M.,  Bignotti,  E.,  Milanesi,  E.,  Ajmone‐ Marsan,  P.,  Barlati,  S.,  Bellotti,  D.,  et  al.  (2003).  Establishment  and  characterization  of  two new pig cell lines for use in virological diagnostic laboratories. Journal of Virological  Methods 107, 205‐212.    Finsterbusch,  T.,  and  Mankertz,  A.  (2009).  Porcine  circoviruses  ‐  small  but  powerful.  Virus  Research 143, 177‐183.    Fox, S., Farr‐Jones, S., Sopchak, L., Boggs, A., Nicely, H., Khoury, R., and Biros, M. (2006). High‐ throughput  screening:  updates  on  practices  and  success.  Journal  of  Biomolecular  Screening 11, 864‐869.    Gonzales, J., Oades, K., Leychkis, Y., Harootunian, A., and Negulescu, P. (1999). Cell‐based assays  and instrumentation for screening ion‐channeltargets. Drug Discovery Today 4, 431‐439.    Grau‐Roma, L., Fraile, L., and Segalés, J. (2010). Recent advances in the epidemiology, diagnosis  and  control  of  diseases  caused  by  porcine  circovirus  type  2.  The  Veterinary  Journal  In  Press, Corrected Proof.    Ha, Y., Ahn, K.K., Kim, B., Cho, K.D., Lee, B.H., Oh, Y.S., Kim, S.H., and Chae, C. (2009). Evidence of  shedding  of  porcine  circovirus  type  2  in  milk  from  experimentally  infected  sows.  Research in Veterinary Science 86, 108‐110.    Harding, J.C.S. (2004). The clinical expression and emergence of porcine circovirus 2. Veterinary  Microbiology 98, 131‐135.    Hertzberg, R.P., and Pope, A.J. (2000). High‐throughput screening: new technology for the 21st  century. Current Opinion in Chemical Biology 4, 445‐451.    Inglese, J., Johnson, R., Simeonov, A., Xia, M., Zheng, W., Austin, C., and Auld, D. (2007). High‐ throughput screening assays for the identification of chemical probes. Nature Chemical  Biology 3, 466‐479.    Jacobsen, B., Krueger, L., Seeliger, F., Bruegmann, M., Segalés, J., and Baumgaertner, W. (2009).  Retrospective study  on  the occurrence  of porcine  circovirus  2  infection  and  associated  entities in Northern Germany. Veterinary Microbiology 138, 27‐33.    John, S., Fletcher, T., and Jonsson, C. (2005). Development and application of a high‐throughput  screening assay for HIV‐1 integrase enzyme activities. Journal of Biomolecular Screening  10, 606‐614.    Kamstrup,  S.,  Barfoed,  A.M.,  Frimann,  T.H.,  Ladekjær‐Mikkelsen,  A.‐S.,  and  Bøtner,  A.  (2004).  Immunisation  against  PCV2  structural  protein  by  DNA  vaccination  of  mice.  Vaccine  22,  1358‐1361.    Karuppannan, A.K., and Kwang, J. (2010). ORF3 of porcine circovirus 2 enhances the in vitro and  in vivo spread of the of the virus. Virology In Press, Corrected Proof.    Karuppannan,  A.K.,  Liu,  S.,  Jia,  Q.,  Selvaraj,  M.,  and  Kwang,  J.  (2010).  Porcine  circovirus  type  2  ORF3 protein competes with p53  in binding to Pirh2 and mediates the deregulation of  p53 homeostasis. Virology 398, 1‐11.    Kaul,  A.,  Wörz,  I.,  and  Bartenschlager,  R.  (2009).  Adaptation  of  the  hepatitis  C  virus  to  cell  culture. Methods in Molecular Biology 510, 361‐372.    Kennedy, S., Moffett, D., McNeilly, F., Meehan, B., Ellis, J., Krakowka, S., and Allan, G.M. (2000).  Reproduction  of  Lesions  of  Postweaning  Multisystemic  Wasting  Syndrome  by  Infection  of  Conventional  Pigs  with  Porcine  Circovirus  Type  2  Alone  or  in  Combination  with  Porcine Parvovirus. Journal of Comparative Pathology 122, 9‐24.  Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 75     5. BIBLIOGRAPHY    Kixmöller,  M.,  Ritzmann,  M.,  Eddicks,  M.,  Saalmüller,  A.,  Elbers,  K.,  and  Fachinger,  V.  (2008).  Reduction  of  PMWS‐associated  clinical  signs  and  co‐infections  by  vaccination  against  PCV2. Vaccine 26, 3443‐3451.    Larochelle,  R.,  Bielanski,  A.,  Müller,  P.,  and  Magar,  R.  (2000).  PCR  Detection  and  Evidence  of  Shedding of Porcine Circovirus Type 2 in Boar Semen. Journal of Clinical Microbiology 38,  4629‐4632.    