Cell based screening assay for inhibitors of porcine circovirus type2 (PCV2) replication

CELL-BASED SCREENING ASSAY FOR INHIBITORS OF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE (PCV2) REPLICATION CARLA BIANCA LUENA VICTORIO    YONG LOO LIN SCHOOL OF MEDICINE  NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE  &  SWISS TROPICAL AND PUBLIC HEALTH INSTITUTE  UNIVERSITY OF BASEL  2010  CELL-BASED SCREENING ASSAY FOR INHIBITORS OF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE (PCV2) REPLICATION CARLA BIANCA LUENA VICTORIO  (BSc. Molecular Biology and Biotechnology)  University of the Philippines Diliman          A THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE OF    JOINT MASTER OF SCIENCE IN INFECTIOUS DISEASES,  VACCINOLOGY AND DRUG DISCOVERY            YONG LOO LIN SCHOOL OF MEDICINE  NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE  &  SWISS TROPICAL AND PUBLIC HEALTH INSTITUTE  UNIVERSITY OF BASEL  2010      Acknowledgements    This  research  project  wouldn’t  have  been  possible  without  the  support  and  funding  from  Temasek  Life  Science  Laboratories  (TLL)  and  the  expertise  of  the  researchers  at  the  Animal  Health  Biotechnology Group headed by Prof. Jimmy Kwang. My special thanks to my supervisor, Prof. Kwang, co‐ supervisor, Prof. Justin Chu, and mentor Mr. Anbu Karuppannan for giving me guidance and direction in  this research endeavor.   This Joint Msc program had been a wonderful, albeit stressful, experience and I am grateful for  this  opportunity  bestowed  to  me  by  Novartis  Institute  of  Tropical  Diseases  (NITD),  Swiss  Tropical  and  Public  Health  Institute  (STPH),  and  National  University  of  Singapore  (NUS).  My  special  thanks  to  Ms.  Christine Mensch for all the much‐needed assistance during my stay in Basel, and to Ms. Susie Soh for the  constant  gentle  reminders  in  Singapore.  I  would  like  to  acknowledge  the  program  lecturers,  most  especially  Prof.  Reto  Brun,  for  providing  the  inspiration  to  delve into  the field  of  drug discovery.  To the  JIBES, thank you for making life outside the lab and lecture memorable. To Patricia, who has been my life  raft these past 2 years; to Casey, Mad, Ed, Sukriti, Hanwern, Neisha, and Ashley, thank you for all the fond  memories.  I wish to express my heartfelt thanks to the people of TLL who showed me how to make stress a  bearable  part  of  daily  life.  To  Shaz,  Peypey,  Lu  ting,  Keiko,  Adi,  Ivan,  and  Ranjay,  thanks  for  all  your  support;  and  to  Vin, who  has  been  my source of  respite  during  the  crucial moments,  thank  you for the  companionship and strength.  To  my  friends  back  home  in  the  Philippines  and  in  Basel,  who  still  give  me  constant  emotional  support, thank you for all your wonderful efforts.   Lastly,  I  would  like  to  express  my  whole‐hearted  gratitude  to  my  family  for  being  my  constant  refuge. Thank you for the selfless love, caring support, and understanding and for allowing me to pursue  my dreams independently.      Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication        Page | 1         Table of contents  Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  5  List of Tables and Figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  6  List of Abbreviations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  8    1.   Introduction  1.1.   Porcine Circoviruses (PCV) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12    1.1.1.   PCV Taxonomy, Morphology and Genetics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12    1.1.2.   Pathogenesis and Replication Cycle of PCV2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  14  1.2.   PCV2‐Associated Diseases (PCVAD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16    1.2.1.   Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17     1.2.2.   PDNS and other PCVAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  18    1.2.3.   Treatment of PCVAD  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  19  1.3.   Assay Development and Screening . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  20    1.3.1.   Cell‐based and Cell‐free Assays   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  21    1.3.2.   Signal Detection Systems   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  22    1.3.3.   Assay Development for HTS  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  23  1.4.   Objectives of the Study  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  25    2.   Materials and Methods  2.1.   Maintenance of cell lines                2.1.1.   Culturing PK15‐C1 Cells   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27    2.1.2.   Culturing 3D4/31 Cells   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  27    2.1.3.   Culturing #4 Clone Hybridoma Cells  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28    2.1.4.   Cryopreservation of Cells  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  28    2.1.5.   Establishment of Cell Growth Curve  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28    Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication        Page | 2         2.2.  Production of High Titer PCV2 Stock                2.2.1.   Infecting Cells and Harvesting Virus  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29     2.2.2.   