2.1. Nguyên vật liệu
- Dung dịch CTAB chiết (2% CTAB; 100 mM Tris.HCl pH 8; 20 mM EDTA pH 8; 1,4 M NaCl)
- Dung dịch CTAB kết tủa (1% CTAB; 50 mM Tris.HCl pH 8; 10 mM EDTA pH 8)
- 2- mercaptoethanol (2-ME) sẽ pha thêm vào dung dịch CTAB chiết.
- Dung dịch đệm TE nồng độ muối cao (10 mM Tris.HCl pH 8; 0,1 mM EDTA pH 8; 1 M NaCl)
- Chloroform / isoamyl alcol 24:1 (v/v) - Ethanol 80%
2.2. Thực hành Chiết acid nucleic Chiết acid nucleic
1. Pha dung dịch chiết CTAB chứa 2-ME 2% (v/v). Ủ dung dịch này và dung dịch CTAB/NaCl trong nồi cách thủy 65oC trong 15 phút.
2. Cân 100 mg mô thực vật, cắt nhỏ.
3. Làm lạnh cối chày với nitơ lỏng (-196oC). Cho hành vào nghiền mịn và chuyển vào eppendorf 2 ml.
4. Thêm 1000 µl dung dịch 2-ME/CTAB chiết đã đƣợc làm ấm vào, vortex kỹ. Ủ ở 65oC trong 60 phút, thỉnh thoảng trộn đều.
5. Thêm 1000 µl Chloroform/isoamyl alcol (24:1) vào. Trộn kỹ nhẹ nhàng bằng cách lật úp ngửa tube. Ly tâm 10000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút. Hút pha nƣớc (lớp trên) vào eppendorf mới.
Kết tủa acid nucleic
6. Thêm 2 ml dung dịch CTAB kết tủa vào eppendorf chứa lớp nƣớc ở bƣớc 5. Trộn đều bằng cách úp ngửa eppendorf. Nếu kết tủa xuất hiện thì ủ tiếp ở 65oC trong 30 phút để tủa hoàn toàn DNA. Nếu chƣa có tủa xuất hiện thì thêm 1/10 thể tích dung dịch CTAB kết tủa vào và ủ ở 37oC trong 60 phút. 7. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút ở 4oC trong 30 phút.
8. Lấy cắn, chuyển phần nƣớc nổi vào một eppendorf mới. Hòa cắn với 350 µl dung dịch đệm TE nồng độ muối cao. Nếu cắn khó tan, ủ 65oC trong 30 phút. Lặp lại cho đến khi tủa tan hoàn toàn hay tan gần hết.
Phần dịch nổi đem đo độ hấp thu ở bƣớc song 260nm để phát hiện còn sót acid nucleic hay không. Nếu còn thì ủ tiếp ở 65oC trong 30 phút, ly tâm thu cắn.
28
9. Cho 0,6 thể tích isopropanol vào eppendorf. Trộn đều, ủ -20oC trong 1 giờ. Ly tâm 13000 vòng/phút ở (4oC) trong 30 phút. Cần thận hút bỏ dung dịch. Rửa tủa với 100 µl ethanol 80%, ly tâm bỏ phần cồn, làm khô và hòa tan tủa trong 20 µl TE. (Nộp sản phẩm giữ ở -20oC, thao tác tiếp trong bài sau).
29
Bài 6
KỸ THUẬT CẮT GIỚI HẠN ADN MỤC TIÊU HỌC TẬP
Phân tích mẫu ADN
1. Vật liệu – hóa chất 1.1. Vật liệu sinh học
- ADN plasmid pBluescript II SK(+)
- Các enzyme cắt giới hạn: EcoRI, HindIII, BamHI
1.2. Hóa chất
- Dung dịch nạp mẫu 6X - Dung dịch đệm 10X - Gel agarose 1%
- Dung dịch điện di TAE 1X - Ethidium bromide (10 mg/ml) 1.3. Dụng cụ - Thiết bị - Các pipetman và tip - Eppendorf 0,5 ml - Bể ổn nhiệt - Bộ điện di và nguồn - Bàn đèn UV 2. Các enzyme cắt giới hạn
Định nghĩa: Enzyme cắt giới hạn là những endonuclease có khả năng thủy giải ADN sợi đôi một cách xác định và lặp lại.
