đánh giá khả năng gây hại của vi khuẩn xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành và hiệu quả phòng trị bằng vi khuẩn vùng rễ và thuốc hóa học trong điều kiện in vitro và nhà lưới

... VI KHUẨN XANTHOMONAS SP GÂY BỆNH ĐỐM LÁ HÀNH VÀ HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ BẰNG VI KHUẨN VÙNG RỄ VÀ THUỐC HÓA HỌC TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO VÀ NHÀ LƯỚI Do sinh vi n Trần Hưng Minh thực bảo vệ trước hội... TRẦN HƯNG MINH, 2014 Đánh giá khả gây hại vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh đốm hành hiệu phòng trị vi khuẩn vùng rễ thuốc hóa học điều kiện in vitro nhà lưới Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên... thể hiệu tốt phòng trị bệnh trồng (Siddiqui, 2006) Do đó, đề tài: Đánh giá khả gây hại vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh đốm hành hiệu phòng trị vi khuẩn vùng rễ thuốc hóa học điều kiện in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG TRẦN HƯNG MINH ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY HẠI CỦA VI KHUẨN XANTHOMONAS SP. GÂY BỆNH ĐỐM LÁ HÀNH VÀ HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ BẰNG VI KHUẨN VÙNG RỄ VÀ THUỐC HÓA HỌC TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO VÀ NHÀ LƯỚI Luận Văn Tốt Nghiệp Đại Học Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Cần Thơ, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận Văn Tốt Nghiệp Đại Học Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY HẠI CỦA VI KHUẨN XANTHOMONAS SP. GÂY BỆNH ĐỐM LÁ HÀNH VÀ HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ BẰNG VI KHUẨN VÙNG RỄ VÀ THUỐC HÓA HỌC TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO VÀ NHÀ LƯỚI Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Thu Nga Sinh viên thực hiện: Trần Hưng Minh MSSV: 3107502 Cần Thơ, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Bảo Vệ Thực Vật với đề tài: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY HẠI CỦA VI KHUẨN XANTHOMONAS SP. GÂY BỆNH ĐỐM LÁ HÀNH VÀ HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ BẰNG VI KHUẨN VÙNG RỄ VÀ THUỐC HÓA HỌC TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO VÀ NHÀ LƯỚI Do sinh viên Trần Hưng Minh thực hiện và đề nạp Kính trình hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp Cần Thơ, ngày ... tháng ... năm 2014 Cán bộ hướng dẫn TS. Nguyễn Thị Thu Nga TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn với tên đề tài: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY HẠI CỦA VI KHUẨN XANTHOMONAS SP. GÂY BỆNH ĐỐM LÁ HÀNH VÀ HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ BẰNG VI KHUẨN VÙNG RỄ VÀ THUỐC HÓA HỌC TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO VÀ NHÀ LƯỚI Do sinh viên Trần Hưng Minh thực hiện và bảo vệ trước hội đồng. Ý kiến của hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp: ................................................................. .................................................................................................................................................. .................................................................................................................................................. .................................................................................................................................................. .................................................................................................................................................. Luận văn tốt nghiệp được hội đồng đánh giá ở mức: ...................................................... DUYỆT KHOA Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014 Chủ tịch hội đồng LƯỢC SỬ CÁ NHÂN Họ và tên: TRẦN HƯNG MINH. Ngày sinh: 01/07/1992. Nơi sinh: Lịch Hội Thượng, Trần Đề, Sóc Trăng. Họ và tên Cha: TRẦN LÝ BIỂN. Họ và tên Mẹ: LA THỊ HIẾU. Quê quán: Lịch Hội Thượng, Trần Đề, Sóc Trăng. Quá trình học tập: 1998-2003: học sinh Trường Tiểu học dân lập Quốc Cường. 