Increasing PCV2 Titer   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  30    2.2.3.   Detection of Infection by Western Blot   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31    2.2.4.   Detection of Infection by PCR   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  31  2.2.5.   Virus titration by IFA   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32  2.3.  Cell‐Based Screening Assay Optimization              2.3.1.   Downscaling IFA to 384‐well Plate Format  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  33    2.3.2.   Cell‐Based ELISA   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  33  2.4.  Testing Efficacy of Reference Drugs Against PCV2 Replication  2.4.1.   Establishment of Standard Curve for FI at Various   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  34                                Seeding Densities  2.4.2.   Evaluating Drug Cytotoxicity    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34  2.4.3.   Inhibition of PCV2 Replication with Reference Drugs  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35  2.5.  Generation of Graphs and Statistical Analyses    . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .   35    3.   Results  3.1.  Preparation of materials needed for the screening  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37    3.1.1.   Finding the best cell line for the screening assay   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37    3.1.2.   Growth dynamics of PK15‐C1 cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  39    3.1.3.   Generation of high titer PCV2 stock . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  39  3.1.4.   Large‐scale production of monoclonal antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40                               (clone #4)  3.2.  Scaling down of Assay to 384‐well plates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  42  3.2.1.   Comparison of infection rates between glucosamine‐treated . . . . . . . . . . . . . . .  42                     and untreated cells  3.2.2.   Determining optimum cell seeding density, MOI, and . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  42                duration of infection    Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication        Page | 3         3.2.3.   Infection at higher MOI to induce 50% infection rates. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47  3.2.4.   Comparison of FITC with Alexa Fluor 546 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49    3.3.  Testing efficacy of reference drugs against PCV2 replication . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50  3.3.1.   Standardizing the alamar blue cytotoxicity assay. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50  3.3.2.   Determining cell tolerance for CAPE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51  3.3.3.   Efficacy of CAPE against PCV2 replication . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52  3.3.4.  Development of screening assay using cell‐ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53    Discussion  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .   58    References  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73    Appendix  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  79  6.1.  Effect of glucosamine treatment on infection rates at . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  79                 various seeding densities          6.2.  Standard curves for FI and absorbance with alamar blue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  82                          Cell‐Based Screening Assay for Inhibitors of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) Replication        Page | 4         Summary    PVC2  is  a  small  non‐enveloped  virus  that  causes  a  wide  array  of  porcine  diseases  categorized  under  the  umbrella  term  PCV‐Associated  Diseases  (PCVAD).  To  date,  the  only  available antiviral strategy, albeit ineffective against diseased pigs, is prevention via vaccination.  Thus,  treatment  of  affected  pigs  requires  discovery  of  drugs  that  inhibit  viral  replication.  The  focus  of  this  MSc  project  was  to  develop  a  suitable  primary  screening  assay  for  inhibitors  of  PCV2 replication and subsequently perform a proof of concept trial using reference drugs. PK15‐ C1, a cell line previously shown to be highly permissive to PCV2 infection (Zhu et al., 2007), was  used in the study to grow PCV2 to a high titer (106 TCID50/ml) and exhibited infection rates > 50%  at 15 MOI in a 96‐well plate format. The assay was subsequently scaled down to 384‐well plates  for  better  amenability  to  HTS,  and  the  major  part  of  the  study  was  aimed  at  optimizing  this.  Infection with PCV2 was done both at low ( 10) MOI but neither succeeded in  inducing minimum of 50% infection rate. Even with proof of concept trials performed in 96‐well  plates employing reference drugs CAPE, U0126, and MPA at 15 MOI resulted to infection rates  lower than 50%. This sudden and unexpected drop in infectivity precluded further testing, so a  cell‐based  ELISA,  which  does  not  require  minimum  infection  rate,  was  tested  instead.  Assay  sensitivity was assessed by S/N and S/B ratios. Although S/N ratios were promising, S/B values  were