Larochelle,  R.,  Magar,  R.,  and  D’Allaire,  S.  (2002).  Genetic  characterization  and  phylogenetic  analysis of porcine circovirus type 2 (PCV2) strains from cases presenting various clinical  conditions. Virus Research 90, 101‐112.    Lavery,  P.,  Brown,  M.,  and  Pope,  A.  (2001).  Simple  absorbance‐based  assays  for  ultra‐high  throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening 6, 3‐9.    Lindenbach,  B.D.  (2009).  Measuring  HCV  Infectivity  Produced  in  Cell  Culture  and  In  Vivo.  Methods in Molecular Biology 510, 329‐336.    Liu, J., Chen, I., and Kwang, J. (2005). Characterization of a Previously Unidentified Viral Protein  in  Porcine Circovirus  Type  2‐Infected  Cells  and  Its  Role  in Virus‐Induced  Apoptosis.  Journal of Virology 79, 8262–8274.    Liu, J.,  Chen, I., Du,  Q., Chua,  H.,  and Kwang, J.  (2006).  The  ORF3  Protein  of Porcine  Circovirus  Type 2 Is Involved in Viral Pathogenesis In Vivo Journal of Virology 80, 5065–5073.    Liu, J., Zhu, Y., Chen, I., Lau, J., He, F., Lau, A., Wang, Z., Karuppannan, A., and Kwang, J. (2007).  The ORF3 Protein of Porcine Circovirus Type 2 Interacts withPorcine Ubiquitin E3 Ligase  Pirh2 and Facilitates p53Expression in Viral Infection. Journal of Virology 81, 9560–9567.    Mankertz, A., Mankertz, J., Wolf, K., and Buhk, H. (1998). Identification of a protein essential for  replication of porcine circovirus. Journal of General Virology 79, 381‐384.    Mankertz, A., Mueller, B., Steinfeldt, T., Schmitt, C., and Finsterbusch, T. (2003). New Reporter  Gene‐Based Replication Assay Reveals Exchangeability of Replication Factors of Porcine  Circovirus Types 1 and 2 Journal of Virology 77, 9885–9893.    Mankertz,  A.,  Çaliskan,  R.,  Hattermann,  K.,  Hillenbrand,  B.,  Kurzendoerfer,  P.,  Mueller,  B.,  Schmitt,  C.,  Steinfeldt,  T.,  and  Finsterbusch,  T.  (2004).  Molecular  biology  of  Porcine  circovirus: analyses of gene expression and viral replication. Veterinary Microbiology 98,  81‐88.    Martin,  H.,  Le  Potier,  M.‐F.,  and  Maris,  P.  (2008).  Virucidal  efficacy  of  nine  commercial  disinfectants against porcine circovirus type 2. The Veterinary Journal 177, 388‐393.    Meehan,  B.,  McNeilly,  F.,  Todd,  D.,  Kennedy,  S.,  Jewhurst,  V.,  Ellis,  J.,  Hassard,  L.,  Clark,  E.,  Haines,  D.,  and  Allan,  G.  (1998).  Characterization  of  novel  circovirus  DNAs  associated  with wasting syndromes in pigs. Journal of General Virology 79, 2171‐2179.    Meng, T., Jia, Q., Liu, S., Karuppannan, A.K., Chang, C.‐C., and Kwang, J. (2010). Characterization  and  epitope  mapping  of  monoclonal  antibodies  recognizing  N‐terminus  of  Rep  of  porcine circovirus type 2. Journal of Virological Methods 165, 222‐229.    Misinzo, G., Meerts, P., Bublot, M., Mast, J., Weingartl, H., and Nauwynck, H. (2005). Binding and  entry characteristics of porcine circovirus 2 in cells of the porcine monocytic line 3D4/31.  Journal of General Virology 86, 2057‐2068.    Misinzo, G., Delputte, P., Meerts, P., Lefebvre, D., and Nauwynck, H. (2006). Porcine Circovirus 2  Uses Heparan Sulfate and Chondroitin Sulfate B Glycosaminoglycans as Receptors for Its  Attachment to Host Cells. Journal of Virology 80, 3487‐3494.    Misinzo,  G.,  Delputte,  P.,  and  Nauwynck,  H.  (2008).  Inhibition  of  Endosome‐Lysosome  System  Acidification  Enhances Porcine Circovirus  2 Infection  of Porcine  Epithelial  Cells. Journal  of Virology 82, 1128‐1135.  Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 76     5. BIBLIOGRAPHY      Muhling,  J.,  Raye,  W.,  Buddle,  J.,  and  Wilcox,  G.  (2006).  Genetic  characterisation  of  Australian  strains of porcine circovirus types 1 and 2. Australian Veterinary Journal 84, 421‐425.  