Phân loại: gồm 3 nhóm lớn, hầu hết các enzyme cắt giới hạn trong sinh học phân tử đều thuộc nhóm II. Các enzyme nhóm này có khả năng nhận biết một trình tự nucleotide xác định và thủy giải ADN tại trình tự nhận biết đó. Các trình tự nhận biết thƣờng có độ dài 4-8 nucleotide và có dạng palindrome (những đoạn ADN mạch đôi có trình tự trên 2 mạch đơn giống hệt nhau khi đọc theo cùng một chiều). Khi thủy giải ADN, tùy loại enzyme có thể tạo ra đầu bằng hay đầu dính (so le).
Công dụng: Các enzyme cắt giới hạn thủy giải một đoạn ADN dài thành những đoạn ADN ngắn hơn, có kích thƣớc phù hợp để tạo dòng. Các enzyme này còn đƣợc sử dụng để lập bản đồ cắt giới hạn của một trình tự ADN. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
EcoRI: ly trích từ vi khuẩn E. coli RY13, có trình tự nhận biết G↓AATTC BamHI: ly trích từ vi khuẩn Bacillus amloliquefaciens H, có trình tự nhận biết G↓GATCC
HindIII: ly trích từ vi khuẩn Haemophilus influenza Rd, có trình tự nhận biết A↓AGCTT
30
3. Phƣơng pháp tiến hành
3.1. Thủy giải ADN plasmid bằng một số enzyme cắt giới hạn
Trong ống eppendorf 0,5 ml, thiết lập phản ứng cắt với các thành phần sau: - ADN plasmid 4 μl
- Dung dịch đệm 10X 2 μl - Nƣớc cất khử trùng 13 μl - Enzyme 1 μl
Ủ phản ứng ở 37oC trong 2 giờ.
Dừng phản ứng: bổ sung 4 l dung dịch nạp mẫu 6X.
3.2. Điện di
Chuẩn bị dung dịch điện di, đổ gel agarose 1%. Điện di ở 80 V trong 30 phút. Xem kết quả dƣới bàn đèn UV. Ghi nhận kết quả.
31
Bài 7
PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE MỤC TIÊU HỌC TẬP
Xác định sản phẩm ADN đã tách chiết
1. Nguyên vật liệu
- ADN cần phân tích (ADN plasmid pBluescript và sản phẩm ADN cắt giới hạn). - Đệm TAE 1X pha từ TAE 50X trƣớc khi dùng.
- Agarose tinh khiết dùng cho điện di.
- Ethidium bromide 5 mg/ml. Rất độc, gây ung thƣ. Phải mang găng tay khi thao tác và pha chế trong tủ hút khí. EtBr nằm xen giữa sợi đôi ADN (không hồi phục, do đó có tính chất làm bất hoạt ADN nên có thể gây ung thƣ), sự phát huỳnh quang của EtBr giúp xác định vị trí băng ADN.
- Đệm thử 10X (chứa glycerol nhằm làm tăng tỷ trọng giúp ADN lọt vào giếng dễ dàng và bromophenol blue để đánh dấu đỉnh di chuyển).
- Thang chuẩn ADN 1 Kb (hỗn hợp các ADN có kích thƣớc biết trƣớc), chạy điện di song song với ADN khảo sát để đối chiếu kích thƣớc ADN).
- Máy điện di nằm ngang, khuôn đổ gel, lƣợc (hình 9). - Gel box có đèn cực tím, máy chụp hình.
2. Tiến hành
1. Pha thạch agarose 1% bằng cách trộn 1 g agarose trong 100 ml TAE 1X. Đun cho thạch tan trong lò vi ba, thỉnh thoảng lắc đều để đảm bảo thạch tan hết. Không để dung dịch agarose sôi trào ra ngoài.
2. Để thạch nguội (cầm bình thạch trong tay mà không bị phỏng), thêm 5 l ethium bromid . Phải đeo gang tay.
3. Chuẩn bị khuôn bằng cách dán băng keo giấy ở 2 đầu hoặc gài thanh chặn. Đổ thạch vào khuôn rồi đặt lƣợc. Để cho nguội và thạch đặc hoàn toàn.
4. Gỡ lƣợc, băng keo và thanh chặn. Đặt khuôn vào máng điện di. Đổ TAE 1X cho ngập thạch. Cần lưu ý là ADN tích điện âm cho nên sẽ di chuyển về phía cực dương. Do vậy đặt bản thạch vào máng sao cho các giếng nằm về phía cực âm.
