Giáo trình thực tập sinh học đại cương

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA DƢỢC GIÁO TRÌNH THỰC TẬP SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG (Lƣu hành nội bộ) Năm 2014 NỘI QUY PHÒNG THỰC TẬP 1. Sinh viên phải thực hiện đầy đủ các bài thực tập theo chƣơng trình của môn học. Sinh viên vắng 1 buổi thực tập sẽ không đƣợc thi hết môn. 2. Sinh viên phải đến phòng thực tập đúng giờ qui định. Trong giờ thực hành, sinh viên muốn ra ngoài phòng thực tập phải xin phép giảng viên. Giờ thực tập: - Sáng: 7h30-11h15 - Chiều: 12h50-16h35 - Tối: 17h00-20h45 3. Sinh viên muốn nghỉ thực tập thì phải làm đơn xin phép nghỉ và ghi rõ ngày đi thực tập bù nộp cho giảng viên phụ trách buổi thực tập (thực tập bù ngay trong tuần). Khi đi thực tập bù, sinh viên phải trình đơn có chữ ký xác nhận cho giảng viên. Thực tập bù đúng bài qui định. 4. Sinh viên phải đọc bài thực tập trƣớc khi đến phòng thực tập. 5. Trong giờ thực tập, sinh viên phải đội mũ, mặc áo blouse (có gài nút), đeo bảng tên và tắt chuông điện thoại. Không tự ý sử dụng máy móc khi chƣa có sự cho phép của giảng viên. 6. Sau mỗi buổi thực tập, sinh viên phải sắp xếp dụng cụ đúng vị trí, vệ sinh sạch sẽ phòng thực tập. Tắt tất cả các thiết bị điện trƣớc khi ra về. 7. Sinh viên làm hƣ hỏng, bể vỡ dụng cụ phải đền trƣớc khi môn học kết thúc thì mới đƣợc dự thi hết môn. 8. Sinh viên phải thực hiện đúng quy định phòng cháy, chữa cháy. ii MỤC LỤC PHẦN A. SINH HỌC TẾ BÀO ..................................................................................1 Bài 1. KÍNH HIỂN VI - QUAN SÁT TẾ BÀO NHÂN SƠ VÀ TẾ BÀO NHÂN CHUẨN.......................................................................................................................2 1. Kính hiển vi quang học ........................................................................................2 2. Phƣơng pháp thực hiện tiêu bản hiển vi ...............................................................5 3. Thực hành: Quan sát tế bào nhân sơ, tế bào nhân chuẩn .....................................6 Bài 2. MỘT SỐ BÀO QUAN, CHẤT DỰ TRỮ VÀ CHẤT CẶN BÃ CỦA TẾ BÀO THỰC VẬT .......................................................................................................7 1. Các bào quan ........................................................................................................7 2. Chất dự trữ ............................................................................................................8 3. Chất cặn bã ...........................................................................................................9 Bài 3. TÍNH THẤM QUA MÀNG TẾ BÀO – NGUYÊN PHÂN ...........................10 1. Màng tế bào ........................................................................................................10 2. Nguyên phân.......................................................................................................11 PHẦN B. SINH HỌC PHÂN TỬ .............................................................................12 Bài 1. KỸ THUẬT CƠ BẢN ....................................................................................13 1. Một số dụng cụ cơ bản .......................................................................................13 2. Cách cân pha hóa chất cần thiết .........................................................................15 Bài 2. AN TOÀN THÍ NGHIỆM – CÁC PHƢƠNG PHÁP THANH TRÙNG ......17 1. An toàn phòng thí nghiệm cơ bản ......................................................................17 2. Xử lý chất thải ....................................................................................................18 3. Phƣơng pháp khử trùng ......................................................................................18 Bài 3. CHIẾT TÁCH PLASMID PBLUESCRIPT TỪ E.COLI BẰNG PHƢƠNG PHÁP MẪU NHỎ (MINIPREP) ..............................................................................22 1. Nguyên tắc ..........................................................................................................22 2. Nguyên vật liệu ..................................................................................................22 3. Thực hành ...........................................................................................................22 Bài 4. CHIẾT TÁCH ADN BỘ GEN TỪ TẾ BÀO MÁ Ở NGƢỜI........................24 1. Vật liệu – hóa chất ..............................................................................................24 2. Nguyên tắc ..........................................................................................................24 3. Phƣơng pháp tiến hành .......................................................................................25 Bài 5. CHIẾT TÁCH ADN TỪ MÔ THỰC VẬT ...................................................26 1. Phƣơng pháp MITSUI ........................................................................................26 2. Phƣơng pháp CTAB ...........................................................................................27 Bài 6. KỸ THUẬT CẮT GIỚI HẠN ADN ..............................................................29 1. Vật liệu – hóa chất ..............................................................................................29 2. Các enzyme cắt giới hạn.....................................................................................29 3. Phƣơng pháp tiến hành .......................................................................................30 Bài 7. PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE ....................................31 1. Nguyên vật liệu ..................................................................................................31 2. Tiến hành ............................................................................................................31 iii Bài 8. PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ADN BẰNG ĐO MẬT ĐỘ QUANG .....33 1. Nguyên tắc ..........................................................................................................33 2. Nguyên vật liệu ..................................................................................................33 3. Tiến hành ............................................................................................................33 Bài 9. PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI ADN - PCR .....................................................34 1. Nguyên tắc chung ...............................................................................................34 2. Thực hành ...........................................................................................................34 PHA CHẾ MỘT SỐ HÓA CHẤT DÙNG TRONG THỰC HÀNH ........................36 iv PHẦN A SINH HỌC TẾ BÀO Biên soạn: PGS.TS. Trƣơng Thị Đẹp 1 Bài 1 KÍNH HIỂN VI - QUAN SÁT TẾ BÀO NHÂN SƠ VÀ TẾ BÀO NHÂN CHUẨN MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Nêu được các thành phần cấu tạo của kính hiển vi quang học và sử dụng được kính hiển vi để quan sát tế bào. 2. Thực hiện được các tiêu bản hiển vi để quan sát bằng kính hiển vi quang học. 3. Quan sát và vẽ được hình dạng và cấu tạo của tế bào nhân sơ và nhân chuẩn. 1. Kính hiển vi quang học Thân kính Chân kính Hình 1. Kính hiển vi 2 thị kính hiệu OLYMPUS 2 1.1. Cấu tạo của kính hiển vi Các bộ phận cơ bản của một kính hiển vi quang học (Hình 1) nhƣ sau: a. Chân kính: Để giữ thăng bằng cho kính, có các hình dạng khác nhau. b. Thân kính: Từ dƣới lên trên gồm các bộ phận sau: - Bộ phận lấy ánh sáng: là đèn chiếu sáng hoặc gương phản chiếu đƣợc gắn trên chân kính. Gƣơng phản chiếu có hình tròn, gồm một mặt phẳng và một mặt lõm, có thể xoay theo nhiều hƣớng khác nhau; trong thực hành tại Bộ môn, sinh viên chỉ sử dụng mặt lõm của gƣơng để hội tụ ánh sáng từ nguồn sáng là đèn néon hay ánh sáng mặt trời. - Bàn kính (bàn mang lam kính): Để đặt tiêu bản, có hình tròn hay hình vuông, ở giữa có một lỗ thủng để cho ánh sáng đi từ dƣới lên. Trên bàn kính có kẹp dùng để cố định lam kính. Lam kính có thể di chuyển theo chiều ngang và chiều dọc nhờ các ốc di chuyển gắn trên bàn kính. Bàn kính có thể đƣợc cố định hay di chuyển lên xuống bằng ốc sơ cấp. - Ốc di chuyển vật kính: gồm ốc điều chỉnh lớn (ốc sơ cấp) và ốc điều chỉnh nhỏ (ốc vi cấp). Ốc sơ cấp giúp nâng lên hoặc hạ xuống bàn kính hoặc vật kính; khi điều chỉnh bằng ốc sơ cấp khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản quan sát thì thay đổi mắt thƣờng có thể nhìn thấy đƣợc. Ốc vi cấp dùng điều chỉnh hình ảnh rõ nét hơn. - Tụ quang: có hình trụ, nằm ngay bên dƣới bàn kính; đây là một hệ thống thấu kính dùng để hội tụ ánh sáng từ gƣơng phản chiếu để tạo thành chùm tia sáng mạnh hơn, có thể di chuyển nhờ một ốc gắn trên thân kính. Phía dƣới hệ thống sáng có một cần gạt để mở hay đóng cửa sổ chắn sáng giúp ta điều chỉnh nguồn ánh sáng vào nhiều hay ít. - Cần kính: là chỗ cầm kính hiển vi khi di chuyển kính, ở đầu