2003-2005: học sinh Trường Trung học cơ sở Lịch Hội Thượng. 2005-2007: học sinh Trường Trung học cơ sở Tân An. 2007-2010: học sinh Trường Trung học phổ thông Châu Văn Liêm. 2010-2014: sinh viên ngành Bảo Vệ Thực Vật Khoá 36, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. iii LỜI CẢM TẠ Kính dâng! Cha, Mẹ suốt đời tận tụy vì sự nghiệp và tương lai của con. Chân thành ghi ơn! Tiến sĩ Nguyễn Thị Thu Nga, giảng viên hướng dẫn đề tài luận văn tốt nghiệp lòng thành kính và biết ơn sâu sắc của em. Cô đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt và động viên em trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Quý Thầy, Cô trong Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật nói riêng và quý Thầy, Cô của Trường Đại học Cần Thơ nói chung đã dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tại trường. Chân thành biết ơn! Chị Đoàn Thị Kiều Tiên và tất cả các anh chị trong Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài này. Các bạn sinh viên lớp Bảo Vệ Thực Vật 36 đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Trân trọng! Trần Hưng Minh iv LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào trước đây. Tác giả luận văn v TRẦN HƯNG MINH, 2014. “Đánh giá khả năng gây hại của vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành và hiệu quả phòng trị bằng vi khuẩn vùng rễ và thuốc hóa học trong điều kiện in vitro và nhà lưới”. Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Cán bộ hướng dẫn khoa học: Tiến sĩ Nguyễn Thị Thu Nga. TÓM LƯỢC Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm bệnh cây và nhà lưới của bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ từ tháng 12/2012 đến tháng 10/2013 nhằm mục đích chọn ra các vi khuẩn vùng rễ và thuốc hóa học có hiệu quả phòng trị bệnh đốm lá trên hành do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây hại. Đánh giá khả năng gây hại của 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. được phân lập từ ruộng hành thuộc các tỉnh Cần Thơ, An Giang và Vĩnh Long. Kết quả chọn ra được chủng Xan CM-AG6 (xã Kiến An – huyện Chợ Mới – tỉnh An Giang) có khả năng gây hại cao nhất. Chủng này được sử dụng làm nguồn tác nhân gây bệnh cho những thí nghiệm sau. Đánh giá khả năng đối kháng của 30 chủng vi khuẩn vùng rễ với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây bệnh đốm lá trên hành trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả cho thấy có 9 trong tổng số 30 chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 với bán kính vòng vô khuẩn từ 1,1-15,4 mm. Trong đó, hai chủng vi khuẩn vùng rễ là 28 (P. fluorescens) và 64 (P. fluorescens) thể hiện khả năng ức chế với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 cao nhất với bán kính vòng vô khuẩn lần lược là 15,4 mm và 7,0 mm. Đánh giá khả năng đối kháng của 8 loại thuốc hóa học với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây bệnh đốm lá trên hành trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả cho thấy thuốc Starner 20WP có hiệu quả ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 cao nhất với bán kính vòng vô khuẩn là 7,9 mm; kế đến là thuốc Xantocin 40WP (6,0 mm). Đánh giá hiệu quả phòng trị của hai chủng vi khuẩn vùng rễ và hai loại thuốc hóa học có khả năng đối kháng cao với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 qua hai biện pháp xử lý phun trước khi lây bệnh 1 ngày và phun sau khi lây bệnh 1 ngày trong điều kiện nhà lưới, kết quả cho thấy các nghiệm thức đều thể hiện hiệu quả trong việc làm giảm bệnh so với nghiệm thức đối chứng. Trong đó chủng vi khuẩn vùng rễ 28 (P. fluorescens) và thuốc Starner 20WP thể hiện hiệu quả hơn các nghiệm thức còn lại vi MỤC LỤC Nội dung Trang LƯỢC SỬ CÁ NHÂN .................................................................................................... iii LỜI CẢM TẠ ..................................................................................................................... iv LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................... v TÓM LƯỢC........................................................................................................................ vi MỤC LỤC ..........................................................................................................................vii DANG SÁCH BẢNG......................................................................................................... x DANH SÁCH HÌNH .........................................................................................................xi DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ....................................................................................... xii ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................................2 1.1. CÂY HÀNH ...........................................................................................................2 1.1.1. Nguồn gốc ..................................................................................................... 2 1.1.2. Đặc tính thực vật ...........................................................................................2 1.1.3. Tình hình sản xuất ........................................................................................2 1.1.4. Một số dịch hại quan trọng trên hành lá ....................................................3 1.2. BỆNH ĐỐM LÁ DO VI KHUẨN (Xanthomonas sp.) ...................................3 1.2.1. Triệu chứng ....................................................................................................3 1.2.2. Tác nhân .........................................................................................................4 1.2.3. Phổ ký chủ......................................................................................................5 1.2.4. Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh............................................................5 1.2.5. Biện pháp phòng trị ......................................................................................5 1.3. VI KHUẨN VÙNG RỄ TRONG PHÒNG TRỪ SINH HỌC BỆNH CÂY TRỒNG ...................................................................................................................7 1.3.1. Khái niệm phòng trừ sinh học.....................................................................7 1.3.2. Khái niệm vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ ....................................................7 1.3.3. Vai trò c ủa vi khuẩn vùng rễ .......................................................................8 1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ PHÒNG TRỪ SINH HỌC BẰNG VI KHU ẨN VÙNG RỄ ............................................................................................9 1.5. ĐẶC ĐIỂM CÁC LOẠI THUỐC HÓA HỌC DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM............................................................................................................. 11 1.5.1. Hỗn hợp Bordeaux..................................................................................... 11 1.5.2. Ditacin 8SL ................................................................................................. 11 1.5.3. Kasumin 2SL .............................................................................................. 12 1.5.4. Starner 20WP.............................................................................................. 13 1.5.5. Super cook 85WP ...................................................................................... 