Hình 10. Sơ đồ máng điện di nằm ngang
Chiều di chuyển của ADN
Đệm Gel (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giếng chứa ADN cần phân tích Các band ADN
32
5. Chuẩn bị mẫu: pha 9 l mẫu ADN với 1 l đệm tải. 6. Dùng micropipet cho mẫu vào các
giếng theo thứ tự. Lƣu ý không để mẫu rơi ra ngoài giếng. Nên lót một nền đen bên dƣới máng để nhìn thấy giếng dễ dàng hơn. Kèm theo mẫu nên chạy song song trong một giếng riêng một ADN chuẩn biết trƣớc kích thƣớc để xác định kết quả sau khi chạy (marker). Phải ghi lại thứ tự các mẫu trên bản thạch (vẽ sơ đồ).
7. Chạy điện di ở điện thế không đổi 100 V trong 45 phút.
8. Nhấc khuôn ra khỏi máng và đẩy gel lên UV box (phải đeo găng). Xem xét các băng ADN dƣới đèn cực tím. Có thể chụp ảnh lại bằng máy polaroid có kính lọc.
9. Căn cứ vào marker và sơ đồ các mẫu để xác định vị trí của băng cần thiết.
Bảng tƣơng quan giữa nồng độ gel và kích thƣớc các đoạn cần phân tách
% Acrylamide Kích thƣớc các đoạn cần phân tách (cặp
nucleotid)
4 200 - 800
5 80 - 200
8 40 - 100
11 10 - 50
% Agarose Kích thƣớc các đoạn cần phân tách (kb)
0,6 – 0,8 1 - 20
0,9 – 1,2 0,5 - 7
1,2 – 1,5 0,2 - 5
Hình 11. Các băng ADN phát sáng dƣới tia UV khi nhuộm bằng EtBr
33
Bài 8
PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ADN BẰNG ĐO MẬT ĐỘ QUANG
MỤC TIÊU HỌC TẬP
1. Định lượng ADN trong các sản phẩm thu được
2. Đánh giá độ tinh khiết của ADN
1. Nguyên tắc
Các acid nucleic có đỉnh hấp thu ánh sáng là 260 nm trong vùng tử ngoại. Sự hấp thu này là do sự tƣơng tác giữa các photon với các electron của vòng purin và pyrimidin. Một đơn vị OD (optical density) tƣơng ứng với 50 µg/ml ADN sợi đôi / 40 µg/ml ADN sợi đơn / khoảng 20 µg/ml oligonucleotid sợi đơn. Từ số đơn vị OD đo đƣợc, có thể suy ra nồng độ acid nucleic trong dung dịch.
Ngoài ra, tính tỉ lệ OD260/OD280 có thể giúp ƣớc lƣợng độ tinh khiết của dung dịch acid nucleic. Nếu tỉ lệ này trong khoảng 1,8-2,0 dung dịch acid nucleic đƣợc xem là sạch. Nếu nhiễm protein hay phenol, tỉ lệ này sẽ thấp hơn nhiều và khi đó việc định lƣợng acid nucleic bằng mật độ quang không còn chính xác.
2. Nguyên vật liệu
- Dung dịch ADN cần định lƣợng (ADN plasmid pBluescript, động vật) - Nƣớc cất 2 lần (BDW) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Máy đo mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm, 280 nm và 230 nm
3. Tiến hành
1. Pha loãng 1/50 dung dịch ADN mẫu để có thể tích cuối là 2 ml.
2. Đo OD260 và OD280 của dung dịch ADN cần định lƣợng. Tính tỉ lệ OD260/OD280. Kết luận.
3. Riêng AND chiết từ thực vật, tiến hành đo thêm OD230 và tính tỉ lệ OD260/OD230. Kết luận.
Mẫu OD260 OD280 OD230 OD260/OD280 OD260/OD230 Nồng độ ADN (µg/ml) SP bài 2
SP bài 3 SP bài 4
34
Bài 9
PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI ADN - PCR MỤC TIÊU HỌC TẬP
1. Biết được thành phần và các bước của một phản ứng PCR.
2. Tiến hành khuếch đại một đoạn ADN.
1. Nguyên tắc chung
PCR là phƣơng pháp tổng hợp acid nucleic in vitro, cho phép khuếch đại đặc hiệu một đoạn ADN hoặc ARN.
- Các thành phần của một phản ứng PCR
+ ADN khuôn mẫu (template): ADN chứa đoạn ADN cần khuếch đại (lƣợng ADN thƣờng dùng: 1 ng ADN plasmid hay 10 ng ADN nhiễm sắc thể hay 2 l huyền dịch của một khuẩn lạc/ 20 l LB).