mang thị kính, ở giữa có gắn một bàn xoay trên đó có gắn các vật kính có độ phóng đại khác nhau. - Vật kính: là bộ phận quan trọng và phức tạp nhất của kính hiển vi, bên ngoài vỏ có ghi: loại vật kính, độ phóng đại, độ mở,… Ví dụ: Vật kính có ghi 40X/0.65 và 160/0.17 thì có nghĩa là: vật kính có độ phóng đại là 40 lần, độ mở của tụ quang là 0,65, chiều dài ống kính phù hợp là 160 mm, chiều dày của phiến kính trung bình là 0,17 mm ( 0,02 mm). Các kính hiển vi sử dụng tại Bộ môn thƣờng có 4 loại vật kính có độ phóng đại là 4, 10, 40 và 100 lần (4X, 10X, 40X, 100X). Các vật kính trên có thể: + Di chuyển xoay tròn nhờ một bàn xoay, trong bàn xoay có một cái khớp. Khi muốn quan sát ở vật kính nào thì xoay vật kính đó vào đúng khớp. + Di chuyển lên - xuống nhờ ốc sơ cấp. - Thị kính: gồm 2 thấu kính có mặt lõm hƣớng xuống phía dƣới, trên mặt có ghi những độ phóng đại khác nhau thƣờng là 10 lần (10X). Kính hiển vi có loại có 1 thị kính, có loại có 2 thị kính. 3 Các bộ phận: chân kính, bàn kính, kẹp, ốc di chuyển vật kính là phần cơ học của kính hiển vi. Các bộ phận: tụ quang, vật kính, thị kính, đèn chiếu sáng, gƣơng phản chiếu là phần quang học. 1.2. Cách sử dụng kính hiển vi Mỗi buổi thực hành, trƣớc khi sử dụng kính hiển vi, sinh viên phải kiểm tra các bộ phận của kính, nếu thấy thiếu bộ phận hay bộ phận nào đó bị thay đổi thì báo cáo ngay cho giáo viên hƣớng dẫn. Trƣớc khi cắm điện cần phải kiểm tra công tắc ở vị trí 0 và nút chỉnh cƣờng độ sáng ở vị trí nhỏ nhất. a. Điều chỉnh ánh sáng cho quang trƣờng - Đối với kính hiển vi có 2 thị kính và có đèn gắn trên chân kính Làm tuần tự các bƣớc sau đây: + Cắm điện. + Bật công tắc đèn từ vị trí 0 sang I. + Vặn nút chỉnh cƣờng độ sáng tăng dần. + Mở cửa sổ chắn sáng tối đa. + Nâng tụ quang lên cho đến khi mặt kính tròn trên đầu tụ quang cách bàn mang vật khoảng 5 mm. + Xoay vật kính nhỏ (10X) vào vị trí quan sát (vào khớp). - Đối với kính hiển vi có 1 thị kính và có gƣơng phản chiếu + Xoay mặt lõm của gƣơng phản chiếu vào nguồn sáng (có thể là ánh sáng mặt trời hay ánh sáng điện). + Mở cửa sổ chắn sáng tối đa. + Nâng tụ quang lên cho đến khi mặt kính tròn trên đầu tụ quang cách bàn mang vật khoảng 5 mm. + Xoay vật kính nhỏ (10X) vào vị trí quan sát (vào khớp). + Nhìn vào thị kính, tay điều chỉnh gƣơng phản chiếu hƣớng về nguồn sáng cho đến khi quang trƣờng sáng tối đa. b. Quan sát mẫu vật - Đặt tiêu bản lên bàn kính và kẹp chặt lại. Điều chỉnh sao cho mẫu vật quan sát nằm đúng ở giữa lỗ trống của bàn kính và ngay bên dƣới đầu vật kính 10X. - Dùng ốc sơ cấp chỉnh cho bàn kính lên cao tối đa (hoặc hạ từ từ vật kính xuống cho đến khi đầu vật kính cách phiến kính mỏng khoảng 5 mm). - Nhìn vào thị kính, tay vặn ốc sơ cấp để hạ từ từ bàn kính xuống (hoặc nâng từ từ vật kính lên) cho đến khi nhìn thấy mẫu vật cần quan sát trong quang trƣờng. - Dùng ốc di chuyển tiêu bản để quan sát sơ bộ toàn bộ mẫu vật. - Khi muốn chuyển sang quan sát ở vật kính lớn: ta giữ nguyên trạng thái của kính hiển vi, dùng tay xoay nhẹ nhàng đĩa mang vật kính để đƣa vật kính cần quan sát (ví dụ vật kính 40X) vào khớp, sau đó vặn ốc vi cấp để thấy rõ nét mẫu vật. 4 1.3. Những điều chú ý khi sử dụng kính hiển vi - Khi di chuyển kính phải dùng cả hai tay để cầm kính, một tay cầm trên cần kính, một tay đỡ dƣới chân kính và luôn luôn để kính đứng thẳng. - Trong khi sử dụng kính hiển vi: + Không để dung dịch quan sát dính vào đầu vật kính hay nhỏ xuống dƣới tụ quang. + Vặn các ốc nhẹ nhàng. Đặc biệt đối với ốc vi cấp, khi vặn theo một chiều mà thấy cứng thì lập tức phải vặn ngƣợc trở lại, không bao giờ cố vặn tới (sẽ gãy ốc vi cấp). + Nếu ngƣng quan sát một thời gian thì phải giảm nguồn sáng (không cần tắt đèn). - Sau khi sử dụng kính hiển vi: + Giảm tối đa ánh sáng của đèn chiếu sáng. + Tắt đèn. + Lau cẩn thận phần cơ học bằng vải mềm khô và sạch. + Lau cẩn thận phần quang học bằng giấy lau kính của Bộ môn. Tuyệt đối không đƣợc dùng khăn lau hay sờ tay vào các phần quang học. - Cất kính hiển vi vào tủ: + Xoay vật kính nhỏ nhất vào khớp. + Rút dây điện khỏi ổ cắm và quấn tròn quanh cần kính. + Cất kính vào tủ theo đúng vị trí của kính. 2. Phƣơng pháp thực hiện tiêu bản hiển vi 2.1. Phƣơng pháp thực hiện Làm tuần tự các bƣớc sau: - Cho 1 giọt dung dịch quan sát (nƣớc cất, glycerin, KI, Soudan III…) vào giữa phiến kính dày (phiến kính mang vật, lame). - Đặt mẫu vật cần quan sát vào giữa giọt dung dịch. - Đậy nhẹ nhàng phiến kính mỏng (phiến kính đậy vật, lamelle) lên mẫu vật sao cho không có bọt khí trong dung dịch. Lưu ý: - Nếu dung dịch cho vào không đủ (không bao phủ hết mẫu vật), khi đó phải cho thêm dung dịch vào bằng cách dùng ống nhỏ giọt cho từ từ dung dịch vào một cạnh của phiến kính mỏng, dung dịch sẽ tự lan vào giữa 2 phiến kính. - Nếu dung dịch cho vào quá dƣ, trào ra ngoài phiến kính mỏng thì phải dùng giấy thấm lau hết phần dung dịch thừa bên ngoài phiến kính mỏng. 2.2. Cách thay dung dịch quan sát Khi cần quan sát một mẫu vật ở nhiều dung dịch khác nhau, có thể thay dung dịch bằng cách: dùng giấy thấm đặt ở một cạnh của phiến kính mỏng để rút dung dịch đang sử dụng, nhỏ 1-2 giọt dung dịch cần thay vào cạnh đối diện của phiến kính mỏng. 5 3. Thực hành: Quan sát tế bào nhân sơ, tế bào nhân chuẩn - Vật liệu: Bèo hoa dâu - Vi khuẩn lam, tế bào biểu mô miệng, củ Hành tây. - Hóa chất, dụng cụ: + Dung dịch iod, nƣớc cất. + Dao lam, bông gòn y tế. 3.1. Tế bào nhân sơ Vi khuẩn lam có cấu tạo là tế bào nhân sơ, có khả năng tự dƣỡng nhờ quang hợp, sống cộng sinh trong bèo hoa dâu. Các bƣớc thực hiện: - Đặt ngƣợc một khuôn bèo hoa dâu lên phiến kính dày có sẵn một giọt nƣớc, dùng kim mũi mác làm nát cánh bèo, đậy phiến kính mỏng. - Quan sát: Hình dạng và cách sắp xếp các tế bào của vi khuẩn lam trên kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X. 3.2. Tế bào nhân chuẩn 3.2.1. Tế bào biểu bì Hành tây Các bƣớc thực hiện: - Dùng dao lam rạch mặt trong vảy Hành tây một hình vuông cạnh 2 mm. Bóc lớp biểu bì (lớp ngoài cùng) của hình vuông vừa rạch. Úp mặt vừa bóc lên phiến kính dày có sẵn 1 giọt dung dịch iod. Đậy phiến kính mỏng lên mẫu vật. - Quan sát: Hình dạng và các thành phần của tế bào biểu bì trên kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X. 3.2.2. Tế bào biểu mô miệng Các bƣớc thực hiện: - Dùng bông vô trùng quệt vào vòm họng, sau đó phết lên phiến kính dày trong 1 giọt nƣớc và đậy phiến kính mỏng lên mẫu vật. - Quan sát: Hình dạng tế bào và các thành phần của tế bào biểu mô miệng trên kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X. BÁO CÁO THỰC HÀNH 1. Hình vẽ và chú thích đầy đủ cấu tạo của tế bào vi khuẩn lam. 2. Hình vẽ và chú thích đầy đủ cấu tạo của tế bào biểu bì vảy Hành tây. 3. Hình vẽ và chú thích đầy đủ cấu tạo của tế bào biểu mô miệng. 6 Bài 2 MỘT SỐ BÀO QUAN, CHẤT DỰ TRỮ VÀ CHẤT CẶN BÃ CỦA TẾ BÀO THỰC VẬT MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Quan sát và vẽ đúng một số bào quan của tế bào thực vật. 2. Quan sát và vẽ đúng các dạng chất dự trữ và chất cặn bã ở tế bào thực vật. Vật liệu: Quả Ớt chín, lá Lẻ bạn, lá Rong đuôi chồn, tinh bột Khoai tây, củ Thƣợc dƣợc, hạt Thầu dầu, cuống lá Trầu bà, thân Rau sam, phiến lá Đa búp đỏ. Hóa chất, dụng cụ: - Dung dịch iod, nƣớc cất, dung dịch Soudan III, ethanol 900, ether. - Dao lam, giấy thấm 1. Các bào quan 1.1. Sắc lạp ở quả Ớt chín Các bƣớc thực hiện: - Dùng dao lam cắt ngang thịt quả Ớt chín thành lát mỏng. Đặt lát cắt lên phiến kính dày đã có một giọt nƣớc, đậy phiến kính mỏng. - Quan sát: Hình dạng, màu sắc và cách sắp xếp của sắc lạp trong tế bào trên kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X 1.2. Vô sắc lạp ở tế bào biểu bì lá Lẻ bạn Các bƣớc thực hiện: - Dùng dao lam tách một mảnh biểu bì dƣới (mặt có màu tím) của lá Lẻ bạn. Úp mặt biểu bì vừa bóc lên phiến kính dày trong 1 giọt nƣớc, đậy phiến kính mỏng. - Quan sát: Hình dạng, màu sắc và vị trí của vô sắc lạp trong tế bào trên kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X. 1.3. Lục lạp và sự chuyển động của tế bào chất ở lá Rong đuôi chồn Tế bào sống thì chất tế bào luôn chuyển động tạo thành dòng nội chất. Tuy nhiên, ta không thể quan sát trực tiếp sự chuyển động này vì chất tế bào trong suốt. Chất tế bào di chuyển sẽ lôi kéo các hạt lục lạp di chuyển theo. Nhờ đó chúng ta có thể quan sát gián tiếp sự chuyển động của chất tế bào nhờ vào sự di chuyển của các hạt lục lạp. Các bƣớc thực hiện: - Chọn một lá rong đuôi chồn tƣơi xanh, đặt lên phiến kính dày trong một giọt nƣớc, đậy phiến kính mỏng. - Quan sát: Hình dạng, màu sắc và sự di chuyển của lục lạp trong tế bào trên kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X. 7 Chú ý: Tìm những tế bào ở vùng gần gân lá của lá rong sẽ dễ tìm thấy sự chuyển động của chất tế bào hơn. 2. Chất dự trữ 2.1. Glucid - Tinh bột: là loại chất dự trữ phổ biến nhất trong tế bào thực vật (trong củ, thân, rễ, hạt…). Mỗi loại cây có dạng tinh bột riêng, đặc sắc cho loại cây đó. Các bƣớc thực hiện: + Dùng đầu kim lấy một ít tinh bột