Chiết tách plasmid cũng dùng một nguyên tắc chung giống nhƣ chiết tách ADN bộ gen, tuy nhiên sự khác biệt quan trọng là phải tách ADN plasmid ra khỏi ADN nhiễm sắc thể.
Tách ADN plasmid khỏi ADN nhiễm sắc thể có thể dựa vào sự khác biệt về kích thƣớc hay cấu dạng. Plasmid lớn nhất cũng chỉ bằng 8% kích thƣớc của nhiễm sắc thể E. coli. Tuy cả plasmid và nhiễm sắc thể đều có dạng vòng nhƣng trong quá trình phá vỡ tế bào và dƣới tác dụng SDS-kiềm và KOAc, ADN nhiễm sắc thể sẽ bị tách thành dạng thẳng, không hồi phục đƣợc cấu trúc ban đầu, còn ADN plasmid do kích thƣớc nhỏ hơn nên hồi phục đƣợc và trở lại dạng vòng.
2. Nguyên vật liệu
- Chủng E. coli mang plasmid pBluescript II - Canh thang LB chứa ampicillin 50 µg/ml - Dung dịch GTE
- Dung dịch SDS-kiềm: SDS 1%, NaOH 0,2 M. Pha dùng trong ngày. - Dung dịch KOAc 5M, pH 4,8
- RNAse 10 mg/ml
- Ethanol tuyệt đối, ethanol 70%
3. Thực hành
Ngày 1:
- Chuẩn bị ống chứa 5 ml môi trƣờng LB chứa ampicillin 50 µg/ml
- Cấy 1 khẩn lạc riêng rẻ E. coli mang pBluescript vào ống môi trƣờng và lắc qua đêm ở 37oC.
Ngày 2:
1. Lấy 1 ml canh cấy cho vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ phần nƣớc nổi để lấy tế bào (phần cắn). 2. Phân tán cặn vi khuẩn trong 100 µl dung dịch
GTE bằng máy vortex (phải chắc chắn là toàn bộ vi khuẩn đƣợc phân tán. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
23
3. Thêm 200 µl dung dịch SDS-kiềm và trộn nhẹ nhàng bằng cách lật úp ngửa tube nhiều lần, ủ trong đá 5 phút.
4. Thêm 150 µl dung dịch KOAc 5M và trộn nhẹ nhàng bằng cách lật úp ngửa tube nhiều lần. Ủ trong đá 5 phút sẽ có tủa trắng hiện ra.
5. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để lắng các mảnh vỡ của vi khuẩn. 6. Chuyển phần nƣớc nổi sang một eppendorf 1,5 ml mới, tuyệt đối tránh
chuyển phần cặn. Nếu lỡ có dính cặn, lặp lại bƣớc 5 và 6.
7. Thêm 1 ml ethanol tuyệt đối lạnh, trộn bằng cách lật úp ngửa tube nhiều lần. ADN sẽ tủa nhờ sự hiện diện của muối và ethanol.
8. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10-20 phút để làm lắng plasmid. Cần lƣu ý vị trí của tube khi ly tâm.
9. Đổ bỏ ethanol, tránh làm tróc cặn plasmid.
10.Thêm 100 µl ethanol 70% lành vào cặn ADN. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
11.Đổ bỏ ethanol. Úp ngƣợc tube trên giấy thấm để thấm hết nƣớc. Để khô cắn trong không khí.
12.Hòa tan ADN plasmid trong 50 µl nƣớc cất 2 lần, ADN sẽ hòa tan ngay. Thêm 2 µl dung dịch RNase 10 mg/ml, ủ 37oC trong 30 phút.
13.Bảo quản ADN trong đá hay ở -20oC.