+ ADN polymerase (1 UI).
+ Mồi oligonucleotid (primer) xuôi và ngƣợc có trình tự bổ sung với 2 đầu của chuỗi ADN cần khuếch đại (0,5 mM mỗi loại).
+ Deoxynucleotid triphosphat (dNTPs = dATP, dCTP, d GTP, dTTP với nồng độ 0,25 mM/ loại).
+ Dung dịch đệm phản ứng PCR (thƣờng cung cấp ở dạng dung dịch mẹ 10X).
+ Tùy theo loại ADN polymerase có thể phải cung cấp thêm MgCl2 với nồng độ khác nhau tùy theo phản ứng cụ thể.
- Các bƣớc của một chu kỳ phản ứng PCR: 1. Biến tính ADN ở nhiệt độ 92 - 96C
2. Lai ghép primer đặc hiệu với ADN đích ở nhiệt độ 45 - 65C 3. Tổng hợp ADN dƣới xúc tác của ADN polymerase ở T = 72C Mỗi phản ứng PCR gồm khoảng 25 - 40 chu kỳ
2. Thực hành
Khuếch đại đoạn gen quy định 16S rARN của Bacillus subtilis
- Nguyên vật liệu:
+ ADN nhiễm sắc thể của B. subtilis (bài 2)
+ Dung dịch đệm PCR 10X (KCl 500 mM, Tris-Cl 100 mM pH = 8,8, DTT 30 mM, BSA 1mg/ml. Mua kèm theo Taq. Bảo quản ở -20C/ 3 tháng).
+ d NTPs 100 mM (25 mM mỗi loại), bảo quản ở -20C.
+ MgCl2 25 mM (mua kèm theo Taq). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Mồi: Mồi xuôi (P1) 50 mM (5’-GCGGCGTGCCTAATACATGC-3’) bắt cặp với ADN của 16S rARN ở vị trí 40 đến 59. Mồi ngƣợc (P2) 50 mM (5’- CACCTTCCGATACGGCTACC-3’) bắt cặp với ADN của 16S r ARN ở vị trí
35
1532 đến 1513. Cặp mồi P1-P2 khi sử dụng sẽ khuếch đại đoạn ADN có kích thƣớc khoảng 1,4 kb.
+ Taq ADN polymerase, bảo quản ở -20C
+ Nƣớc khử ion tiệt trùng
+ Eppendorf 0,5 ml có thành mỏng chịu nhiệt
+ Máy luân nhiệt - Tiến hành
+ Cài đặt chƣơng trình TT cho máy luân nhiệt (Thermocycler) (cán bộ BM hƣớng dẫn) Chƣơng trình TT: 95C 5 phút 1 chu kỳ 95C 45 giây 55C 45 giây 30 chu kỳ 72C 2 phút 72C 5 phút 1 chu kỳ 4C 5 phút 1 chu kỳ Cho vào tube PCR:
Thành phần Thể tích
dH2O 36 l
Đệm PCR 10X 5 l dNTPs 100 mM 0,5 l MgCl2 25 mM 5 l ADN nhiễm sắc thể B. subtilis 1 l Mồi xuôi P1 50 mM 1 l Mồi ngƣợc P2 50 mM 1 l Taq ADN polymerase (5 UI/ l) 0,5 l
+ Trộn đều nhẹ nhàng bằng cách dùng ngón tay khẩy nhẹ vào đáy tube vài lần. + Spin trên máy ly tâm để dồn các thành phần phản ứng xuống đáy tube. + Cho tube vào máy luân nhiệt và chọn chạy chƣơng trình TT.
36
PHA CHẾ MỘT SỐ HÓA CHẤT DÙNG TRONG THỰC HÀNH
- Acrylamide 30%: hòa tan 30 g acrylamide và 0,8 g bis-acrylamide trong nƣớc và dùng nƣớc chỉnh thể tích đến 100ml (mang khẩu trang và găng tay bảo hộ khi pha). Bảo quản trong chai tối, ở 4oC.
- Ammonium persulfate (APS) 10%: hòa tan 1 g ammonium persulfate trong 10ml nƣớc tiệt trùng. Bảo quản ở -20oC. Khi dùng để 4oC trong 1-2 tuần.