Khoai tây đặt lên phiến kính dày trong một giọt nƣớc, đậy phiến kính mỏng.. + Quan sát hạt tinh bột trong nƣớc ở vật kính 10X, 40X. + Thay nƣớc thƣờng bằng 1-2 giọt nƣớc iod. Ghi nhận màu sắc của hạt tinh bột. - Inulin: là một đồng phân của tinh bột, tan trong nƣớc nhƣng kết tinh trong cồn cao độ thành những tinh thể hình cầu. Các bƣớc thực hiện: + Dùng dao lam cắt ngang một lát mỏng củ Thƣợc dƣợc, đặt lát cắt lên phiến kính dày trong một giọt ethanol 900, đậy phiến kính mỏng. + Quan sát tinh thể inulin ở vật kính 10X, 40X. 2.2. Protid Hạt A-lơ-rôn là dạng chất dự trữ protid của thực vật thƣờng gặp trong hạt, đƣợc hình thành từ sự mất nƣớc cùa không bào trong quá trình hạt chín. Hạt a-lơ-rôn không màu, chiết quang, có hình cầu hay hình bầu dục gồm một cầu thể và một á tinh thể. Các bƣớc thực hiện: - Bóc vỏ hạt Thầu dầu, dùng dao lam cắt ngang phôi nhũ hạt thành lát mỏng, đặt lên phiến kính dày. Cho vài giọt ether lên lát cắt, để khô, sau đó cho một giọt nƣớc iod vào lát cắt, đậy phiến kính mỏng. - Quan sát hạt a-lơ-rôn ở 40X. 2.3. Lipid Giọt dầu mỡ là dạng chất dự trữ lipid ở thực vật, không màu hay màu vàng, rất chiết quang, không tan trong nƣớc, cho màu đỏ cam với Soudan III. Các bƣớc thực hiện: - Dùng dao lam cắt ngang phôi nhũ hạt Thầu dầu thành lát mỏng, đặt lên phiến kính dày và nhỏ vào một giọt Soudan III, đậy phiến kính mỏng. - Quan sát giọt dầu mỡ ở vật kính 10X, 40X. 8 3. Chất cặn bã Các bƣớc thực hiện: - Cắt ngang các mẫu: Cuống lá Trầu bà, thân Rau sam, phiến lá Lẻ bạn, phiến lá Đa búp đỏ thành lát mỏng, đặt lên phiến kính dày đã có 1 giọt nƣớc, đậy phiến kính mỏng. - Quan sát các vi phẫu ở vật kính 10X, 40X. 3.1. Tinh thể calci oxalat - Hình kim (cuống lá Trầu bà): các tinh thể có thể nằm riêng lẻ hay xếp thành bó. - Hình cầu gai (thân Rau sam): các tinh thể có hình cầu gai. - Hình khối (phiến lá Lẻ bạn): tinh thể có hình khối lăng trụ rải rác trong tế bào. 3.2. Tinh thể calci carbonat (bào thạch, nang thạch) trong phiến lá Đa búp đỏ Tinh thể có dạng một khối xù xì nhƣ quả Mít, treo bởi một cuống bằng cellulose có tẩm silic vào vách tế bào hạ bì chứa nó (thạch bào). BÁO CÁO THỰC HÀNH 1. Hình vẽ tế bào mô mềm của thịt quả Ớt chín có sắc lạp. 2. Hình vẽ tế bào biểu bì lá Lẻ bạn có vô sắc lạp. 3. Hình vẽ tế bào lá Rong đuôi chồn có lục lạp và đánh dấu dòng chuyển động của tế bào chất. 4. Hình vẽ tinh bột, tế bào có các dạng chất dự trữ và chất cặn bã. Các hình vẽ đều có chú thích đầy đủ. 9 Bài 3 TÍNH THẤM QUA MÀNG TẾ BÀO – NGUYÊN PHÂN MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Giải thích được các hiện tượng xảy ra khi để tế bào thực vật trong dung dịch ưu trương hay nhược trương. 2. Thực hiện được thí nghiệm chứng minh chức năng của màng sinh chất và giải thích được kết quả của thí nghiệm. 3. Quan sát và vẽ đúng các kỳ của phân bào nguyên nhiễm. Vật liệu: Lá Lẻ bạn, củ Dền đỏ, rễ Hành tím. Hóa chất, dụng cụ: - Dung dịch NaCl 3%, nƣớc cất, nƣớc 30oC, 50oC, 70oC, 80oC, 100oC và ethanol 300, phẩm nhuộm orcein, dung dịch HCl 1N. - Dao, dao lam, cốc nhỏ, becher 500 ml, kẹp gắp. 1. Màng tế bào 1.1. Hiện tƣợng thẩm thấu Đối với tế bào sống, màng tế bào sẽ kiểm soát sự di chuyển của nƣớc và các chất tan. Sự khuếch tán nƣớc qua màng sinh chất của tế bào thực vật đƣợc gọi là sự thẩm thấu. Trong dung dịch không cân bằng áp suất thẩm thấu, nƣớc sẽ di chuyển qua màng sinh chất từ nơi có áp suất thẩm thấu thấp (môi trƣờng nhƣợc trƣơng) đến nơi có áp suất thẩm thấu cao hơn (môi trƣờng ƣu trƣơng) cho đến khi áp suất thẩm thấu cân bằng giữa bên trong và bên ngoài tế bào. Tế bào biểu bì lá Lẻ bạn có chứa anthocyan nên có màu tím. Ở điều kiện sống bình thƣờng, màng sinh chất áp sát vách tế bào nên màu tím nhuộm đầy tế bào. Các bƣớc thực hiện: - Bóc biểu bì dƣới của lá Lẻ bạn (mặt có màu tím). Quan sát tế bào biểu bì trong một giọt nƣớc ở vật kính 10X. Thay nƣớc bằng dung dịch NaCl 3%. Quan sát dƣới kính hiển vi hiện tƣợng gì sẽ xảy ra trên các tế bào biểu bì? - Thay nƣớc muối bằng nƣớc thƣờng, lặp lại 2 lần. Quan sát dƣới kính hiển vi hiện tƣợng gì sẽ xảy ra trên các tế bào biểu bì? Chú ý: Không nên kéo dài thời gian quan sát trong dung dịch NaCl 3% quá 5 phút, vì tế bào có thể bị chết, khi đó không thể thực hiện đƣợc giai đoạn tiếp. 1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và dung môi hữu cơ lên tính thấm của màng sinh chất Màng sinh chất là màng lipo-protein, các phức hợp này có thể bị tổn thƣơng do nhiệt độ hay hóa chất, làm phá vỡ cấu trúc chuyên biệt và làm cho màng mất khả năng kiểm soát hoạt động sinh lý bình thƣờng. Khi màng sinh chất bị tổn thƣơng, 10 nó không còn khả năng giữ các chất tan trong tế bào và do đó các chất này khuếch tán ra ngoài tế bào theo nguyên lý cân bằng áp suất thẩm thấu. Các bƣớc thực hiện: - Cắt củ Dền đỏ thành 6 miếng đều nhau, có kích thƣớc 1 x 5 x 2 cm, rửa dƣới dòng nƣớc chảy cho đến khi nƣớc rửa không còn màu tím. Ngâm các miếng củ Dền trong nƣớc sạch. - Lấy 6 cốc nhỏ, mỗi cốc đựng 30 ml nƣớc thƣờng, đánh số thứ tự từ 1 đến 6. - Chuẩn bị nƣớc có nhiệt độ thay đổi: 30oC (nhiệt độ phòng thí nghiệm), 50oC, 70oC, 80oC, 100oC và ethanol 30o. - Cho 1 miếng Dền vào cốc đựng nƣớc 30oC trong thời gian 2 phút. Sau đó, chuyển miếng Dền vào cốc số 1 và để yên trong 30 phút. - Cho 1 miếng Dền khác vào cốc đựng nƣớc 50oC trong thời gian 2 phút. Sau đó, chuyển miếng Dền vào cốc số 2 và để yên trong 30 phút. - Tiếp tục thực hiện nhƣ trên đối với 3 miếng Dền khác ở các nhiệt độ xử lý là o 70 C, 80oC và 100oC. Sau 2 phút xử lý, chuyển các miếng Dền vào các cốc tƣơng ứng là cốc 3, cốc 4, cốc 5 và để yên 30 phút. - Cho miếng Dền còn lại vào cốc đựng ethanol 30o trong thời gian 2 phút. Sau đó, chuyển miếng Dền vào cốc số 6 và để yên trong 30 phút. - Sau 30 phút, gắp các miếng Dền ra khỏi cốc, ghi nhận màu sắc của dung dịch trong 6 cốc. 2. Nguyên phân Các bƣớc thực hiện: - Trồng củ Hành ta trong dung dịch Knop ½ 24 giờ. Khi rễ có chiều dài 0,5-1 cm thì cắt chóp rễ một đoạn dài khoảng 2 mm, nhuộm với 0,5 ml orcein và 1 giọt dung dịch HCl 1N trong 2 giờ. Vớt chóp rễ đặt trên phiến kính dày trong một giọt glycerin, đậy phiến kính mỏng rồi đè bẹp mẫu vật bằng đầu que diêm. - Quan sát ở vật kính 10X và 40X các tế bào mô phân sinh rễ Hành ta ở các giai đoạn: Gian kỳ (interphase), kỳ đầu (prophase), kỳ giữa (metaphase), kỳ sau (anaphase) và kỳ cuối (telophase). BÁO CÁO THỰC HÀNH 1. Hình vẽ hiện tƣợng co nguyên sinh và phản co nguyên sinh. 2. Đánh giá kết quả của thí nghiệm trên các miếng Dền đỏ bằng các dấu + để chỉ mức độ màu của dung dịch. Giải thích kết quả. 3. Hình vẽ các kỳ của phân bào nguyên nhiễm và gian kỳ ở tế bào mô phân sinh rễ Hành ta. Các hình vẽ phải có chú thích đầy đủ. 11 PHẦN B SINH HỌC PHÂN TỬ Biên soạn: TS. Lê Nguyễn Uyên Chi 12 Bài 1 KỸ THUẬT CƠ BẢN MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Biết cách sử dụng một số dụng cụ cơ bản 2. Nắm vững một số kỹ thuật cơ bản trong thực hành 1. Một số dụng cụ cơ bản 1.1. Micropipet Pipet tự động có thể điều chỉnh đƣợc thể tích cần lấy. Micropipet có nhiều kích cỡ: 0,1→1µl, 1→ 10 µl, 1→ 20 µl, 10→ 100 µl, 10→ 200 µl, 100→ 1000 µl …, và kèm theo tip tƣơng ứng: 0,1→ 10 µl (trắng), 10→ 200 µl (vàng), 100→ 1000 µl (xanh). Khi sử dụng chọn cỡ pipet và tip phù hợp với thể tích cần lấy để tránh sai số. Cấu tạo micropipet thay đổi tùy theo kiểu thiết kế nhƣng nhìn từ bên ngoài đều gồm; cần bơm, bộ phận điều chỉnh thể tích, số chỉ thể tích đƣợc chọn, bộ phận đẩy tip (có thể tháo rời), đầu hút (nơi gắn tip). Sử dụng: cầm chắc pipet trong lòng bàn tay sao cho ngàm tựa tì lên đốt đầu tiên của ngón trỏ, dùng ngón cái để bấm cần bơm Núm chỉnh thể tích và núm đẩy tip. Có 2 cách sử dụng cụ thể: Cần bơm Hút một lần: điều chỉnh thể tích cần lấy, Ngàm tựa lấy tip, bấm cần bơm (một nấc) rồi giữ luôn, Núm chỉnh thể tích nhúng đầu tip vào dung dịch cần lấy, thả cần Núm đẩy tip bơm từ từ để lấy thể tích, đặt đầu tip vào nơi Số chỉ cần cho vào, bấm cần bơm để đẩy thể tích cần lấy ra. Nếu cần thiết thì bấm tiếp nấc thứ hai để tống hết phần chất lỏng còn dính ở đầu tip. Hút nhiều lần cùng một thể tích: điều Ống (cần) đẩy tip chỉnh thể tích cần lấy, lấy tip, bấm cần bơm 2 nấc rồi giữ luôn, nhúng đầu tip vào dung dịch Đầu hút cần lấy, thả cần bơm từ từ cả 2 nấc để lấy thể Tip tích, đặt đầu tip vào nơi cần cho vào, bấm cần bơm 1 nấc để đẩy thể tích cần lấy ra rồi giữ luôn (khi đó trong đầu tip vẫn còn một thể tích Hình 2. Cấu tạo micropipet thừa), nhúng đầu tip vào dung dịch cần lấy, thả cần bơm từ từ 1 nấc để lấy thể tích,... Lƣu ý: Không dùng đầu hút để hút mà phải dùng đầu tip, tip phải đƣợc gắn chặt vào đầu hút nếu không sẽ mắc sai số. 13 1.2. Eppendorf Ống đựng nhỏ bằng nhựa có nắp bật hay nắp vặn dung tích 1,5 hay 0,5 ml. Khi sử dụng cầm eppendorf trong lòng bàn tay, dùng ngón cái để bật và đóng nắp; nếu eppendorf có nắp vặn dùng ngón cái và ngón trỏ để vặn nắp. Hình 3. Eppendorf 1.3. Máy lắc rung (Vortex) Máy cấu tạo cơ bản gồm 1 rotor có tâm sai với bán kính tâm sai nhỏ, đƣợc sử dụng để lắc trộn các dung dịch hay để phân tán các cắn trong tube. Máy thƣờng có 2 chế độ vận hành: - Liên tục: rotor quay liên tục - Kích hoạt: khi ta đặt tube vào rotor rồi nhấn xuống rotor mới quay. Khi sử dụng các tube phải đƣợc đậy nắp kỹ để tránh dung dịch bắn ra ngoài và điều chỉnh tốc độ để có lực rung phù hợp với yêu cầu. Hình 4. Máy vortex 1.4. Máy ly tâm nhỏ (Microcentrifuge) Dùng để lắng các cặn lơ lửng nhƣ tế bào hay tủa. Các rotor của máy thuộc loại rotor góc và có thể thay đổi tùy theo kích thƣớc ống sử dụng. Máy ly tâm có 2 chế độ sử dụng: - Pulse (spin): Nhấn và giữ luôn nút pulse, khi muốn dừng lại thả tay ra, áp dụng để dồn các thành phần đang dính trên thành ống xuống. - Ly tâm: để lắng cặn. Chọn tốc độ và thời gian thích hợp rồi nhấn nút ly tâm. Lƣu ý: một số tube, eppendorf có thành mỏng (tube PCR) không chịu đƣợc tốc độ ly tâm cao nên có thể bị thủng. Sau khi ly tâm tủa sẽ lắng ở đáy ống phía đối diện với trục, do đó nên đặt ống vào rotor sao cho quai nắp hƣớng ra ngoài (xem hình minh họa), khi đó ta có thể dễ dàng hút phần dịch nổi mà không ảnh hƣởng đến cặn. Lực ly tâm của máy tỷ lệ với tốc độ và độ dài của bán kính rotor. 