Nói chung hiệu suất của phƣơng pháp khoảng 2-5 µg
ADN, tùy thuộc vào lƣợng plasmid của vi khuẩn. Các plasmid kích thƣớc lớn (>10 kb) thƣờng cho hiệu suất thấp hơn. Lƣợng ADN thu đƣợc đủ dùng cho nhiều thử nghiệm tiếp theo nhƣ cắt với enzyme cắt hạn chế, điện di trên gel agarose,…
24
Bài 4
CHIẾT TÁCH ADN BỘ GEN TỪ TẾ BÀO MÁ Ở NGƢỜI
MỤC TIÊU HỌC TẬP
Thực hiện thao tác tách chiết ADN bộ gen của tế bào niêm mạc má ở người
1. Vật liệu – hóa chất
1.1. Vật liệu sinh học: Tế bào má ở ngƣời
1.2. Hóa chất
- Dung dịch NaCl 0,9%
- Dung dịch phá màng tế bào (Tris-HCl 50 mM pH 8,0; EDTA 50 mM; SDS 1%; NaCl 10 mM)
- Chloroform - Ethanol 100% - Ethanol 70%
- Dung dịch TE (Tris 0,1 M – EDTA 0,001 M) - H2O cất (xử lý DEPC)
1.3. Dụng cụ thiết bị - Cốc nhựa nhỏ - Que cạo gỗ y tế - Tube hình nón 15 ml - Pipetman và tip các loại - Máy ly tâm
- Máy vortex
2. Nguyên tắc
Quy trình tách chiết ADN gồm 3 giai đoạn chính: - Phá vỡ màng tế bào và màng nhân
- Loại protein - Tủa ADN
Phá màng tế bào
Nguyên tắc: Màng tế bào có thể đƣợc phá vỡ bởi các tác nhân lý-hóa học - Tác nhân vật lý: lực cơ học, sóng siêu âm
- Tác nhân hóa học: gồm những chất tẩy nhẹ nhƣ Triton X100, chất tẩy ion nhƣ SDS có khả năng làm xáo trộn cấu trúc của màng tế bào. Riêng tế bào thực vật có vách cellulose nên có thể phá vỡ bằng nitrogen lỏng.
25
Loại protein
Để thu nhận ADN tinh sạch, ngƣời ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (protein/ADN, ARN) trong hai pha không hòa tan.
Một số tác nhân biến tính protein thông dụng:
- Phenol pH 8,0: làm biến tính protein mạnh không hòa tan các nucleic acid. - Chloroform: làm biến tính protein yếu hơn phenol, thƣờng dùng kèm với phenol, có tác dụng bổ sung và loại bỏ hoàn toàn dấu vết của phenol.
Tủa ADN
Sau khi tách chiết, ADN tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn. Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận ADN dƣới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hòa lại trong nƣớc theo nồng độ mong muốn. Có hai kiểu tủa chính:
- Tủa bằng ethanol: thực hiện ở nồng độ muối cao, nồng độ ethanol cao (2-2,5 thể tích ethanol/thể tích dung dịch cần tủa). Nhiệt độ thấp thúc đẩy sự tủa. - Tủa bằng isopropanol: cần nồng độ muối thấp, có thể sử dụng 0,8-1 thể tích isopropanol/thể tích dung dịch cần tủa.
3. Phƣơng pháp tiến hành
1. Chuẩn bị cốc đựng nƣớc muối NaCl 0,9%. Súc miệng thật sạch với nƣớc muối vài lần.
2. Dùng que cạo gỗ nạo mặt trong của má (phần niêm mạc) vài lần. Hòa mẫu vào cốc chứa 10 ml nƣớc cất, sau đó chuyển hết vào tube 15 ml. Đánh dấu tên lên tube.
3. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút.
4. Đổ bỏ phần dịch nổi vào cốc. Lƣu ý thao tác hút bỏ nhẹ nhàng không làm phần cặn lắng ở đáy tube bong ra.
5. Hòa cặn tế bào trong 1 ml dung dịch phá màng tế bào. Chuyển 0,9 ml dịch ly giải tế bào vào eppendorf 2ml và đảo ống trong 2 phút.
6. Thêm 0,9 ml chloroform và trộn đều bằng cách đảo ống trong 2 phút.
7. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Thu phần dịch nổi chuyển sang 1 eppendorf 2ml sạch mới.
8. Lặp lại bƣớc 6 và 7.
9. Cẩn thận thu dịch nổi chứa ADN (V≤ 0,5 ml) sang một eppendorf 1,5 ml. 10.Thêm 2V ethanol lạnh, tuyệt đối so với V mẫu. Đảo trộn đều ống trong 1 phút. 11.Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Nhẹ nhàng loại bỏ dịch nổi. Lƣu ý
không chạm vào cặn ADN ở đáy ống. 12.Thêm vào 1ml ethanol 70%.