- Ampicillin 1000X (50 mg/ml): 500 mg ampicillin (sodium salt) trong 10 ml nƣớc, tiệt trùng bằng lọc, phân thành các liều nhỏ (250µl), bảo quản ở -20oC. Mỗi phần chỉ nên dùng vài lần rồi bỏ, không nên rã đông nhiều lần.
- CaCl2 1M: 147 g CaCl2.2H2O, thêm nƣớc đến 1 lít, phân thành các phần nhỏ, hấp tiệt trùng. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
- Canh thang LB (LB Broth) (LB = Luria – bertani): là môi trƣờng thông dụng để nuôi cấy vi khuẩn
Tryptone 10g Cao nấm men (Yeast extract) 5g NaCl 10g NaOH 1M vđ đến pH 7 0,7ml Nƣớc cất vđ 1000ml
Hòa tan các thành phần trong 800 ml nƣớc, điều chỉnh pH, thêm nƣớc vừa đủ 1000ml, chia thành từng phần nhỏ rồi hấp tiệt trùng 121oC trong 15 phút. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
- CTAB/NaCl (CTAB 10% trong NaCl 0,7M): hòa tan 4,1 g NaCl trong 80 ml nƣớc đun (65oC) và khuấy nhẹ đồng thời thêm 10g CTAB (cetrimide hay hexadecyltrimethyl ammonium bromide) cho đến khi tan, thêm nƣớc đến 100 ml.
- Dung dịch đệm của đoạn Klenow 10X: tris.HCl pH 7,5 100mM, NaCl 500 mM, EDTA pH 8 1mM, DTT (dithiothreitol) 50 mM. Bảo quản ở -20oC.
- Dung dịch đệm nối 10X: 660 mM tris.HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 10 mM DTT; 10 mM ATP. Bảo quản ở -20oC trong các phần nhỏ (250 µl). Trộn kỹ trƣớc khi dùng.
- Dung dịch GTE (Glucose-Tris-EDTA): Glucose 50 mM, Tris.HCl pH 8 25 mM, EDTA 10 mM.
Tris base 3g Glucose (dextrose) 9g EDTA 3,72g
Hòa tan trong 800 ml nƣớc điều chỉnh pH đến 8,8 bằng HCl. Thêm nƣớc đến 1000 ml, chia thành các phần nhỏ (100 ml) và hấp hay lọc tiệt trùng. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
- Dung dịch KOAc 5M, pH 4,8: Lấy 29,5 ml acid acetic băng (glacial acetic acid), thêm KOH đậm đặc để chỉnh pH đến 4,8, thêm nƣớc vừa đủ 100 ml. Không hấp tiệt trùng, bảo quản ở nhiệt độ phòng.
37
- Dung dịch SDS-kiềm: SDS 1%, NaOH 0,2M. Pha ngay trƣớc khi dùng từ SDS 10% (kl/tt) và NaOH 1M: trong 5 ml nƣớc thêm 2 ml NaOH 1M rồi thêm 1ml SDS 10% trộn đều, thêm nƣớc vừa đủ 10ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Đệm ly giải Bacillus: 50 mM EDTA, 0,1M NaCl, pH 7,5 EDTA 18,6g
NaCl 5,84g H2O 1000ml
Hòa tan EDTA và NaCl trong 800 ml nƣớc chỉnh pH 7,5 với NaOH. Thêm nƣớc đến 1000 ml chia thành các phần nhỏ (100ml) và tiệt trùng 121oC/ 15 phút. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Đệm TAE 50X: Tris base 242 g; acid acetic băng 55,1 ml; Na2EDTA 37,2g; nƣớc cất vừa đủ 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
- Đệm tải 10X (loading buffer) hay thuốc nhuộm tải (loading dye): glycerol 50% trong TE 1X, có 0,015% bromophenol blue. Hay phối hợp 5 ml glycerol, 1ml TAE 10X, 1 ml bromophenol blue 10%, 1 ml xylem cyanol và 2 ml nƣớc, trộn và bảo quản ở -20oC trong từng phần nhỏ.
- EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid) 0,5M pH 8: hòa tan 186,1 g Na2EDTA trong 700ml nƣớc, điều chỉnh pH đến 8,0 bằng NaOH 10N (khoảng 50ml), thêm nƣớc vừa đủ 1000ml.
- Ethidium bromide 1000X (5 mg/ml): 0,1 g ethium bromide trong 20 ml nƣớc cất. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong lọ bọc giấy nhôm để tránh ánh sáng. Rất độc, gây ung thƣ. Phải mang găng tay khi thao tác và pha chế trong tủ hút khí. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.