14 Hình 5. Máy ly tâm 1.5. Máy luân nhiệt Máy tạo ra các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR theo chƣơng trình định trƣớc, dùng để thực hiện phản ứng PCR hay các phản ứng có nhiệt độ thay đổi theo chu kỳ. 1.6. Máy điện di Là thiết bị dùng để tách và phân tích các hỗn hợp chất có điện tích bằng dòng điện. Hình 6. Máy luân nhiệt 2. Cách cân pha hóa chất cần thiết Các hóa chất sử dụng thƣờng đƣợc pha thành dung dịch mẹ và tồn trữ, khi dùng mới pha loãng thành nồng độ mong muốn. 2.1. Công thức cân - pha - Cân chính xác khoảng: Thể tích dung môi cần lấy (ml) = Hay Thể tích dung môi cần lấy (ml) = - Cân chính xác và pha trong thể tích cố định: Lƣợng cần cân (mg) = thể tích dung môi (ml) x nồng độ muốn pha (mg/ml) - Cân và pha theo nồng độ mol: Cần phân biệt mol là đơn vị chỉ hàm lƣợng: cho biết số phân tử gam (MW) chất cần có; và M là nồng độ phân tử gam: cho biết có bao nhiêu mol chất trong 1 lít dung dịch. Khi cân pha các chất theo nồng độ mol, ta có thể tham khảo giá trị phân tử gam đƣợc ghi trên nhãn của hóa chất tinh khiết. Ví dụ: dung dịch KCl 5 M nghĩa là trong 1 lít dung dịch có 5 mol KCl, và trong 100 ml dung dịch trên thì hàm lƣợng KCl là 0,5 mol. 15 Lƣợng cần cân (g) = thể tích dung dịch (l) x nồng độ muốn pha (M) x MW (g) Hay: Lƣợng cần cân (mg) = thể tích dung dịch (l) x nồng độ muốn pha (mM) x MW (g) Ví dụ: pha 200 ml dung dịch NaOH 1,5 M: Số gam NaOH nguyên chất cần cân = 0,2 x 1,5 x 40 = 12 g Ví dụ: pha 250 ml dung dịch NaOH 150 mM: Số gam NaOH nguyên chất cần cân = 0,2 x 150 x 40 = 1500 mg = 1,5 g 2.2. Công thức điều chỉnh nồng độ pha loãng Thể tích dung dịch mẹ cần lấy (ml) = x số ml muốn pha Hay: Thể tích dung dịch mẹ cần lấy (ml) = x Sau đó thêm dung môi vừa đủ thể tích cần pha Ví dụ: pha 100 ml TAE 0,5x từ TAE 10X Số ml TAE 10X cần lấy = (0,5/10) x 100 = 5 ml Ví dụ: pha 150 ml dung dịch EtBr 0,5 µg / ml từ dung dịch mẹ 0,5 mg/ml để nhuộm gel: Số ml dung dịch mẹ cần lấy = (0,5/500) x 150 = 0,15 ml = 150 µL Ví dụ: pha 250 ml Tris-Cl 50 mM từ Tris-Cl 2M. Số ml Tris-Cl 2M cần lấy = (50/2) x 0,25 = 6,25 ml. 16 Bài 2 AN TOÀN THÍ NGHIỆM – CÁC PHƢƠNG PHÁP THANH TRÙNG MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Hiểu biết về các quy tắc đảm bảo an toàn trong phòng thí nghiệm và khi làm việc 2. Nắm vững và vận dụng các phương pháp khử trùng khi làm thí nghiệm sinh học 1. An toàn phòng thí nghiệm cơ bản 1.1. Bảo hộ cá nhân - Phải mặc áo choàng, áo khoác hoặc đồng phục phòng thí nghiệm (PTN) trong suốt thời gian làm việc trong PTN. - Phải đeo găng tay trong tất cả các quá trình tiếp xúc trực tiếp hoặc tình cờ với các chất có khả năng gây nhiễm trùng, gây bệnh, các hóa chất độc hại. Sau khi sử dụng, tháo bỏ găng tay đúng cách và phải rửa tay. - Ngƣời làm việc trong PTN phải rửa tay sau khi thao tác với các vật liệu có khả năng gây nhiễm trùng, gây bệnh, các hóa chất độc hại và trƣớc khi ra khỏi khu vực làm việc của PTN. - Luôn đeo kính bảo hộ, mặt nạ hoặc các thiết bị bảo hộ khác để không bị các dung dịch nhiễm trùng bắn vào mắt và mặt cũng nhƣ tránh đƣợc các vật có sức ép lớn và tia cực tím nhân tạo. - Cấm ăn uống, hút thuốc trong khu vực làm việc của PTN. 1.2. Khu vực làm việc - PTN phải ngăn nắp, sạch sẽ và chỉ để những gì cần thiết cho công việc. - Vào cuối buổi thực hành, mặt bàn ghế phải đƣợc làm sạch và khử nhiễm sau khi làm đổ các vật liệu nguy hiểm. - Tất cả các vật liệu, vật phẩm và môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật phải đƣợc khử trùng trƣớc khi thải bỏ. 1.3. Ngƣời làm việc Nhằm rèn luyện kỹ năng PTN và nâng cao tính chủ động trong nghiên cứu, sinh viên khi làm thực tập cần lƣu ý một số điểm sau: - Chủ động trong công việc: xem và sắp xếp các thí nghiệm hợp lý để rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả công việc. - Nghiêm túc và cẩn thận khi làm thí nghiệm. - Trật tự trong PTN: tuân thủ các quy định làm việc, quy định về an toàn tại PTN. Giữ vệ sinh PTN. - Bảo quản các dụng cụ, thiết bị của phòng: sinh viên cần giữ gìn các dụng cụ đƣợc nhận và sử dụng cẩn thận các thiết bị của phòng. Những hƣ hỏng mất mát phải chịu bồi thƣờng tƣơng xứng. 17 - Khi ra về: phải kiểm tra tắt điện, nƣớc, máy móc không sử dụng. 2. Xử lý chất thải 2.1. Chất thải là tất cả các vật liệu cần thải bỏ Trong PTN, việc khử trùng chất thải và thải bỏ chúng sau này có liên quan chặt chẽ với nhau. Trong khi sử dụng hằng ngày, chỉ một số ít vật liệu nhiễm trùng thật sự cần thải bỏ hoặc tiêu hủy. Hầu hết các vật liệu thủy tinh, dụng cụ và áo quần bảo hộ sẽ đƣợc sử dụng lại hoặc tái sinh. Nguyên tắc hàng đầu là tất cả các vật liệu nhiễm trùng phải đƣợc khử trùng, thanh trùng hoặc thiêu hủy trong PTN. 2.2. Khử nhiễm Hấp tiệt trùng là phƣơng pháp đƣợc ƣu tiên cho tất cả các quá trình khử nhiễm. Các vật liệu để khử nhiễm hoặc thải bỏ cần đƣợc đặt trong hộp nhƣ túi nhựa tổng hợp đƣợc mã hóa màu theo nội dung công việc là thanh trùng hay thiêu hủy. 3. Phƣơng pháp khử trùng 3.1. Định nghĩa Một vật phẩm đƣợc xem là vô trùng khi không còn mang một mầm sinh vật nào nữa. Thông thƣờng sự khử trùng đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp vật lý hay hóa học. 3.2. Khử trùng bằng phƣơng pháp vật lý Có thể dùng: nhiệt, lọc, bức xạ, âm ba và siêu âm. A. Khử trùng bằng nhiệt Đối với tác nhân nhiệt, các tế bào dinh dƣỡng của vi sinh vật có thể bị giết dễ dàng. 1) Nhiệt khô (lò Pasteur hay tủ sấy) Khử trùng bằng nhiệt khô là do sự làm khô vi trùng và oxy hóa các cấu tử của chúng. Nhiệt khô dùng để khử trùng các dụng cụ bằng kim loại hay thủy tinh: ống nghiệm, hộp lồng, ống hút, các bột khô. Sự diệt trùng bằng nhiệt khô đƣợc thực hiện trong tủ sấy, đó là một phòng kín bằng kim loại, đƣợc đốt nóng bằng chất khí hay điện trở. Nhiệt độ trong lò có thể lên đến 180oC và khí nóng phải đƣợc quạt đều trong lò để tránh sự sai biệt về nhiệt độ. a) Khi dùng tủ sấy: - Các dụng cụ phải đƣợc làm khô và gói giấy để đảm bảo tính vô trùng sau khi sấy. - Khi cho dụng cụ vào lò sấy xong, đậy nắp lại. - Điều chỉnh nhiệt độ lên từ từ 175-180oC trong 30 phút (hoặc 160oC trong 2 giờ). - Tắt lò, để nguội dƣới 80oC mới đƣợc mở cửa tủ ra. Nếu không, có thể làm nứt vỡ các dụng cụ, làm ảnh hƣởng đến tính vô trùng của dụng cụ. - Lấy dụng cụ ra khỏi lò sấy: phần giấy bao hoặc bông đậy phải có màu hơi vàng. 18 - Vì nhiệt độ cao, phƣơng pháp này chỉ áp dụng cho các vật phẩm chịu đƣợc nhiệt độ trên 180oC. b) Hơ trên lửa: que cấy vi sinh, kéo, kẹp,v.v… có thể diệt trùng bằng kiểu này. Nên nhúng dụng cụ vào alcool rồi đốt làm nhiều lần. 2) Nhiệt ẩm Ƣu điểm: làm nóng nhanh, hơi nóng thấm sâu vào trong vật phẩm và cho hơi ẩm nhiều. Do đó vi sinh vật bị giết chết vì protein đông kết lại. a) Hấp Pasteur Áp dụng phƣơng pháp này phải chọn nhiệt độ diệt trùng thích hợp và thời gian cần thiết (bảng) Vi sinh vật Nấm men Nấm mốc Vi sinh vật không có bào tử Vi sinh vật có bào tử Siêu vi trùng Nhiệt độ diệt trùng Tế bào dinh dƣỡng Bào tử o o Nhiệt độ ( C) Thời gian (phút) Nhiệt độ ( C) Thời gian (phút) 50 – 70 5 – 10 70 – 80 5 – 10 60 5 – 10 70 5 – 10 60 – 70 5 – 10 60 – 70 5 – 10 60 – 70 5 – 10 120 12 b) Nƣớc sôi Diệt tế bào dinh dƣỡng, bào tử và nấm vẫn còn. Thời gian là 5 phút. c) Chƣng cách thủy nhiều lần Đối với những môi trƣờng chứa serum hay chất dễ hƣ ở nhiệt độ cao, phải áp dụng phƣơng pháp đun cách thủy với nhiệt độ 70 – 80oC, mỗi lần đun 1 giờ và liên tiếp trong 3 ngày liền. d) Hơi nƣớc lƣu thông Dùng cho dung dịch hóa học không chịu đƣợc nhiệt độ trên 100oC. Có thể dùng autoclave nhƣng luôn mở khóa thoát hơi để nhiệt độ không quá 100oC. Đun 30 phút - 1 giờ. Cũng nhƣ phƣơng pháp chƣng cách thủy nhiều lần nhƣng vật phẩm diệt trùng bằng hơi nƣớc lƣu thông phải đƣợc kiểm soát sự vô trùng bằng cách để ở 37oC trong 24 giờ. e) Hơi nƣớc bão hòa ở áp suất cao (autoclave) Nguyên tắc: Làm gia tăng nhiệt các vật bằng hơi nƣớc