Nawagitgul,  P.,  Morozov,  I.,  Bolin,  S.,  Harms,  P.,  Sorden,  S.,  and  Paul,  P.  (2000).  Open  reading  frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein. Journal of General  Virology 81, 2281‐2287.    Niagro, F.D., Forsthoefel, A.N., Lawther, R.P., Kamalanathan, L., Ritchie, B.W., Latimer, K.S., and  Lukert,  P.D.  (1998).  Beak  and  feather  disease  virus  and  porcine  circovirus  genomes:  intermediates  between  the  geminiviruses  and  plant  circoviruses.  Archives  of  Virology  143, 1723‐1744.    O'Dea, M.A., Hughes, A.P., Davies, L.J., Muhling, J., Buddle, R., and Wilcox, G.E. (2008). Thermal  stability of porcine circovirus type 2 in cell culture. Journal of Virological Methods 147,  61‐66.    Panattoni, A., D’Anna, F., and Triolo, E. (2007). Antiviral activity of tiazofurin and mycophenolic  acid  against  grapevine  leafroll‐associated  virus  3  in Vitis  vinifera explants.  Antiviral  Research 73, 206‐211.    Pringle, C.R. (1998). The universal system of virus taxonomy of the International Committee on  Virus  Taxonomy  (ICTV),  including  new  proposals  ratified  since  publication  of  the  Sixth  ICTV Report in 1995. Archives of Virology 143, 203‐210.    Raye, W., Muhling, J., Warfe, L., Buddle, J., Palmer, C., and Wilcox, G. (2005). The detection of  porcine circovirus in the Australian pig herd. Australian Veterinary Journal 83, 300‐304.    Sanchez,  R.E.,  Nauwynck,  H.J.,  McNeilly,  F.,  Allan,  G.M.,  and  Pensaert,  M.B.  (2001).  Porcine  circovirus  2  infection  in  swine  foetuses  inoculated  at  different  stages  of  gestation.  Veterinary Microbiology 83, 169‐176.    Segalés,  J.,  Urniza,  A.,  Alegre,  A.,  Bru,  T.,  Crisci,  E.,  Nofrarías,  M.,  López‐Soria,  S.,  Balasch,  M.,  Sibila, M., Xu, Z., et al. (2009). A genetically engineered chimeric vaccine against porcine  circovirus  type  2  (PCV2)  improves  clinical,  pathological  and  virological  outcomes  in  postweaning multisystemic wasting syndrome affected farms. Vaccine 27, 7313‐7321.    Shen,  H.G.,  Beach,  N.M.,  Huang,  Y.W.,  Halbur,  P.G.,  Meng,  X.J.,  and  Opriessnig,  T.  (2010).  Comparison  of  commercial  and experimental  porcine circovirus  type 2  (PCV2) vaccines  using a triple challenge with PCV2, porcine reproductive and respiratory syndrome virus  (PRRSV), and porcine parvovirus (PPV). Vaccine 28, 5960‐5966.    Shibata,  I.,  Okuda,  Y.,  Yazawa,  S.,  Ono,  M.,  Sasaki,  T.,  Itagaki,  M.,  Nakajima,  N.,  Okabe,  Y.,  and  Hidejima,  I.  (2003).  PCR  Detection  of  Porcine  circovirus  type  2  DNA  in  Whole  Blood,  Serum, Oropharyngeal  Swab,  Nasal Swab,  and  Feces  from  Experimentally  Infected Pigs  and Field Cases. The Journal of Veterinary Medical Science 65, 405‐408.    Song,  Y.,  Jin,  M.,  Zhang,  S.,  Xu,  X.,  Xiao,  S.,  Cao,  S.,  and  Chen,  H.  (2007).  Generation  and  immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing cap protein of porcine  circovirus type 2. Veterinary Microbiology 119, 97‐104.    Stevenson, G., Kiupel, M., Mittal, S., and Kanitz, C. (1999). Ultrastructure of porcine circovirus in  persistently‐infected PK15 cells. Veterinary Pathology 36, 368‐378.    Sui, Y., and Wu, Z. (2007). Alternative Statistical Parameter for High‐Throughput Screening Assay  Quality Assessment. Journal of Biomolecular Screening 12, 229‐234.    Sundberg, S.A. (2000). High‐throughput and ultra‐high‐throughput screening: solution‐ and cell‐ based approaches. Current Opinion in Biotechnology 11, 47‐53.    Tischer, I., Gelderblom, H., Vettermann, W., and Koch, M. (1982). A very small porcine virus with  circular single‐stranded DNA. Nature 295, 64‐66.    Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 77     5. BIBLIOGRAPHY    Tischer, I., Peters, D., Rasch, R., and Pociuli, S. (1987). Replication of porcine circovirus: induction  by glucosamine and cell cycle dependence. Archives of Virology 96, 39‐57.    