13 1.5.6. Visen 20SC ................................................................................................. 13 1.5.7. Nước vôi ...................................................................................................... 13 vii 1.5.8. Xantocin 40WP .......................................................................................... 14 CHƯƠNG 2. PHƯƠNG TIỆN - PHƯƠNG PHÁP .................................................... 15 2.1. PHƯƠNG TIỆN.................................................................................................. 15 2.1.1. Thời gian và địa điểm................................................................................ 15 2.1.2. Dụng cụ và hóa chất .................................................................................. 15 2.1.3. Vật liệu ........................................................................................................ 15 2.2. PHƯƠNG PHÁP ................................................................................................ 18 2.2.1. Phương pháp thu mẫu bệnh và phân lập vi khuẩn ................................ 18 2.2.2. Đánh giá khả năng gây hại của các chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện nhà lưới .......................... 19 2.2.3. Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện in vitro ........................................................................................................ 20 2.2.4. Đánh giá khả năng đối kháng của các loại thuốc hoá học đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện in vitro.............................................................................................................. 21 2.2.5. Đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh của 2 chủng vi khuẩn đối kháng và 2 loại thuốc hoá học đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện nhà lưới.............................................................. 22 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - TH ẢO LUẬN .................................................................. 25 3.1. Kết quả phân lập và đánh giá khả năng gây hại của các chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. ................................................................................................ 25 3.1.1. Kết quả phân lập........................................................................................ 25 3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng gây hại ........................................................ 26 3.2. Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện in vitro ...................................................................................................................... 31 3.3. Đánh giá khả năng đối kháng của các loại thuốc hóa học đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện in vitro ............................................................................................................................... 34 3.4. Đánh giá hiệu quả phòng trị của hai chủng vi khuẩn đối kháng và hai loại thuốc hoá học đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện nhà lưới...................................................................... 37 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 43 4.1. KẾT LUẬN ......................................................................................................... 43 4.2. ĐỀ NGHỊ ............................................................