bão hòa dƣới một áp suất lớn hơn áp suất bình thƣờng của khí quyển. Khi áp suất hơi nƣớc tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo. 19 Nhiệt độ hơi nƣớc bão hòa ở các áp suất khác nhau: Nhiệt độ (oC) 100 112 121 128 134 Áp suất (atm) 0 0,5 1 1,5 2 Thời gian khử trùng phụ thuộc thể tích vật muốn khử trùng và dụng cụ để chứa đựng vật đó. Thông thƣờng sử dụng 121oC trong 20 phút. Với phƣơng pháp autoclave có thể tiêu diệt cả tế bào dinh dƣỡng lẫn bào tử của vi sinh vật. Sơ đồ nồi hấp áp lực autoclave: Cách sử dụng autoclave: - Cho nƣớc cất một lần vào lò đến mức quy định. - Xếp dụng cụ, vật liệu cần khử trùng vào nồi trong các giá đựng. Không nên xếp các dụng cụ sát nhau quá để hơi nƣớc thông qua dễ dàng. - Đậy nắp nồi hấp thật kín. - Mở van thoát khí. - Đun nồi cần phải loại hết không khí có sẵn trong nồi hấp ra, bởi vì ở cùng một áp suất thì nhiệt độ của hơi nƣớc đơn thuần sẽ cao hơn nhiệt độ của hỗn hợp giữa hơi nƣớc và không khí. Do đó tác dụng khử trùng của hơi nƣớc đơn thuần lên các vi sinh vật sẽ mạch hơn rất nhiều. - Khi hơi nƣớc thoát ra thành luồng liên tục (không khí trong nồi hấp đã bị loại hết), đóng van xả hơi lại. Tiếp tục đun cho áp suất tăng dần. Khi đạt đến áp suất yêu cầu, ta giữ áp suất ở mức đó trong thời gian cần thiết. Các nồi hấp hiện đại có chế độ điều chỉnh tự động. Khi áp suất đạt 1 atm, nhiệt độ nồi hấp khoảng 120 – 121oC. - Khi hết thời gian khử trùng, autoclave báo hiệu và tự động giảm dần nhiệt độ. Đợi cho áp suất trong nồi hấp cân bằng với áp suất khí quyển (kim áp kế về 0), nhiệt độ nồi hấp giảm xuống dƣới 80oC, mở van xả hơi. Mở nắp nồi hấp. Tắt điện. B. Khử trùng bằng sự lọc Dùng cho vật phẩm lỏng, có độ nhầy yếu, không chịu đƣợc nhiệt độ cao trên 60o. Cho vật phẩm đi qua một màng lọc xốp mà những lỗ có đƣờng kính nhỏ hơn đƣờng kính của vi sinh vật nhỏ nhất. Sinh vật sẽ bị giữ lại trên màng lọc, còn dung dịch đi qua sẽ vô trùng. Màng xốp có thể bằng sứ, amiante, cellulose, hỗn hợp cellulose và muối ester của cellulose. Mỗi lọc có một dung tích nhất định, có nghĩa là sự lọc phải dùng áp suất tƣơng ứng. 20 C. Khử trùng bằng bức xạ - Tia tử ngoại: thƣờng dùng nhất là tia UV, sử dụng để khử trùng phòng thí nghiệm, phòng vô trùng, bệnh viện. Tia UV chỉ diệt trùng bề mặt, không thấm sâu vào bên trong phẩm vật. - Tia âm cực: khử trùng các dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Tia âm cực có thể diệt trùng các vật đã cho vào bao gói kín. D. Âm ba và sóng siêu âm Với cƣờng độ lớn và thời gian vừa đủ sẽ làm vỡ màng tế bào và nội chất vi sinh vật sẽ chảy ra. Dùng âm ba và siêu âm với mục đích lấy các chất trong tế bào (phá vỡ tế bào) hơn là diệt trùng. 3.3. Khử trùng bằng phƣơng pháp hóa học Mục tiêu dùng chất hóa học để ngăn ngừa nhiễm trùng. Sự phân loại và sử dụng các chất sát trùng dựa vào các điểm sau: - Tính chất của vật cần sát trùng. - Loại vi sinh vật cần khử - Cần ấn định rõ các điều kiện tổng quát nhƣ nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ. Các loại chất sát trùng: phenol, rƣợu, iode, chlor và hợp chất có chlor, thuốc tẩy, v.v… 21 Bài 3 CHIẾT TÁCH PLASMID PBLUESCRIPT TỪ E.COLI BẰNG PHƢƠNG PHÁP MẪU NHỎ (MINIPREP) MỤC TIÊU HỌC TẬP Thực hiện thao tác tách chiết ADN plasmid của tế bào vi khuẩn E.coli 1. Nguyên tắc Chiết tách plasmid cũng dùng một nguyên tắc chung giống nhƣ chiết tách ADN bộ gen, tuy nhiên sự khác biệt quan trọng là phải tách ADN plasmid ra khỏi ADN nhiễm sắc thể. Tách ADN plasmid khỏi ADN nhiễm sắc thể có thể dựa vào sự khác biệt về kích thƣớc hay cấu dạng. Plasmid lớn nhất cũng chỉ bằng 8% kích thƣớc của nhiễm sắc thể E. coli. Tuy cả plasmid và nhiễm sắc thể đều có dạng vòng nhƣng trong quá trình phá vỡ tế bào và dƣới tác dụng SDS-kiềm và KOAc, ADN nhiễm sắc thể sẽ bị tách thành dạng thẳng, không hồi phục đƣợc cấu trúc ban đầu, còn ADN plasmid do kích thƣớc nhỏ hơn nên hồi phục đƣợc và trở lại dạng vòng. 2. Nguyên vật liệu - Chủng E. coli mang plasmid pBluescript II - Canh thang LB chứa ampicillin 50 µg/ml - Dung dịch GTE - Dung dịch SDS-kiềm: SDS 1%, NaOH 0,2 M. Pha dùng trong ngày. - Dung dịch KOAc 5M, pH 4,8 - RNAse 10 mg/ml - Ethanol tuyệt đối, ethanol 70% 3. Thực hành Ngày 1: - Chuẩn bị ống chứa 5 ml môi trƣờng LB chứa ampicillin 50 µg/ml - Cấy 1 khẩn lạc riêng rẻ E. coli mang pBluescript vào ống môi trƣờng và lắc qua đêm ở 37oC. Ngày 2: 1. Lấy 1 ml canh cấy cho vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ phần nƣớc nổi để lấy tế bào (phần cắn). 2. Phân tán cặn vi khuẩn trong 100 µl dung dịch GTE bằng máy vortex (phải chắc chắn là toàn bộ vi khuẩn đƣợc phân tán. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. Hình 7. Hút lấy dung dịch ADN 22 3. Thêm 200 µl dung dịch SDS-kiềm và trộn nhẹ nhàng bằng cách lật úp ngửa tube nhiều lần, ủ trong đá 5 phút. 4. Thêm 150 µl dung dịch KOAc 5M và trộn nhẹ nhàng bằng cách lật úp ngửa tube nhiều lần. Ủ trong đá 5 phút sẽ có tủa trắng hiện ra. 5. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để lắng các mảnh vỡ của vi khuẩn. 6. Chuyển phần nƣớc nổi sang một eppendorf 1,5 ml mới, tuyệt đối tránh chuyển phần cặn. Nếu lỡ có dính cặn, lặp lại bƣớc 5 và 6. 7. Thêm 1 ml ethanol tuyệt đối lạnh, trộn bằng cách lật úp ngửa tube nhiều lần. ADN sẽ tủa nhờ sự hiện diện của muối và ethanol. 8. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10-20 phút để làm lắng plasmid. Cần lƣu ý vị trí của tube khi ly tâm. 9. Đổ bỏ ethanol, tránh làm tróc cặn plasmid. 10. Thêm 100 µl ethanol 70% lành vào cặn ADN. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. 11. Đổ bỏ ethanol. Úp ngƣợc tube trên giấy thấm để thấm hết nƣớc. Để khô cắn trong không khí. 12. Hòa tan ADN plasmid trong 50 µl nƣớc cất 2 lần, ADN sẽ hòa tan ngay. Thêm 2 µl dung dịch RNase 10 mg/ml, ủ 37oC trong 30 phút. 13. Bảo quản ADN trong đá hay ở -20oC. Hình 8. Vị trí cắn ADN Nói chung hiệu suất của phƣơng pháp khoảng 2-5 µg ADN, tùy thuộc vào lƣợng plasmid của vi khuẩn. Các plasmid kích thƣớc lớn (>10 kb) thƣờng cho hiệu suất thấp hơn. Lƣợng ADN thu đƣợc đủ dùng cho nhiều thử nghiệm tiếp theo nhƣ cắt với enzyme cắt hạn chế, điện di trên gel agarose,… 23 Bài 4 CHIẾT TÁCH ADN BỘ GEN TỪ TẾ BÀO MÁ Ở NGƢỜI MỤC TIÊU HỌC TẬP Thực hiện thao tác tách chiết ADN bộ gen của tế bào niêm mạc má ở người 1. Vật liệu – hóa chất 1.1. Vật liệu sinh học: Tế bào má ở ngƣời 1.2. Hóa chất - Dung dịch NaCl 0,9% - Dung dịch phá màng tế bào (Tris-HCl 50 mM pH 8,0; EDTA 50 mM; SDS 1%; NaCl 10 mM) - Chloroform - Ethanol 100% - Ethanol 70% - Dung dịch TE (Tris 0,1 M – EDTA 0,001 M) - H2O cất (xử lý DEPC) 1.3. Dụng cụ thiết bị - Cốc nhựa nhỏ - Que cạo gỗ y tế - Tube hình nón 15 ml - Pipetman và tip các loại - Máy ly tâm - Máy vortex 2. Nguyên tắc Quy trình tách chiết ADN gồm 3 giai đoạn chính: - Phá vỡ màng tế bào và màng nhân - Loại protein - Tủa ADN Phá màng tế bào Nguyên tắc: Màng tế bào có thể đƣợc phá vỡ bởi các tác nhân lý-hóa học - Tác nhân vật lý: lực cơ học, sóng siêu âm - Tác nhân hóa học: gồm những chất tẩy nhẹ nhƣ Triton X100, chất tẩy ion nhƣ SDS có khả năng làm xáo trộn cấu trúc của màng tế bào. Riêng tế bào thực vật có vách cellulose nên có thể phá vỡ bằng nitrogen lỏng. 24 Loại protein Để thu nhận ADN tinh sạch, ngƣời ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (protein/ADN, ARN) trong hai pha không hòa tan. Một số tác nhân biến tính protein thông dụng: - Phenol pH 8,0: làm biến tính protein mạnh không hòa tan các nucleic acid. - Chloroform: làm biến tính protein yếu hơn phenol, thƣờng dùng kèm với phenol, có tác dụng bổ sung và loại bỏ hoàn toàn dấu vết của phenol. Tủa ADN Sau khi tách chiết, ADN tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn. Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận ADN dƣới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hòa lại trong nƣớc theo nồng độ mong muốn. Có hai kiểu tủa chính: - Tủa bằng ethanol: thực hiện ở nồng độ muối cao, nồng độ ethanol cao (2-2,5 thể tích ethanol/thể tích dung dịch cần tủa). Nhiệt độ thấp thúc đẩy sự tủa. - Tủa bằng isopropanol: cần nồng độ muối thấp, có thể sử dụng 0,8-1 thể tích isopropanol/thể tích dung dịch cần tủa. 3. Phƣơng pháp tiến hành 1. Chuẩn bị cốc đựng nƣớc muối NaCl 0,9%. Súc miệng thật sạch với nƣớc muối vài lần. 2. Dùng que cạo gỗ nạo mặt trong của má (phần niêm mạc) vài lần. Hòa mẫu vào cốc chứa 10 ml nƣớc cất, sau đó chuyển hết vào tube 15 ml. Đánh dấu tên lên tube. 3. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút. 4. Đổ bỏ phần dịch nổi vào cốc. Lƣu ý thao tác hút bỏ nhẹ nhàng không làm phần cặn lắng ở đáy tube bong ra. 5. Hòa cặn tế bào trong 1 ml dung dịch phá màng tế bào. Chuyển 0,9 ml dịch ly giải tế bào vào eppendorf 2ml và đảo ống trong 2 phút. 6. Thêm 0,9 ml chloroform và trộn đều bằng cách đảo ống trong 2 phút. 7. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Thu phần dịch nổi chuyển sang 1 eppendorf 2ml sạch mới. 8. Lặp lại bƣớc 6 và 7. 9. Cẩn thận thu dịch nổi chứa ADN (V≤ 0,5 ml) sang một eppendorf 1,5 ml. 10. Thêm 2V ethanol lạnh, tuyệt đối so với V mẫu. Đảo trộn đều ống trong 1 phút. 11. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Nhẹ nhàng loại bỏ dịch nổi. Lƣu ý không chạm vào cặn ADN ở đáy ống. 12. Thêm vào 1ml ethanol 70%. 13. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Nhẹ nhàng loại bỏ dịch nổi. 14. Để khô ít nhất 5 phút và hòa cặn trong 50 μl TE 1X. 25 Bài 5 CHIẾT TÁCH ADN TỪ MÔ THỰC VẬT MỤC TIÊU HỌC TẬP Tìm hiểu và thực hiện ly trích ADN từ mô thực vật Chiết tách ADN bộ gen từ các mô thực vật có vấn đề khó khăn duy nhất là phải phá vách tế bào rất cứng (khắc phục bằng phƣơng pháp nghiền mô đã đƣợc đông lạnh trong nitơ lỏng) và phải loại bỏ các polysaccarid (bằng cách chiết xuất với dung môi). Có rất nhiều cách thức có thể áp dụng để phân lập ADN thực vật. Bài này giới thiệu phƣơng pháp MITSUI (còn gọi là miniprep vì chỉ cần dùng lƣợng mô rất nhỏ) và phƣơng pháp CTAB. Ghi chú: phenol và chloroform đều có tính rất độc. Cần mang bao tay và tránh hít hơi bay ra. Phenol dễ cháy và làm phỏng da tay. Cần giữ lại tất cả những dụng cụ có dính phenol và vứt bỏ an toàn. 1. Phƣơng pháp MITSUI 1.1. Nguyên vật liệu - Dung dịch chiết (0,3M NaCl; 50mM Tris.HCl pH 7,5; 2% Sarkosyl; 0,5% SDS; 5M urea; 5% Phenol xử lý với Tris buffer) - TE01 (10 mM Tris.HCl pH 8,0; 0,1 mM EDTA pH 8,0) - Phenol: chloroform 25:24 - Isopropanol - Ethanol 70% - RNAse 10 mg/ml - Nitơ lỏng - Củ hành tây, nitơ lỏng 1.2. Tiến hành - Làm lạnh cối chày với nitơ lỏng (-196oC). Cho hành vào nghiền mịn và chuyển ngay vào eppendorf 2 ml với lƣợng khoảng phân nửa tube. - Thêm ngay 500 µl dung dịch chiết vào tube và trộn. - Thêm 500 µl phenol/ chloroform và lắc rung khoảng 20 giây. - Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong 5 phút. Giai đoạn này sẽ loại bỏ hầu hết các protein, glucid không dùng đến và những mảnh vỡ của tế bào. - Rút 400 µl phần dung dịch phía trên cho vào những tube đánh dấu. - Thêm 300 µl isopropanol và trộn đều. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong 10 phút. - Gạn bỏ phần isopropanol và rửa cặn lắng bằng cách thêm 500 µl ethanol 70%. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong 5 phút. 26 - Gạn bỏ hết ethanol 70% rối úp ngƣợc tube lên giấy thấm để loại bỏ hết ethanol. - Hong khô cặn lắng rối hòa tan trong 25 µl TE. Thêm 2 µl dung dịch RNAse 10 mg/ml, ủ ở 37oC trong 30 phút. (Thông thƣờng thì 1 µl DNA này đủ để thực hiện PCR). Có thể giữ DNA thu đƣợc ở 4oC trong thời gian ngắn hay ở -20oC trong thời gian dài. 2. Phƣơng pháp CTAB 2.1. Nguyên vật liệu - Dung dịch CTAB chiết (2% CTAB; 100 mM Tris.HCl pH 8; 20 mM EDTA pH 8; 1,4 M NaCl) - Dung dịch CTAB kết tủa (1% CTAB; 50 mM Tris.HCl pH 8; 10 mM EDTA pH 8) - 2- mercaptoethanol (2-ME) sẽ pha thêm vào dung dịch CTAB chiết. - Dung dịch đệm TE nồng độ muối cao (10 mM Tris.HCl pH 8; 0,1 mM EDTA pH 8; 1 M NaCl) - Chloroform / isoamyl alcol 24:1 (v/v) - Ethanol 80% 2.2. Thực hành Chiết acid nucleic 1. Pha dung dịch chiết CTAB chứa 2-ME 2% (v/v). Ủ dung dịch này và dung dịch CTAB/NaCl trong nồi cách thủy 65oC trong 15 phút. 2. Cân 100 mg mô thực vật, cắt nhỏ. 3. Làm lạnh cối chày với nitơ lỏng (-196oC). Cho hành vào nghiền mịn và chuyển vào eppendorf 2 ml. 4. Thêm 1000 µl dung dịch 2-ME/CTAB chiết đã đƣợc làm ấm vào, vortex kỹ. Ủ ở 65oC trong 60 phút, thỉnh thoảng trộn đều. 5. Thêm 1000 µl Chloroform/isoamyl alcol (24:1) vào. Trộn kỹ nhẹ nhàng bằng cách lật úp ngửa tube. Ly tâm 10000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút. Hút pha nƣớc (lớp trên) vào eppendorf mới. Kết tủa acid nucleic 6. Thêm 2 ml dung dịch CTAB kết tủa vào eppendorf chứa lớp nƣớc ở bƣớc 5. Trộn đều bằng cách úp ngửa eppendorf. Nếu kết tủa xuất hiện thì ủ tiếp ở 65oC trong 30 phút để tủa hoàn toàn DNA. Nếu chƣa có tủa xuất hiện thì thêm 1/10 thể tích dung dịch CTAB kết tủa vào và ủ ở 37oC trong 60 phút. 7. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút ở 4oC trong 30 phút. 8. Lấy cắn, chuyển phần nƣớc nổi vào một eppendorf mới. Hòa cắn với 350 µl dung dịch đệm TE nồng độ muối cao. Nếu cắn khó tan, ủ 65oC trong 30 phút. Lặp lại cho đến khi tủa tan hoàn toàn hay tan gần hết. Phần dịch nổi đem đo độ hấp thu ở bƣớc song 260nm để phát hiện còn sót acid nucleic hay không. Nếu còn thì ủ tiếp ở 65oC trong 30 phút, ly tâm thu cắn. 27 9. Cho 0,6 thể tích isopropanol vào eppendorf. Trộn đều, ủ -20oC trong 1 giờ. Ly tâm 13000 vòng/phút ở (4oC) trong 30 phút. Cần thận hút bỏ dung dịch. Rửa tủa với 100 µl ethanol 80%, ly tâm bỏ phần cồn, làm khô và hòa tan tủa trong 20 µl TE. (Nộp sản phẩm giữ ở -20oC, thao tác tiếp trong bài sau). 28 Bài 6 KỸ THUẬT CẮT GIỚI HẠN ADN MỤC TIÊU HỌC TẬP Phân tích mẫu ADN 1. Vật liệu – hóa chất 1.1. Vật liệu sinh học - ADN plasmid pBluescript II SK(+) - Các enzyme cắt giới hạn: EcoRI, HindIII, BamHI 1.2. Hóa chất - Dung dịch nạp mẫu 6X - Dung dịch đệm 10X - Gel agarose 1% - Dung dịch điện di TAE 1X - Ethidium bromide (10 mg/ml) 1.3. Dụng cụ - Thiết bị - Các pipetman và tip - Eppendorf 0,5 ml - Bể ổn nhiệt - Bộ điện di và nguồn - Bàn đèn UV 2. Các enzyme cắt giới hạn Định nghĩa: Enzyme cắt giới hạn là những endonuclease có khả năng thủy giải ADN sợi đôi một cách xác định và lặp lại. Phân loại: gồm 3 nhóm lớn, hầu hết các enzyme cắt giới hạn trong sinh học phân tử đều thuộc nhóm II. Các enzyme nhóm này có khả năng nhận biết một trình tự nucleotide xác định và thủy giải ADN tại trình tự nhận biết đó. Các trình tự nhận biết thƣờng có độ dài 4-8 nucleotide và có dạng palindrome (những đoạn ADN mạch đôi có trình tự trên 2 mạch đơn giống hệt nhau khi đọc theo cùng một chiều). Khi thủy giải ADN, tùy loại enzyme có thể tạo ra đầu bằng hay đầu dính (so le). Công dụng: Các enzyme cắt giới hạn thủy giải một đoạn ADN dài thành những đoạn ADN ngắn hơn, có kích thƣớc phù hợp để tạo dòng. Các enzyme này còn đƣợc sử dụng để lập bản đồ cắt giới hạn của một trình tự ADN. EcoRI: ly trích từ vi khuẩn E. coli RY13, có trình tự nhận biết G↓AATTC BamHI: ly trích từ vi khuẩn Bacillus amloliquefaciens H, có trình tự nhận biết G↓GATCC HindIII: ly trích từ vi khuẩn Haemophilus influenza Rd, có trình tự nhận biết A↓AGCTT 29 3. Phƣơng pháp tiến hành 3.1. Thủy giải ADN plasmid bằng một số enzyme cắt giới hạn Trong ống eppendorf 0,5 ml, thiết lập phản ứng cắt với các thành phần sau: - ADN plasmid 4 μl - Dung dịch đệm 10X 2 μl - Nƣớc cất khử trùng 13 μl - Enzyme 1 μl Ủ phản ứng ở 37oC trong 2 giờ. Dừng phản ứng: bổ sung 4 l dung dịch nạp mẫu 6X. 3.2. Điện di Chuẩn bị dung dịch điện di, đổ gel agarose 1%. Điện di ở 80 V trong 30 phút. Xem kết quả dƣới bàn đèn UV. Ghi nhận kết quả. Hình 9. Sơ đồ plasmid Bluescript 30 Bài 7 PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE MỤC TIÊU HỌC TẬP Xác định sản phẩm ADN đã tách chiết 1. Nguyên vật liệu - ADN cần phân tích (ADN plasmid pBluescript và sản phẩm ADN cắt giới hạn). - Đệm TAE 1X pha từ TAE 50X trƣớc khi dùng. - Agarose tinh khiết dùng cho điện di. - Ethidium bromide 5 mg/ml. Rất độc, gây ung thƣ. Phải mang găng tay khi thao tác và pha chế trong tủ hút khí. EtBr nằm xen giữa sợi đôi ADN (không hồi phục, do đó có tính chất làm bất hoạt ADN nên có thể gây ung thƣ), sự phát huỳnh quang của EtBr giúp xác định vị trí băng ADN. - Đệm thử 10X (chứa glycerol nhằm làm tăng tỷ trọng giúp ADN lọt vào giếng dễ dàng và bromophenol blue để đánh dấu đỉnh di chuyển). - Thang chuẩn ADN 1 Kb (hỗn hợp các ADN có kích thƣớc biết trƣớc), chạy điện di song song với ADN khảo sát để đối chiếu kích thƣớc ADN). - Máy điện di nằm ngang, khuôn đổ gel, lƣợc (hình 9). - Gel box có đèn cực tím, máy chụp hình. Chiều di chuyển của ADN Đệm Gel Các band ADN đƣợc tách ra Giếng chứa ADN cần phân tích Hình 10. Sơ đồ máng điện di nằm ngang 2. Tiến hành 1. Pha thạch agarose 1% bằng cách trộn 1 g agarose trong 100 ml TAE 1X. Đun cho thạch tan trong lò vi ba, thỉnh thoảng lắc đều để đảm bảo thạch tan hết. Không để dung dịch agarose sôi trào ra ngoài. 2. Để thạch nguội (cầm bình thạch trong tay mà không bị phỏng), thêm 5 l ethium bromid . Phải đeo gang tay. 3. Chuẩn bị khuôn bằng cách dán băng keo giấy ở 2 đầu hoặc gài thanh chặn. Đổ thạch vào khuôn rồi đặt lƣợc. Để cho nguội và thạch đặc hoàn toàn. 4. Gỡ lƣợc, băng keo và thanh chặn. Đặt khuôn vào máng điện di. Đổ TAE 1X cho ngập thạch. Cần lưu ý là ADN tích điện âm cho nên sẽ di chuyển về phía cực dương. Do vậy đặt bản thạch vào máng sao cho các giếng nằm về phía cực âm. 31 5. Chuẩn bị mẫu: pha 9 l mẫu ADN với 1 l đệm tải. 6. Dùng micropipet cho mẫu vào các giếng theo thứ tự. Lƣu ý không để mẫu rơi ra ngoài giếng. Nên lót một nền đen bên dƣới máng để nhìn thấy giếng dễ dàng hơn. Kèm theo mẫu nên chạy song song trong một giếng riêng một ADN chuẩn biết trƣớc kích thƣớc để xác định kết quả sau khi chạy (marker). Hình 11. Các băng ADN phát sáng Phải ghi lại thứ tự các mẫu trên bản dƣới tia UV khi nhuộm bằng EtBr thạch (vẽ sơ đồ). 