Tomás, A.,  Fernandes, L.T.,  Valero,  O.,  and Segalés,  J.  (2008).  A  meta‐analysis on  experimental  infections with porcine circovirus type 2 (PCV2). Veterinary Microbiology 132, 260‐273.    Wang, X., Jiang, P., Li, Y., Jiang, W., and Dong, X. (2007). Protection of pigs against post‐weaning  multisystemic  wasting  syndrome  by  a  recombinant  adenovirus  expressing  the  capsid  protein of porcine circovirus type 2. Veterinary Microbiology 121, 215‐224.    Wei, L., Kwang, J., Wang, J.,  Shi, L., Yang, B., Li, Y.,  and Liu, J. (2008). Porcine circovirus type  2  induces the activation of nuclear factor kappa B by IĸBα degradation. Virology 378, 177‐ 184.    Wei,  L.,  and  Liu,  J.  (2009). Porcine circovirus type  2 replication  is  impaired  by  inhibition of  the  extracellular signal‐regulated kinase (ERK) signaling pathway. Virology 386, 203‐209.    Yu,  S.,  Opriessnig,  T.,  Kitikoon,  P.,  Nilubol,  D.,  Halbur,  P.G.,  and  Thacker,  E.  (2007).  Porcine  circovirus type 2 (PCV2) distribution and replication in tissues and immune cells in early  infected pigs. Veterinary Immunology and Immunopathology 115, 261‐272.    Zhang,  J.,  Chung,  T.,  and  Oldenburg,  K.  (1999).  A  Simple  Statistical  Parameter  for  Use  in  Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular  Screening 4, 67‐73.  Zhu, Y., Lau, A., Lau, J., Jia, Q., Karuppannan, A.K., and Kwang, J. (2007). Enhanced replication of  porcine  circovirus  type  2  (PCV2)  in  a  homogeneous  subpopulation  of  PK15  cell  line.  Virology 369, 423‐430.    Zuck, P., O’Donnell, G., Cassaday, J., Chase, P., Hodder, P., Strulovici, B., and Ferrer, M. (2005).  Miniaturization of absorbance assays using fluorescent properties of white microplates.  Analytical Chemistry 342, 254‐259.    5.2 Books  Johnston,  P.  (2002).  Cellular  Assays  in  HTS.  In  High  Throughput  Screening  Methods  and  Protocols, W. Janzen, ed. (New Jersey, Humana Press), pp. 87‐106.    Schweitzer,  R.,  and  Abriola,  L.  (2002).  Electrochemiluminescence: A  Technology  Evaluation  and  Assay  Reformattingof  the  Stat6/P578  Protein–Peptide  Interaction.  In  High  Throughput  Screening Methods and Protocols, W. Janzen, ed. (New Jersey, Humana Press), pp. 87‐ 106.      5.3 Online References  BoehringerIngelheimVetmedica (2010). IngelVac CircoFlex.  http://circoflexpower.com/circoflex/features/safety    FortDodgeAnimalHealth (2009). Suvaxyn.  http://www.fortdodge.eu/product.asp?name=suvaxyn_pcv.    LifeTechnologies (2010). Alexa Fluor Dyes Spanning the Visible and Infrared Spectrum.  http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular‐Probes‐The‐ Handbook/Fluorophores‐and‐Their‐Amine‐Reactive‐Derivatives/Alexa‐Fluor‐Dyes‐ Spanning‐the‐Visible‐and‐Infrared‐Spectrum.html    Novartis (2010). Drug Discovery and Development Process.  http://www.novartis.com/research/drug‐discovery.shtml    Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 78     5. BIBLIOGRAPHY    Schering‐Plough (2009). Circumvent PCV.  http://www.intervetusa.com/products/products/productdetails_130_165082.aspx  Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 79     6. APPENDICES                           Appendices                              Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 80     6. APPENDICES     6.1  Effect  of  glucosamine  treatment  on  infection  rates  at  various  seeding  densities              (A)  (B)  (C) (D)  (E)  (F)  (G) (H)  (I)  (J)  (K) (L)  (M)  (N)  (O) (P)                                      Figure 6.1 | Effect of Glucosamine Treatment on Infection Rates in Cells Seeded at 2000 per   well. Cells were infected with PCV2 BJW at MOI 1 (A, B, I, J), 2 (C, D, K, L), 3 (E, F, M, N), and 4   (G, H, O, P) and fixed at 48 HPI (A‐H) and 60 HPI (I‐P). Infected cells were either untreated (A, C,  E, G, I, K, M, O) or treated (B, D, F, H, J, L, N, P) with glucosamine. Images are representative of   3 independent trials. Green (FITC) – PCV2 Rep protein; Blue (DAPI) – cell nuclei                Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 81     6. APPENDICES                 (A)  (B)  (C) (D)  (E)  (F)  (G) (H)  (I)  (J)  (K) (L)  (M)  (N)                                (O) (P)     Figure 6.2 | Effect of Glucosamine Treatment on Infection Rates in Cells Seeded at 3000 per   well. Cells were infected with PCV2 BJW at MOI 1 (A, B, I, J), 2 (C, D, K, L), 3 (E, F, M, N), and 4  (G, H, O, P) and fixed at 48 HPI (A‐H) and 60 HPI (I‐P). Infected cells were either untreated (A, C,  E, G, I, K, M, O) or treated (B, D, F, H, J, L, N, P) with glucosamine. Images are representative of   3 independent trials. Green (FITC) – PCV2 Rep protein; Blue (DAPI) – cell nuclei                    Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 82     6. APPENDICES                 (A)  (B)  (C) (D)  (E)  (F)  (G) (H)  (I)  (J)  (K) (L)  (M)  (N)                                 (O) (P)      Figure 6.3 | Effect of Glucosamine Treatment on Infection Rates in Cells Seeded at 3500 per  well. Cells were infected with PCV2 BJW at MOI 1 (A, B, I, J), 2 (C, D, K, L), 3 (E, F, M, N), and 4    (G, H, O, P) and fixed at 48 HPI (A‐H) and 60 HPI (I‐P). Infected cells were either untreated (A, C,    E, G, I, K, M, O) or treated (B, D, F, H, J, L, N, P) with glucosamine. Images are representative of    3 independent trials. Green (FITC) – PCV2 Rep protein; Blue (DAPI) – cell nuclei                Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 83     6. APPENDICES     6.2 Standard curves for FI and Absorbance with Alamar Blue      (A)           (A)  (B) (E)  (F) (D)            (G) (H)        (B)     (L)            (M)  (N) (O) (P)            Figure  6.4  |  Standard  Curve  for  Alamar  Blue  FI  Against  Various  Seeding  Densities.  Log‐ transformed  fluorescence  intensities  were  determined  at  different  time  points  with  cells   seeded at various densities and incubated with 3% (A) and 5% (B) alamar blue reagent.            Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 84     6. APPENDICES             (A)                         (B)                           (C)                     Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 85     6. APPENDICES       Figure 6.5 | Standard Curve for Alamar Blue Absorbance at 570 nm Against Various Seeding   Densities.  Exp‐transformed absorbance  values were determined  at different time points with   cells  seeded  at  various  densities  and  incubated  with  3%  (A),  5%  (B)  and  10%  (C)  alamar  blue   reagent.                Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication       Page | 86   ... required tweaking three parameters: 1)? ?cell? ?seeding density,? ?2)  MOI, and 3) duration? ?of? ?infection prior to  fixation.   Cell? ? ?Based? ?Screening? ?Assay? ?for? ?Inhibitors? ?of? ?Porcine? ?Circovirus? ?Type? ?2? ?(PCV2)? ?Replication? ?      Page |  62? ?       4. DISCUSSION    For? ?uniformity? ?of? ?results, it was necessary to have an even  monolayer? ?of? ?cells per well and any ... rates. U0 126  is a MEK 1  /2? ?inhibitor found to inhibit PCV2? ?replication? ?at EC50? ?of? ?less than 10 µM (Wei and  Cell? ? ?Based? ?Screening? ?Assay? ?for? ?Inhibitors? ?of? ?Porcine? ?Circovirus? ?Type? ?2? ?(PCV2)? ?Replication? ?   ... infection rates, but instead resulted to greater? ?cell? ?death. The number? ?of? ?cells attached to the bottom? ?of? ? the plate? ?24  hours post‐seeding was significantly less than the number? ?of? ?attached cells in plates seeded  Cell? ? ?Based? ?Screening? ?Assay? ?for? ?Inhibitors? ?of? ?Porcine? ?Circovirus? ?Type? ?2? ?(PCV2)? ?Replication? ?