13.Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Nhẹ nhàng loại bỏ dịch nổi. 14.Để khô ít nhất 5 phút và hòa cặn trong 50 μl TE 1X.
26
Bài 5
CHIẾT TÁCH ADN TỪ MÔ THỰC VẬT MỤC TIÊU HỌC TẬP
Tìm hiểu và thực hiện ly trích ADN từ mô thực vật
Chiết tách ADN bộ gen từ các mô thực vật có vấn đề khó khăn duy nhất là phải phá vách tế bào rất cứng (khắc phục bằng phƣơng pháp nghiền mô đã đƣợc đông lạnh trong nitơ lỏng) và phải loại bỏ các polysaccarid (bằng cách chiết xuất với dung môi). Có rất nhiều cách thức có thể áp dụng để phân lập ADN thực vật. Bài này giới thiệu phƣơng pháp MITSUI (còn gọi là miniprep vì chỉ cần dùng lƣợng mô rất nhỏ) và phƣơng pháp CTAB.
Ghi chú: phenol và chloroform đều có tính rất độc. Cần mang bao tay và tránh hít hơi bay ra. Phenol dễ cháy và làm phỏng da tay. Cần giữ lại tất cả những dụng cụ có dính phenol và vứt bỏ an toàn.
1. Phƣơng pháp MITSUI 1.1. Nguyên vật liệu 1.1. Nguyên vật liệu
- Dung dịch chiết (0,3M NaCl; 50mM Tris.HCl pH 7,5; 2% Sarkosyl; 0,5% SDS; 5M urea; 5% Phenol xử lý với Tris buffer)
- TE01 (10 mM Tris.HCl pH 8,0; 0,1 mM EDTA pH 8,0) - Phenol: chloroform 25:24 - Isopropanol - Ethanol 70% - RNAse 10 mg/ml - Nitơ lỏng - Củ hành tây, nitơ lỏng 1.2. Tiến hành
- Làm lạnh cối chày với nitơ lỏng (-196oC). Cho hành vào nghiền mịn và chuyển ngay vào eppendorf 2 ml với lƣợng khoảng phân nửa tube.
- Thêm ngay 500 µl dung dịch chiết vào tube và trộn.
- Thêm 500 µl phenol/ chloroform và lắc rung khoảng 20 giây.
- Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong 5 phút. Giai đoạn này sẽ loại bỏ hầu hết các protein, glucid không dùng đến và những mảnh vỡ của tế bào.
- Rút 400 µl phần dung dịch phía trên cho vào những tube đánh dấu.
- Thêm 300 µl isopropanol và trộn đều. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong 10 phút.
- Gạn bỏ phần isopropanol và rửa cặn lắng bằng cách thêm 500 µl ethanol 70%. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong 5 phút.
27
- Gạn bỏ hết ethanol 70% rối úp ngƣợc tube lên giấy thấm để loại bỏ hết ethanol.
- Hong khô cặn lắng rối hòa tan trong 25 µl TE. Thêm 2 µl dung dịch RNAse 10 mg/ml, ủ ở 37oC trong 30 phút. (Thông thƣờng thì 1 µl DNA này đủ để thực hiện PCR). Có thể giữ DNA thu đƣợc ở 4oC trong thời gian ngắn hay ở -20oC trong thời gian dài.
2. Phƣơng pháp CTAB 2.1. Nguyên vật liệu 2.1. Nguyên vật liệu
- Dung dịch CTAB chiết (2% CTAB; 100 mM Tris.HCl pH 8; 20 mM EDTA pH 8; 1,4 M NaCl)
- Dung dịch CTAB kết tủa (1% CTAB; 50 mM Tris.HCl pH 8; 10 mM EDTA pH 8)
- 2- mercaptoethanol (2-ME) sẽ pha thêm vào dung dịch CTAB chiết.