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 44 PHỤ CHƯƠNG viii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Tên bảng Đặc điểm các chủng vi khuẩn vùng rễ sử dụng trong thí nghiệm Các loại thuốc hoá học được sử dụng trong thí nghiệm Các chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. phân lập được từ các ruộng hành ở các tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long và An Giang Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới qua các ngày sau khi lây bệnh Cấp bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới qua các ngày sau khi lây bệnh Khả năng đối kháng của 9 chủng vi khuẩn vùng rễ với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 qua các thời điểm 1, 3 và 5 ngày sau khi cấy Khả năng đối kháng của các loại thuốc hóa học với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 qua các thời điểm 1, 3 và 5 ngày sau khi cấy Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới qua các ngày Cấp bệnh đốm lá trên chậu do khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới qua các ngày ix Trang 16 21 25 27 28 33 35 38 39 DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5a 3.5b Tên hình Triệu chứng bệnh đốm lá trên hành do vi khuẩn Xanthomonas sp. Sơ đồ minh họa đĩa cấy vi khuẩn Cách bố trí các chủng vi khuẩn đối kháng Cách bố trí các loại thuốc hóa học đối kháng với vi khuẩn Triệu chứng bệnh đốm lá trên hành do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra Triệu chứng bệnh đốm lá do các chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra ở thời điểm 5 NSKLB Bán kính vòng vô khuẩn của vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 trong điểu kiện in vitro ở thời điểm 3 NSKC Bán kính vòng vô khuẩn của các loại thuốc hóa học đối với Xanthomonas sp. CM-AG6 trong điều kiện in vitro ở thời điểm 3 NSKC Mức độ nhiễm bệnh đốm lá do Xanthomonas sp. CM-AG6 của các nghiệm thức tại thời điểm 7 NSKLB trong điều kiện nhà lưới Mức độ nhiễm bệnh đốm lá do Xanthomonas sp. CM-AG6 của các nghiệm thức tại thời điểm 7 NSKLB trong điều kiện nhà lưới x Trang 4 18 20 22 26 30 33 36 41 42 DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT cxđ: chưa xác định. ĐBSCL: Đồng bằng Sông Cửu Long. FAO: Food and Agriculture Organization. Ha: hecta. NSKLB: ngày sau khi lây bệnh. NSKC: ngày sau khi cấy. PGPR: Plant Growth Promoting Rhizobacteria. SAR: systemic acquired resistance. xi ĐẶT VẤN ĐỀ Hành lá (Allium fistulosum L.) thuộc họ hành tỏi Alliaceae là một trong những loại rau gia vị không thể thiếu trong các bữa ăn hàng ngày, mặc dù vốn đầu tư và công lao động cao hơn các loại rau gia vị khác, nhưng vẫn đạt hiệu quả kinh tế cao. (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007). Theo FAO (2011), sản lượng hành trên thế giới khoảng 4,3 triệu tấn, diện tích canh tác 236.934 ha, năng suất 18,1 tấn/ha. Diện tích trồng hành ở châu Á khoảng 138.502 ha, sản lượng 2,8 triệu tấn, năng suất bình quân đạt 20,4 tấn/ha. Ở nước ta, hành được trồng khắp nơi và bất cứ thời gian nào trong năm như ở Phan Rang – Ninh Thuận, Lý Sơn – Quảng Ngãi, với diện tích 118 ha và năng suất trung bình 25 tấn/ha (Trần Khắc Thi và Nguyễn Công Hoan, 2005). Ở nước ta do có khí hậu nóng ẩm là điều kiện thuận lợi cho nhiều loài sâu bệnh gây hại nghiêm trọng trên hành như sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), dòi đục lá (Hylemya antique), sâu ăn tạp (Spodoptera litura), bù lạch (Thrips tabaci), bệnh thối nhũn gốc do vi khuẩn Erwinia sp., bệnh đốm lá do nấm Alternaria pori… (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007). Bên cạnh đó, bệnh đốm lá do vi khuẩn Xanthomonas sp. là một trong những bệnh gây hại quan trọng trên các vùng trồng hành trên thế giới. Bệnh gây hại tất cả các giai đoạn của cây, khi bệnh tiến triển nặng ở giai đoạn đầu của cây có thể làm giảm kích thước thân hành khi thu hoạch. Điều này dẫn đến tình trạng cây bị còi cọc và thân hành có kích thước nhỏ. Khi bệnh gặp điều kiện thuận lợi, tất cả các lá có thể tàn lụi hoàn toàn dẫn đến cây bị chết (Black và ctv., 2012). Vì vậy, năng suất cây trồng có thể giảm đáng kể và thiệt hại năng suất từ 10 đến 50% đã được báo cáo tại các cánh đồng bị bệnh ở Colorado và California, lần lượt là 34 và 50% (Schwartz và ctv., 