7. Chạy điện di ở điện thế không đổi 100 V trong 45 phút. 8. Nhấc khuôn ra khỏi máng và đẩy gel lên UV box (phải đeo găng). Xem xét các băng ADN dƣới đèn cực tím. Có thể chụp ảnh lại bằng máy polaroid có kính lọc. 9. Căn cứ vào marker và sơ đồ các mẫu để xác định vị trí của băng cần thiết. Bảng tƣơng quan giữa nồng độ gel và kích thƣớc các đoạn cần phân tách % Acrylamide 4 5 8 11 % Agarose 0,6 – 0,8 0,9 – 1,2 1,2 – 1,5 Kích thƣớc các đoạn cần phân tách (cặp nucleotid) 200 - 800 80 - 200 40 - 100 10 - 50 Kích thƣớc các đoạn cần phân tách (kb) 1 - 20 0,5 - 7 0,2 - 5 32 Bài 8 PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ADN BẰNG ĐO MẬT ĐỘ QUANG MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Định lượng ADN trong các sản phẩm thu được 2. Đánh giá độ tinh khiết của ADN 1. Nguyên tắc Các acid nucleic có đỉnh hấp thu ánh sáng là 260 nm trong vùng tử ngoại. Sự hấp thu này là do sự tƣơng tác giữa các photon với các electron của vòng purin và pyrimidin. Một đơn vị OD (optical density) tƣơng ứng với 50 µg/ml ADN sợi đôi / 40 µg/ml ADN sợi đơn / khoảng 20 µg/ml oligonucleotid sợi đơn. Từ số đơn vị OD đo đƣợc, có thể suy ra nồng độ acid nucleic trong dung dịch. Ngoài ra, tính tỉ lệ OD260/OD280 có thể giúp ƣớc lƣợng độ tinh khiết của dung dịch acid nucleic. Nếu tỉ lệ này trong khoảng 1,8-2,0 dung dịch acid nucleic đƣợc xem là sạch. Nếu nhiễm protein hay phenol, tỉ lệ này sẽ thấp hơn nhiều và khi đó việc định lƣợng acid nucleic bằng mật độ quang không còn chính xác. 2. Nguyên vật liệu - Dung dịch ADN cần định lƣợng (ADN plasmid pBluescript, động vật) - Nƣớc cất 2 lần (BDW) - Máy đo mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm, 280 nm và 230 nm 3. Tiến hành 1. Pha loãng 1/50 dung dịch ADN mẫu để có thể tích cuối là 2 ml. 2. Đo OD260 và OD280 của dung dịch ADN cần định lƣợng. Tính tỉ lệ OD260/OD280. Kết luận. 3. Riêng AND chiết từ thực vật, tiến hành đo thêm OD230 và tính tỉ lệ OD260/OD230. Kết luận. Mẫu OD260 OD280 OD230 OD260/OD280 SP bài 2 SP bài 3 SP bài 4 SP: sản phẩm 33 OD260/OD230 Nồng độ ADN (µg/ml) Bài 9 PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI ADN - PCR MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Biết được thành phần và các bước của một phản ứng PCR. 2. Tiến hành khuếch đại một đoạn ADN. 1. Nguyên tắc chung PCR là phƣơng pháp tổng hợp acid nucleic in vitro, cho phép khuếch đại đặc hiệu một đoạn ADN hoặc ARN. - Các thành phần của một phản ứng PCR + ADN khuôn mẫu (template): ADN chứa đoạn ADN cần khuếch đại (lƣợng ADN thƣờng dùng: 1 ng ADN plasmid hay 10 ng ADN nhiễm sắc thể hay 2 l huyền dịch của một khuẩn lạc/ 20 l LB). + ADN polymerase (1 UI). + Mồi oligonucleotid (primer) xuôi và ngƣợc có trình tự bổ sung với 2 đầu của chuỗi ADN cần khuếch đại (0,5 mM mỗi loại). + Deoxynucleotid triphosphat (dNTPs = dATP, dCTP, d GTP, dTTP với nồng độ 0,25 mM/ loại). + Dung dịch đệm phản ứng PCR (thƣờng cung cấp ở dạng dung dịch mẹ 10X). + Tùy theo loại ADN polymerase có thể phải cung cấp thêm MgCl2 với nồng độ khác nhau tùy theo phản ứng cụ thể. - Các bƣớc của một chu kỳ phản ứng PCR: 1. Biến tính ADN ở nhiệt độ 92 - 96C 2. Lai ghép primer đặc hiệu với ADN đích ở nhiệt độ 45 - 65C 3. Tổng hợp ADN dƣới xúc tác của ADN polymerase ở T = 72C Mỗi phản ứng PCR gồm khoảng 25 - 40 chu kỳ 2. Thực hành Khuếch đại đoạn gen quy định 16S rARN của Bacillus subtilis - Nguyên vật liệu: + ADN nhiễm sắc thể của B. subtilis (bài 2) + Dung dịch đệm PCR 10X (KCl 500 mM, Tris-Cl 100 mM pH = 8,8, DTT 30 mM, BSA 1mg/ml. Mua kèm theo Taq. Bảo quản ở -20C/ 3 tháng). + d NTPs 100 mM (25 mM mỗi loại), bảo quản ở -20C. + MgCl2 25 mM (mua kèm theo Taq). + Mồi: Mồi xuôi (P1) 50 mM (5’-GCGGCGTGCCTAATACATGC-3’) bắt cặp với ADN của 16S rARN ở vị trí 40 đến 59. Mồi ngƣợc (P2) 50 mM (5’CACCTTCCGATACGGCTACC-3’) bắt cặp với ADN của 16S r ARN ở vị trí 34 1532 đến 1513. Cặp mồi P1-P2 khi sử dụng sẽ khuếch đại đoạn ADN có kích thƣớc khoảng 1,4 kb. + Taq ADN polymerase, bảo quản ở -20C + Nƣớc khử ion tiệt trùng + Eppendorf 0,5 ml có thành mỏng chịu nhiệt + Máy luân nhiệt - Tiến hành + Cài đặt chƣơng trình TT cho máy luân nhiệt (Thermocycler) (cán bộ BM hƣớng dẫn) Chƣơng trình TT: 95C 5 phút 1 chu kỳ 95C 45 giây 55C 45 giây 30 chu kỳ 72C 2 phút 72C 5 phút 1 chu kỳ 4C 5 phút 1 chu kỳ Cho vào tube PCR: Thành phần Thể tích dH2O 36 l Đệm PCR 10X 5 l dNTPs 100 mM 0,5 l MgCl2 25 mM 5 l ADN nhiễm sắc thể B. subtilis 1 l Mồi xuôi P1 50 mM 1 l Mồi ngƣợc P2 50 mM 1 l Taq ADN polymerase (5 UI/ l) 0,5 l + Trộn đều nhẹ nhàng bằng cách dùng ngón tay khẩy nhẹ vào đáy tube vài lần. + Spin trên máy ly tâm để dồn các thành phần phản ứng xuống đáy tube. + Cho tube vào máy luân nhiệt và chọn chạy chƣơng trình TT. + Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp chạy điện di trên gel agarose (bài 7). 35 PHA CHẾ MỘT SỐ HÓA CHẤT DÙNG TRONG THỰC HÀNH - Acrylamide 30%: hòa tan 30 g acrylamide và 0,8 g bis-acrylamide trong nƣớc và dùng nƣớc chỉnh thể tích đến 100ml (mang khẩu trang và găng tay bảo hộ khi pha). Bảo quản trong chai tối, ở 4oC. - Ammonium persulfate (APS) 10%: hòa tan 1 g ammonium persulfate trong 10ml nƣớc tiệt trùng. Bảo quản ở -20oC. Khi dùng để 4oC trong 1-2 tuần. - Ampicillin 1000X (50 mg/ml): 500 mg ampicillin (sodium salt) trong 10 ml nƣớc, tiệt trùng bằng lọc, phân thành các liều nhỏ (250µl), bảo quản ở -20oC. Mỗi phần chỉ nên dùng vài lần rồi bỏ, không nên rã đông nhiều lần. - CaCl2 1M: 147 g CaCl2.2H2O, thêm nƣớc đến 1 lít, phân thành các phần nhỏ, hấp tiệt trùng. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Canh thang LB (LB Broth) (LB = Luria – bertani): là môi trƣờng thông dụng để nuôi cấy vi khuẩn Tryptone 10g Cao nấm men (Yeast extract) 5g NaCl 10g NaOH 1M vđ đến pH 7 0,7ml Nƣớc cất vđ 1000ml Hòa tan các thành phần trong 800 ml nƣớc, điều chỉnh pH, thêm nƣớc vừa đủ 1000ml, chia thành từng phần nhỏ rồi hấp tiệt trùng 121oC trong 15 phút. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. - CTAB/NaCl (CTAB 10% trong NaCl 0,7M): hòa tan 4,1 g NaCl trong 80 ml nƣớc đun (65oC) và khuấy nhẹ đồng thời thêm 10g CTAB (cetrimide hay hexadecyltrimethyl ammonium bromide) cho đến khi tan, thêm nƣớc đến 100 ml. - Dung dịch đệm của đoạn Klenow 10X: tris.HCl pH 7,5 100mM, NaCl 500 mM, EDTA pH 8 1mM, DTT (dithiothreitol) 50 mM. Bảo quản ở -20oC. - Dung dịch đệm nối 10X: 660 mM tris.HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 10 mM DTT; 10 mM ATP. Bảo quản ở -20oC trong các phần nhỏ (250 µl). Trộn kỹ trƣớc khi dùng. - Dung dịch GTE (Glucose-Tris-EDTA): Glucose 50 mM, Tris.HCl pH 8 25 mM, EDTA 10 mM. Tris base 3g Glucose (dextrose) 9g EDTA 3,72g Hòa tan trong 800 ml nƣớc điều chỉnh pH đến 8,8 bằng HCl. Thêm nƣớc đến 1000 ml, chia thành các phần nhỏ (100 ml) và hấp hay lọc tiệt trùng. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Dung dịch KOAc 5M, pH 4,8: Lấy 29,5 ml acid acetic băng (glacial acetic acid), thêm KOH đậm đặc để chỉnh pH đến 4,8, thêm nƣớc vừa đủ 100 ml. Không hấp tiệt trùng, bảo quản ở nhiệt độ phòng. 36 - Dung dịch SDS-kiềm: SDS 1%, NaOH 0,2M. Pha ngay trƣớc khi dùng từ SDS 10% (kl/tt) và NaOH 1M: trong 5 ml nƣớc thêm 2 ml NaOH 1M rồi thêm 1ml SDS 10% trộn đều, thêm nƣớc vừa đủ 10ml. - Đệm ly giải Bacillus: 50 mM EDTA, 0,1M NaCl, pH 7,5 EDTA 18,6g NaCl 5,84g H2 O 1000ml Hòa tan EDTA và NaCl trong 800 ml nƣớc chỉnh pH 7,5 với NaOH. Thêm nƣớc đến 1000 ml chia thành các phần nhỏ (100ml) và tiệt trùng 121oC/ 15 phút. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Đệm TAE 50X: Tris base 242 g; acid acetic băng 55,1 ml; Na2EDTA 37,2g; nƣớc cất vừa đủ 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Đệm tải 10X (loading buffer) hay thuốc nhuộm tải (loading dye): glycerol 50% trong TE 1X, có 0,015% bromophenol blue. Hay phối hợp 5 ml glycerol, 1ml TAE 10X, 1 ml bromophenol blue 10%, 1 ml xylem cyanol và 2 ml nƣớc, trộn và bảo quản ở -20oC trong từng phần nhỏ. - EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid) 0,5M pH 8: hòa tan 186,1 g Na2EDTA trong 700ml nƣớc, điều chỉnh pH đến 8,0 bằng NaOH 10N (khoảng 50ml), thêm nƣớc vừa đủ 1000ml. - Ethidium bromide 1000X (5 mg/ml): 0,1 g ethium bromide trong 20 ml nƣớc cất. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong lọ bọc giấy nhôm để tránh ánh sáng. Rất độc, gây ung thƣ. Phải mang găng tay khi thao tác và pha chế trong tủ hút khí. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. - IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactoside): pha thành dung dịch mẹ 1M hay 100mM trong nƣớc. Lọc tiệt trùng và chia thành các phần nhỏ (250µl), bảo quản ở -20oC. Nồng độ sử dụng ở độ pha loãng cuối cùng 0,1mM – 1mM. Để trãi trên đĩa thạch dùng 40 µl IPTG 100mM/ hộp. - Lyzozyme: 20 mg/ml trong nƣớc hay đệm ly giải Bacillus. Lọc tiệt trùng và chia thành các phần nhỏ (250µl) bảo quản ở -20oC. - Natri acetate 3M: hòa tan 40,81g natri acetate.3H2O trong 70 ml H2O. Điều chỉnh pH đến 5,2 bằng acid acetic băng (glacial). Thêm nƣớc đến 100 ml hấp tiệt trùng. