1. Chuẩn bị cốc đựng nƣớc muối NaCl 0,9%. Súc miệng thật sạch với nƣớc muối vài lần.
2. Dùng que cạo gỗ nạo mặt trong của má (phần niêm mạc) vài lần. Hòa mẫu vào cốc chứa 10 ml nƣớc cất, sau đó chuyển hết vào tube 15 ml. Đánh dấu tên lên tube.
3. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút.
4. Đổ bỏ phần dịch nổi vào cốc. Lƣu ý thao tác hút bỏ nhẹ nhàng không làm phần cặn lắng ở đáy tube bong ra.
5. Hòa cặn tế bào trong 1 ml dung dịch phá màng tế bào. Chuyển 0,9 ml dịch ly giải tế bào vào eppendorf 2ml và đảo ống trong 2 phút.
6. Thêm 0,9 ml chloroform và trộn đều bằng cách đảo ống trong 2 phút.
7. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Thu phần dịch nổi chuyển sang 1 eppendorf 2ml sạch mới.
8. Lặp lại bƣớc 6 và 7.
9. Cẩn thận thu dịch nổi chứa ADN (V≤ 0,5 ml) sang một eppendorf 1,5 ml. 10.Thêm 2V ethanol lạnh, tuyệt đối so với V mẫu. Đảo trộn đều ống trong 1 phút. 11.Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Nhẹ nhàng loại bỏ dịch nổi. Lƣu ý
không chạm vào cặn ADN ở đáy ống. 12.Thêm vào 1ml ethanol 70%.
13.Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Nhẹ nhàng loại bỏ dịch nổi. 14.Để khô ít nhất 5 phút và hòa cặn trong 50 μl TE 1X.
26
Bài 5
CHIẾT TÁCH ADN TỪ MÔ THỰC VẬT MỤC TIÊU HỌC TẬP
Tìm hiểu và thực hiện ly trích ADN từ mô thực vật
Chiết tách ADN bộ gen từ các mô thực vật có vấn đề khó khăn duy nhất là phải phá vách tế bào rất cứng (khắc phục bằng phƣơng pháp nghiền mô đã đƣợc đông lạnh trong nitơ lỏng) và phải loại bỏ các polysaccarid (bằng cách chiết xuất với dung môi). Có rất nhiều cách thức có thể áp dụng để phân lập ADN thực vật. Bài này giới thiệu phƣơng pháp MITSUI (còn gọi là miniprep vì chỉ cần dùng lƣợng mô rất nhỏ) và phƣơng pháp CTAB.
Ghi chú: phenol và chloroform đều có tính rất độc. Cần mang bao tay và tránh hít hơi bay ra. Phenol dễ cháy và làm phỏng da tay. Cần giữ lại tất cả những dụng cụ có dính phenol và vứt bỏ an toàn.