2000; Nunez và ctv., 2002). Biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp trong đó có sự phối hợp giữa biện pháp canh tác, sinh học và hóa học đang được quan tâm. Để khắc phục việc quá lạm dụng biện pháp hóa học, việc nghiên cứu ra loại thuốc hóa học hiệu quả trong phòng trị tác nhân gây bệnh là rất cần thiết và góp phần làm giảm lượng thuốc hóa học áp dụng vào môi trường. Ngoài ra, việc nghiên cứu biện pháp sinh học thông qua sử dụng nhóm vi sinh vật đối kháng để hạn chế các quần thể vi sinh vật gây bệnh cũng đang được chú trọng nhằm góp phần giảm việc sử dụng thuốc hóa học. Theo nhiều nghiên cứu ghi nhận, nhóm vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng cây trồng (Plant Growth Promoting Rhizobacteria = PGPR) thể hiện hiệu quả tốt trong phòng trị bệnh trên cây trồng (Siddiqui, 2006) . Do đó, đề tài: “Đánh giá khả năng gây hại của vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành và hiệu quả phòng trị bằng vi khuẩn vùng rễ và thuốc hóa học trong điều kiện in vitro và nhà lưới” được thực hiện nhằm tìm ra loại thuốc hóa học và vi khuẩn vùng rễ đối kháng hiệu quả cao trong phòng trị bệnh đốm lá trên hành. 1 CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1. CÂY HÀNH 1.1.1. Nguồn gốc Cây hành lá có tên khoa học là Allium fistulosum L. thuộc họ hành tỏi Alliaceae (CABI, 2007). Vùng tây bắc Trung Quốc được xem là nơi trồng hành lá đầu tiên. Các nhà nghiên cứu di truyền thấy rằng hành lá bắt nguồn từ loài Allium altaicum hoang dã, được tìm thấy ở Siberia và Mông Cổ, nơi mà chúng thường được dùng như một loại rau sử dụng trong nước hoặc xuất khẩu sang Trung Quốc. Hành được trồng ở Trung Quốc từ năm 200 trước công nguyên. Sau đó, chúng được trồng ở Nhật Bản vào những năm 500 sau công nguyên và tiếp tục phổ biến sang Đông Nam Á và châu Âu. Ở Trung Quốc hành lá là một trong những loài rau quan trọng nhất trong lĩnh vực ẩm thực, hơn cả hành tây và tỏi tây ở châu Âu (Oyen và Messianen, 2004). Ngày nay, hành lá được trồng rộng rãi trong các khu vực ôn đới và cận nhiệt đới trên thế giới (Kim và ctv., 2008). 1.1.2. Đặc tính thực vật Hành là cây thân thảo, có 5-6 lá. Lá hình trụ rỗng, dài 30-50 cm có màu xanh bóng, gốc lá phình to, phía trên thuôn nhọn. Hoa tựa dạng hình cầu, gồm nhiều hoa nhỏ xếp liền nhau, màu trắng hoặc vàng nhạt. Quả nang, tròn, chứa nhiều hạt. Hành ưa nhiệt độ tương đối mát, khoảng 20-25o C. Bộ rễ phát triển nhưng ăn nông, khả năng chịu hạn và chịu úng kém (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007). Trong y học phương Đông, cây hành cũng thường sử dụng để làm thuốc. Ngày nay, người ta biết được giá trị của hành cũng giống như tỏi trong việc phòng trị ung thư (Võ Văn Chi, 2005). 1.1.3. Tình hình sản xuất Theo Kim và ctv. (2008), hành lá được trồng rộng rãi trên thế giới trong các khu vực ôn đới và cận nhiệt đới, hành lá được xem là một loại rau được trồng phổ biến tại Hàn Quốc. Ở Nam Mỹ, hành là loại cây trồng xuất khẩu sang thị trường châu Âu và được trồng nhiều ở khu vực thung lũng Río Colorado và các khu vực khác của miền nam Argentina (Kiehr và ctv., 2012). Theo Pathak (1994), hành được coi là gia vị quan trọng trong các món ăn ở châu Á và được trồng theo quy mô lớn ở nhiều nước như Indonesia, Philippines, Thái Lan, Sri Lanka và Ấn Độ. Loại cây trồng này mang lại nhiều lợi nhuận kinh tế cho người dân địa phương. Theo thống kê, châu Á là nơi sản xuất hơn 50% tổng lượng hành thế giới. 2 Theo FAO (2011), sản lượng hành trên thế giới khoảng 4,3 triệu tấn, diện tích canh tác 236.934 ha, năng suất 18,1 tấn/ha. Diện tích trồng hành ở châu Á khoảng 138.502 ha, sản lượng 2,8 triệu tấn, năng suất bình quân đạt 20,4 tấn/ha. Ở Việt Nam, hành được trồng khắp nơi và bất cứ thời gian nào trong năm như ở Phan Rang – Ninh Thuận, Lý Sơn – Quảng Ngãi, với diện tích 118 ha và năng suất trung bình 25 tấn/ha (Trần Khắc