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Proteinase K 20 mg/ml: pha dung dịch mẹ 20 mg/ml trong dung dịch gồm Tris-Cl pH 7,5 10 mM và NaCl 10 mM. - Phenol/ chloroform/ isoamyl alcol: 25/24/1. Pha từ phenol đệm và chloroform/ isoamyl alcol. + Phenol đệm (buffering phenol):  Nguyên liệu: * 8-hydroxyquinolin * Phenol tinh khiết * Tris-base 50 mM (không chỉnh pH) * Tris-Cl 50 mM, pH 8,0 37  Chú ý: phenol là hóa chất độc, ăn mòn, gây bỏng do đó phải mang găng tay khi thao tác. Thao tác trong hốt (Hood) hay nơi thông khí. Không đổ phenol thừa vào cống.  Cách pha: * Đun khoảng 100 g phenol (tinh khiết, mới) trên bếp cách thủy 65C cho chảy. Rót thận trọng phenol đã chảy vào becher 250 ml có chứa sẵn 100 mg 8-hydroxyquinoline, thêm 100 ml Tris-base 50 mM ( không chỉnh pH). * Đậy bằng giấy nhôm, khuấy nhẹ nhàng trên máy khuấy từ khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng. Để yên cho phân lớp. Loại bỏ pha trên (pha nƣớc, lƣu ý pha hữu cơ chứa phenol có màu vàng) càng nhiều càng tốt. * Thêm 500 ml Tris-Cl 50 mM, pH 8 và lặp lại bƣớc trên đến khi pha dƣới (pha phenol ) đạt đến pH 8 (đo bằng giấy). * Thêm 100 ml Tris-Cl 50 mM , pH 8 hoặc đệm TE. * Bảo quản ở 4C đƣợc 2 tháng trong chai nâu hay chai bọc giấy nhôm. * Sử dụng: Trộn (hút pha dƣới) với cloroform tỷ lệ 25/25 hay với cloroform- iso- amyl alcol tỷ lệ 25/24/1. + Cloroform – Iso amyl alcol tỷ lệ 24/1. Pha sẵn, bảo quản mát. Khi sử dụng trộn với Phenol đệm, tỷ lệ 1/1. - RNAse 10 mg/ml: Hòa tan 10 mg/ ml RNAse trong TE hoặc GTE, đun sôi 10 phút để diệt DNAse. Chia thành các phần nhỏ và bảo quản ở - 20C. Lƣợng sử dụng cho chiết tách plasmid là 50 l RNAse / ml GTE. - Sarcosyl 20 % (kl/tt): Sarcosyl là 1 chất tẩy, tên hóa học là N-laurylsarcosine, đôi khi đƣợc gọi là sarkosyl. Hòa tan 20 g N-laurylsarcosine trong 80 ml dH2O. Có thể phải gia nhiệt để giúp hòa tan. Thêm nƣớc đến 100 ml và hấp tiệt trùng. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Dung dịch có màu vàng nhạt. - SDS 10 % (kl/tt): cân 10 g SDS, phân tán đều (tránh vón cục) trong 80 ml dH2O, đặt vào tủ sấy 60 – 70C, thỉnh thoảng khuấy đảo (tránh khuấy trộn mạnh gây bọt) cho đến khi tan hoàn toàn (30 phút – 1 giờ), thêm nƣớc đủ 100 ml. Hoặc sau khi phân tán đều cho ngay vào lò viba ở chế độ medium trong 12 phút, kiểm tra tránh để sôi trào, cho đến khi tan hết, thêm nƣớc đến 100 ml. - TE (100 mM Tris- HCl pH 8, 1 mM EDTA) + Tris base 1,21 g + EDTA 372 mg Hòa tan Tris base và EDTA trong 800 ml dH2O. Điều chỉnh pH 8,0 bằng HCl. Thêm nƣớc đến 1000 ml, chia thành các phần nhỏ (100 ml) và tiệt trùng 121C/ 15 phút. Bảo quản ở nhiệt độ phòng, có thể pha thành dung dịch mẹ 10X, pha loãng và tiệt trùng lại khi sử dụng. - TE 0,1 (10 mM Tris-Cl, pH 7,4 và 0,1 mM EDTA): Phối hợp 0,5 ml Tris-Cl 2M, pH 7,4 và 20 l EDTA 0,5 M , pH 8, thêm 99,48 ml nƣớc. Tiệt trùng bằng lò hấp, bảo quản ở nhiệt độ phòng. 38 - Thạch LB (LB agar): có công thức và cách pha nhƣ Canh thang LB nhƣng đƣợc thêm 15 g thạch / lit. Sau khi tiệt trùng, để nguội đến 50C, thêm kháng sinh nếu cần thiết và đổ hộp petri. Để môi trƣờng đặc lại trong hộp, sấy khô bề mặt trong tủ ấm 37C hay trong laminar (với nắp hộp để mở). Đóng gói và bảo quản ở 4C. - Tris-HCl: Cân Tris-base ở nồng độ cần dùng, hòa tan trong 80 % lƣợng nƣớc, dùng HCl chỉnh đến pH mong muốn, thêm nƣớc vừa đủ. Lƣu ý: Đệm Tris nói chung có pH phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, do đó nên điều chỉnh pH tại nhiệt độ định sử dụng. - X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside): 20 mg/ml dimetylformamid (DMF) bảo quản ở -20C trong chai nâu. Độc!. Để trải trên đĩa thạch dùng 40 l/hộp. Để trộn trong môi trƣờng dùng 2 ml/ lít môi trƣờng, nhƣng hạn chế vì rất đắt tiền. 39 TRƢỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG Khoa Dƣợc HHHHHÔHỒNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc ĐƠN XIN PHÉP (v/v nghỉ học thực hành và đăng ký học bù) Kính gửi: Bộ môn ……………………………….. Em tên là:………………………………………. MSSV:…………………………. Hiện đang là sinh viên lớp………….…, nhóm thực tập…………………………. Nay em viết đơn này kính xin Thầy/Cô Bộ môn cho phép em đƣợc nghỉ thực tập vào buổi học……………., ngày…………………… Vì lý do: ........................... ……………………………………………………………………………………..... ……………………………………………………………………………………… Em xin phép đƣợc đăng ký thực hành bù vào buổi…………. ngày……………………. Em xin chân thành cảm ơn. Giảng viên bộ môn Biên Hòa, ngày … tháng … năm 2014 Kính đơn 40 [...]... TÁCH ADN TỪ MÔ THỰC VẬT MỤC TIÊU HỌC TẬP Tìm hiểu và thực hiện ly trích ADN từ mô thực vật Chiết tách ADN bộ gen từ các mô thực vật có vấn đề khó khăn duy nhất là phải phá vách tế bào rất cứng (khắc phục bằng phƣơng pháp nghiền mô đã đƣợc đông lạnh trong nitơ lỏng) và phải loại bỏ các polysaccarid (bằng cách chiết xuất với dung môi) Có rất nhiều cách thức có thể áp dụng để phân lập ADN thực vật Bài này... (anaphase) và kỳ cuối (telophase) BÁO CÁO THỰC HÀNH 1 Hình vẽ hiện tƣợng co nguyên sinh và phản co nguyên sinh 2 Đánh giá kết quả của thí nghiệm trên các miếng Dền đỏ bằng các dấu + để chỉ mức độ màu của dung dịch Giải thích kết quả 3 Hình vẽ các kỳ của phân bào nguyên nhiễm và gian kỳ ở tế bào mô phân sinh rễ Hành ta Các hình vẽ phải có chú thích đầy đủ 11 PHẦN B SINH HỌC PHÂN TỬ Biên soạn: TS Lê Nguyễn... lặp lại Phân loại: gồm 3 nhóm lớn, hầu hết các enzyme cắt giới hạn trong sinh học phân tử đều thuộc nhóm II Các enzyme nhóm này có khả năng nhận biết một trình tự nucleotide xác định và thủy giải ADN tại trình tự nhận biết đó Các trình tự nhận biết thƣờng có độ dài 4-8 nucleotide và có dạng palindrome (những đoạn ADN mạch đôi có trình tự trên 2 mạch đơn giống hệt nhau khi đọc theo cùng một chiều) Khi... TRÙNG MỤC TIÊU HỌC TẬP 1 Hiểu biết về các quy tắc đảm bảo an toàn trong phòng thí nghiệm và khi làm việc 2 Nắm vững và vận dụng các phương pháp khử trùng khi làm thí nghiệm sinh học 1 An toàn phòng thí nghiệm cơ bản 1.1 Bảo hộ cá nhân - Phải mặc áo choàng, áo khoác hoặc đồng phục phòng thí nghiệm (PTN) trong suốt thời gian làm việc trong PTN - Phải đeo găng tay trong tất cả các quá trình tiếp xúc trực... những gì cần thiết cho công việc - Vào cuối buổi thực hành, mặt bàn ghế phải đƣợc làm sạch và khử nhiễm sau khi làm đổ các vật liệu nguy hiểm - Tất cả các vật liệu, vật phẩm và môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật phải đƣợc khử trùng trƣớc khi thải bỏ 1.3 Ngƣời làm việc Nhằm rèn luyện kỹ năng PTN và nâng cao tính chủ động trong nghiên cứu, sinh viên khi làm thực tập cần lƣu ý một số điểm sau: - Chủ động trong... thử nghiệm tiếp theo nhƣ cắt với enzyme cắt hạn chế, điện di trên gel agarose,… 23 Bài 4 CHIẾT TÁCH ADN BỘ GEN TỪ TẾ BÀO MÁ Ở NGƢỜI MỤC TIÊU HỌC TẬP Thực hiện thao tác tách chiết ADN bộ gen của tế bào niêm mạc má ở người 1 Vật liệu – hóa chất 1.1 Vật liệu sinh học: Tế bào má ở ngƣời 1.2 Hóa chất - Dung dịch NaCl 0,9% - Dung dịch phá màng tế bào (Tris-HCl 50 mM pH 8,0; EDTA 50 mM; SDS 1%; NaCl 10 mM)... Nguyên tắc Quy trình tách chiết ADN gồm 3 giai đoạn chính: - Phá vỡ màng tế bào và màng nhân - Loại protein - Tủa ADN Phá màng tế bào Nguyên tắc: Màng tế bào có thể đƣợc phá vỡ bởi các tác nhân lý-hóa học - Tác nhân vật lý: lực cơ học, sóng siêu âm - Tác nhân hóa học: gồm những chất tẩy nhẹ nhƣ Triton X100, chất tẩy ion nhƣ SDS có khả năng làm xáo trộn cấu trúc của màng tế bào Riêng tế bào thực vật có... tế bào có thể bị chết, khi đó không thể thực hiện đƣợc giai đoạn tiếp 1.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và dung môi hữu cơ lên tính thấm của màng sinh chất Màng sinh chất là màng lipo-protein, các phức hợp này có thể bị tổn thƣơng do nhiệt độ hay hóa chất, làm phá vỡ cấu trúc chuyên biệt và làm cho màng mất khả năng kiểm soát hoạt động sinh lý bình thƣờng Khi màng sinh chất bị tổn thƣơng, 10 nó không còn...Bài 2 MỘT SỐ BÀO QUAN, CHẤT DỰ TRỮ VÀ CHẤT CẶN BÃ CỦA TẾ BÀO THỰC VẬT MỤC TIÊU HỌC TẬP 1 Quan sát và vẽ đúng một số bào quan của tế bào thực vật 2 Quan sát và vẽ đúng các dạng chất dự trữ và chất cặn bã ở tế bào thực vật Vật liệu: Quả Ớt chín, lá Lẻ bạn, lá Rong đuôi chồn, tinh bột Khoai tây, củ Thƣợc dƣợc, hạt Thầu dầu, cuống lá Trầu... Định nghĩa Một vật phẩm đƣợc xem là vô trùng khi không còn mang một mầm sinh vật nào nữa Thông thƣờng sự khử trùng đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp vật lý hay hóa học 3.2 Khử trùng bằng phƣơng pháp vật lý Có thể dùng: nhiệt, lọc, bức xạ, âm ba và siêu âm A Khử trùng bằng nhiệt Đối với tác nhân nhiệt, các tế bào dinh dƣỡng của vi sinh vật có thể bị giết dễ dàng 1) Nhiệt khô (lò Pasteur hay tủ sấy) Khử ... buổi thực tập (thực tập bù tuần) Khi thực tập bù, sinh viên phải trình đơn có chữ ký xác nhận cho giảng viên Thực tập bù qui định Sinh viên phải đọc thực tập trƣớc đến phòng thực tập Trong thực tập, ... PHÒNG THỰC TẬP Sinh viên phải thực đầy đủ thực tập theo chƣơng trình môn học Sinh viên vắng buổi thực tập không đƣợc thi hết môn Sinh viên phải đến phòng thực tập qui định Trong thực hành, sinh. .. phòng thực tập phải xin phép giảng viên Giờ thực tập: - Sáng: 7h30-11h15 - Chiều: 12h50-16h35 - Tối: 17h00-20h45 Sinh viên muốn nghỉ thực tập phải làm đơn xin phép nghỉ ghi rõ ngày thực tập bù