- Dung dịch đệm TE nồng độ muối cao (10 mM Tris.HCl pH 8; 0,1 mM EDTA pH 8; 1 M NaCl)
- Chloroform / isoamyl alcol 24:1 (v/v) - Ethanol 80%
2.2. Thực hành Chiết acid nucleic Chiết acid nucleic
1. Pha dung dịch chiết CTAB chứa 2-ME 2% (v/v). Ủ dung dịch này và dung dịch CTAB/NaCl trong nồi cách thủy 65oC trong 15 phút.
2. Cân 100 mg mô thực vật, cắt nhỏ.
3. Làm lạnh cối chày với nitơ lỏng (-196oC). Cho hành vào nghiền mịn và chuyển vào eppendorf 2 ml.
4. Thêm 1000 µl dung dịch 2-ME/CTAB chiết đã đƣợc làm ấm vào, vortex kỹ. Ủ ở 65oC trong 60 phút, thỉnh thoảng trộn đều.
5. Thêm 1000 µl Chloroform/isoamyl alcol (24:1) vào. Trộn kỹ nhẹ nhàng bằng cách lật úp ngửa tube. Ly tâm 10000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút. Hút pha nƣớc (lớp trên) vào eppendorf mới.
Kết tủa acid nucleic
6. Thêm 2 ml dung dịch CTAB kết tủa vào eppendorf chứa lớp nƣớc ở bƣớc 5. Trộn đều bằng cách úp ngửa eppendorf. Nếu kết tủa xuất hiện thì ủ tiếp ở 65oC trong 30 phút để tủa hoàn toàn DNA. Nếu chƣa có tủa xuất hiện thì thêm 1/10 thể tích dung dịch CTAB kết tủa vào và ủ ở 37oC trong 60 phút. 7. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút ở 4oC trong 30 phút.
8. Lấy cắn, chuyển phần nƣớc nổi vào một eppendorf mới. Hòa cắn với 350 µl dung dịch đệm TE nồng độ muối cao. Nếu cắn khó tan, ủ 65oC trong 30 phút. Lặp lại cho đến khi tủa tan hoàn toàn hay tan gần hết.
Phần dịch nổi đem đo độ hấp thu ở bƣớc song 260nm để phát hiện còn sót acid nucleic hay không. Nếu còn thì ủ tiếp ở 65oC trong 30 phút, ly tâm thu cắn.
28
9. Cho 0,6 thể tích isopropanol vào eppendorf. Trộn đều, ủ -20oC trong 1 giờ. Ly tâm 13000 vòng/phút ở (4oC) trong 30 phút. Cần thận hút bỏ dung dịch. Rửa tủa với 100 µl ethanol 80%, ly tâm bỏ phần cồn, làm khô và hòa tan tủa trong 20 µl TE. (Nộp sản phẩm giữ ở -20oC, thao tác tiếp trong bài sau).
29
Bài 6
KỸ THUẬT CẮT GIỚI HẠN ADN MỤC TIÊU HỌC TẬP
Phân tích mẫu ADN
1. Vật liệu – hóa chất 1.1. Vật liệu sinh học
- ADN plasmid pBluescript II SK(+)
- Các enzyme cắt giới hạn: EcoRI, HindIII, BamHI
1.2. Hóa chất
- Dung dịch nạp mẫu 6X - Dung dịch đệm 10X - Gel agarose 1%
- Dung dịch điện di TAE 1X - Ethidium bromide (10 mg/ml) 1.3. Dụng cụ - Thiết bị - Các pipetman và tip - Eppendorf 0,5 ml - Bể ổn nhiệt - Bộ điện di và nguồn - Bàn đèn UV 2. Các enzyme cắt giới hạn
Định nghĩa: Enzyme cắt giới hạn là những endonuclease có khả năng thủy giải ADN sợi đôi một cách xác định và lặp lại.
Phân loại: gồm 3 nhóm lớn, hầu hết các enzyme cắt giới hạn trong sinh học phân tử đều thuộc nhóm II. Các enzyme nhóm này có khả năng nhận biết một trình tự nucleotide xác định và thủy giải ADN tại trình tự nhận biết đó. Các trình tự nhận biết thƣờng có độ dài 4-8 nucleotide và có dạng palindrome (những đoạn ADN mạch đôi có trình tự trên 2 mạch đơn giống hệt nhau khi đọc theo cùng một chiều). Khi thủy giải ADN, tùy loại enzyme có thể tạo ra đầu bằng hay đầu dính (so le).