Thi và Nguyễn Công Hoan, 2005). Ở vùng Đồng Bằng sông Cửu Long, hành được trồng ở nhiều tỉnh khác nhau như Vĩnh Long, An Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Tiền Giang, Long An... 1.1.4. Một số dịch hại quan trọng trên hành lá Theo Trần Văn Hai và ctv. (2005); Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa (2007), trên hành lá có một số sâu bệnh hại như sau: - Sâu hại: sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), dòi đục lá (Liriomyza huidobrensis), sâu ăn tạp (Spodoptera litura), bù lạch (Thrips tabaci)… - Bệnh hại: bệnh thối nhũn gốc (Erwinia carotovora), bệnh đốm tím trên lá (Alternaria pori), bệnh sương mai (Peronospora destrustor), bệnh thán thư (Colletotricum gloeosporioides và Colletotricum sp.)… 1.2. BỆNH ĐỐM LÁ DO VI KHUẨN (Xanthomonas sp.) 1.2.1. Triệu chứng Bệnh gây hại tất cả các giai đoạn của cây. Đầu tiên có sự xuất hiện các đốm từ màu trắng đến vàng nâu, các đốm có màu sáng hoặc các vết bệnh có dạng lõm được bao quanh bởi những quầng úng nước. Vết bệnh nhanh chóng lan rộng, chuyển từ màu vàng nâu sang nâu kéo theo sự lớn dần diện tích của quầng úng nước (Roumagnac và ctv., 2004b). Khi bệnh tiến triển, các vết bệnh kết hợp lại tạo thành các khu vực bị hoại tử gây ra hiện tượng đầu hành bị chết khô, điển hình là hiện tượng cháy ở mép lá trên các lá già (Black và ctv., 2012). Trường hợp lá bị nhiễm bệnh ở giai đoạn đầu làm cho lá bị hoại tử dẫn đến việc giảm kích thước thân hành khi thu hoạch. Điều này dẫn đến tình trạng cây bị còi cọc và thân hành có kích thước nhỏ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, tất cả các lá có thể tàn lụi hoàn toàn dẫn đến cây bị chết (Black và ctv., 2012). Vì vậy, năng suất cây trồng có thể giảm đáng kể và thiệt hại năng suất từ 10 đến 50% đã được báo cáo tại các cánh đồng bị bệnh ở Colorado và California, lần lượt là 34 và 50% (Schwartz và ctv., 2000; Nunez và ctv., 2002). Về tình trạng thối thân hành do vi khuẩn không được được đề cập đến (Alvarez và ctv., 1978). 3 Hình 1.1 Triệu chứng bệnh đốm lá trên hành do vi khuẩn Xanthomonas sp. (Nguồn: Schwartz, 2006) Theo Black và ctv. (2012), các triệu chứng xảy ra trên tỏi và hẹ cũng xảy ra tương tự như trên hành nhưng ít nghiêm trọng hơn. Đối với giống hành ngắn ngày, các triệu chứng có thể phát triển ở bất cứ giai đoạn nào của cây. Đối với giống hành dài ngày, các triệu chứng thường phát triển trong suốt quá trình hay sau khi thân hành phát triển. 1.2.2. Tác nhân Theo Paulraj và O’Garro (1993), bệnh được ghi nhận lần đầu tiên tại Barbados vào năm 1971. Sau đó, tác nhân gây bệnh được xác định là vi khuẩn Xanthomonas sp. tại Hawaii vào năm 1978 (Alvarez và ctv., 1978). Bệnh đã trở thành dịch vào những năm 1990 và đầu những năm 2000 ở một số nước, bao gồm các tiểu bang của Hoa Kỳ (Isakeit và ctv., 2000; Schwartz và ctv., 2000; Nunez và ctv., 2002; Sanders và ctv., 2003), Nhật Bản (Kadota và ctv., 2000), Cộng hòa Nam Phi (Serfontein, 2001), quần đảo Caribbean (O’Garro và Paulraj, 1997), và đảo Réunion (Roumagnac và ctv., 2000). Theo Kadota và ctv. (2000), chủng vi khuẩn gây bệnh được phân lập từ giống hành xứ Walves và được ghi nhận là Xanthomonas campestris pv. allii. Phân loại này được chấp nhận, tuy nhiên vẫn còn nhiều tranh cãi do chỉ dựa trên đặc điểm sinh hóa, sinh lý và kiểm tra khả năng gây bệnh trên một loạt các cây ký chủ, điều đó vẫn chưa đủ cho việc xác định loài gây hại (Wayne và ctv., 1987; Stackebrandt và ctv., 2002). Cuối cùng, Roumagnac và ctv. (2004a), đã xác định được tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. allii bằng nhiều phương pháp kiểm tra qua nhiều quy trình và phân loại. Xanthomonas axonopodis pv. allii thuộc Lớp Gramma Proteobacteria, Bộ Xanthomonadales, Họ Xanthomonadaceae, Chi Xanthomonas (Dowson, 1939). 