Công dụng: Các enzyme cắt giới hạn thủy giải một đoạn ADN dài thành những đoạn ADN ngắn hơn, có kích thƣớc phù hợp để tạo dòng. Các enzyme này còn đƣợc sử dụng để lập bản đồ cắt giới hạn của một trình tự ADN.
EcoRI: ly trích từ vi khuẩn E. coli RY13, có trình tự nhận biết G↓AATTC BamHI: ly trích từ vi khuẩn Bacillus amloliquefaciens H, có trình tự nhận biết G↓GATCC
HindIII: ly trích từ vi khuẩn Haemophilus influenza Rd, có trình tự nhận biết A↓AGCTT
30
3. Phƣơng pháp tiến hành
3.1. Thủy giải ADN plasmid bằng một số enzyme cắt giới hạn
Trong ống eppendorf 0,5 ml, thiết lập phản ứng cắt với các thành phần sau: - ADN plasmid 4 μl
- Dung dịch đệm 10X 2 μl - Nƣớc cất khử trùng 13 μl - Enzyme 1 μl
Ủ phản ứng ở 37oC trong 2 giờ.
Dừng phản ứng: bổ sung 4 l dung dịch nạp mẫu 6X.
3.2. Điện di
Chuẩn bị dung dịch điện di, đổ gel agarose 1%. Điện di ở 80 V trong 30 phút. Xem kết quả dƣới bàn đèn UV. Ghi nhận kết quả.
31
Bài 7
PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE MỤC TIÊU HỌC TẬP
Xác định sản phẩm ADN đã tách chiết
1. Nguyên vật liệu
- ADN cần phân tích (ADN plasmid pBluescript và sản phẩm ADN cắt giới hạn). - Đệm TAE 1X pha từ TAE 50X trƣớc khi dùng.
- Agarose tinh khiết dùng cho điện di.
- Ethidium bromide 5 mg/ml. Rất độc, gây ung thƣ. Phải mang găng tay khi thao tác và pha chế trong tủ hút khí. EtBr nằm xen giữa sợi đôi ADN (không hồi phục, do đó có tính chất làm bất hoạt ADN nên có thể gây ung thƣ), sự phát huỳnh quang của EtBr giúp xác định vị trí băng ADN.
- Đệm thử 10X (chứa glycerol nhằm làm tăng tỷ trọng giúp ADN lọt vào giếng dễ dàng và bromophenol blue để đánh dấu đỉnh di chuyển).
- Thang chuẩn ADN 1 Kb (hỗn hợp các ADN có kích thƣớc biết trƣớc), chạy điện di song song với ADN khảo sát để đối chiếu kích thƣớc ADN).
- Máy điện di nằm ngang, khuôn đổ gel, lƣợc (hình 9). - Gel box có đèn cực tím, máy chụp hình.
2. Tiến hành
1. Pha thạch agarose 1% bằng cách trộn 1 g agarose trong 100 ml TAE 1X. Đun cho thạch tan trong lò vi ba, thỉnh thoảng lắc đều để đảm bảo thạch tan hết. Không để dung dịch agarose sôi trào ra ngoài.
2. Để thạch nguội (cầm bình thạch trong tay mà không bị phỏng), thêm 5 l ethium bromid . Phải đeo gang tay.
3. Chuẩn bị khuôn bằng cách dán băng keo giấy ở 2 đầu hoặc gài thanh chặn. Đổ thạch vào khuôn rồi đặt lƣợc. Để cho nguội và thạch đặc hoàn toàn.
4. Gỡ lƣợc, băng keo và thanh chặn. Đặt khuôn vào máng điện di. Đổ TAE 1X cho ngập thạch. Cần lưu ý là ADN tích điện âm cho nên sẽ di chuyển về phía cực dương. Do vậy đặt bản thạch vào máng sao cho các giếng nằm về phía cực âm.
Hình 10. Sơ đồ máng điện di nằm ngang