4 Theo Roumagnac và ctv. (2004a), vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. allii là vi khuẩn Gram âm, chuyển động với một roi ở cực, là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc với sự trao đổi chất oxy hóa glucose và catalase dương tính, không sản xuất cytochromecoxidase, reductase nitrat, dihydrolase arginine, urease, acetoin hoặc indol và không phát huỳnh quang. 1.2.3. Phổ ký chủ Phạm vi ký chủ của vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. allii bao gồm các loài thuộc họ hành như: hành tây (Allium cepa L.) (Alvarez và ctv., 1978), tỏi (Allium sativum L.), hành lá (Allium fistulosum L.), hẹ tây (Alliium cepa var. ascalonicum Backer) (Roumagnac và ctv., 2004b), hẹ (Allium schoenoprasum L) và tỏi tây (Allium porrum L.) (CABI, 2007). Ngoài ra, bệnh do vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. allii được ghi nhận còn có thể gây hại trên một số loại cây thuộc họ đậu như: đậu cove (Phaseolus vulgaris), đậu tương (Glycine max), đậu lăng (Lens culinaris), đậu gà (Cicer arietinum) và cỏ linh lăng (Medicago sativa) (Gent và ctv., 2005). 1.2.4. Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh Bệnh phát triển ở nhiệt độ cao (trên 27 oC) và bùng phát nghiêm trọng thường xảy ra trong khoảng thời gian ngắn (7-10 ngày) trong điều kiện ẩm ướt, mưa nhiều (CABI, 2007). Dịch bệnh bộc phát nghiêm trọng do các trận mưa lớn, mưa đá, các cơn gió thổi cát và biện pháp tưới phun cao vì nó làm tổn hại lá tạo điều kiện để vi khuẩn lây lan nhanh chóng. Ngoài ra, bệnh còn lây lan từ hạt giống bị nhiễm bệnh, các cây ký chủ phụ như cỏ dại và các loại đậu. Bón quá nhiều đạm có thể làm bệnh nghiêm trọng hơn (Black và ctv., 2012). 1.2.5. Biện pháp phòng trị  Biện pháp canh tác Phương pháp ngâm hạt trong nước nóng có thể làm giảm nguy cơ hạt giống bị nhiễm bệnh, nhưng cũng có thể làm giảm tỷ lệ nảy mầm. Chỉ sử dụng hạt giống sạch hoặc cây được cấy ghép kháng bệnh. Luân phiên cây trồng ít nhất hai năm một lần. Không trồng các loại cây họ đậu sau khi vừa mới thu hoạch loại cây họ hành, tỏi. Kiểm soát hành tự mọc và cỏ dại trong và xung quanh ruộng. Trong suốt quá trình cây phát triển, tránh áp dụng các biện pháp tưới phun và bón phân đạm cân đối phù hợp với giai đoạn sinh trưởng của cây trồng (Black và ctv., 2012). Chôn sâu cây trồng còn sót lại sau khi thu hoạch để giảm tác nhân gây bệnh còn sống sót. Tránh làm việc trong đồng ruộng khi những tán lá còn ướt vì nó có thể lây lan vi khuẩn trong ruộng dễ dàng. Trồng theo các dãi hàng lớn theo hướng gió thổi để tăng lượng không khí chuyển động trong tán cây và giảm thời gian lá bị ướt (Schwartz và Gent, 2007). 5  Biện pháp hóa học Theo Schwartz và Otto (1998), việc quản lý bệnh do vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. allii trên hành tây tại Colorado chủ yếu là áp dụng thuốc diệt khuẩn gốc đồng kết hợp với thuốc diệt nấm ethylenebis dithiocarbamate (EBDC). Mặc dù vậy, việc quản lý bệnh phải được áp dụng một cách ngăn ngừa và thường xuyên (phun 5 đến 10 ngày/lần) tùy thuộc vào điều kiện thời tiết để đạt được hiệu quả (Schwartz và ctv., 2003). Tuy nhiên, việc sử dụng lặp đi lặp lại thuốc gốc đồng có thể dẫn đến tình trạng kháng thuốc, chính vì vây việc quản lý sẽ không có hiệu quả (Bender và Cooksey, 1986; Stall và ctv., 1986) và việc sử dụng thuốc lâu dài có thể gây tác hại cho con người và hệ sinh thái xung quanh (Houeto và ctv., 1995). Theo O'Garro và Paulraj (1997), báo cáo rằng việc phun xịt thuốc diệt khuẩn gốc đồng nhìn chung không có hiệu quả đối với vi khuẩn gây bệnh ở những nơi sản xuất hành vùng nhiệt đới nhưng điều đó đã không được ghi nhận trong các chủng Xanthomonas axonopodis pv. allii phổ biến ở vùng ôn đới. Tuy nhiên, việc kháng thuốc này xảy ra còn phụ thuộc vào loại và cách sử dung thuốc diệt khuẩn gốc đồng trong quản lý bệnh (Gent và ctv., 2004).  Biện pháp sinh học Theo Gent và Schwartz (2005), việc quản lý bệnh do vi khuẩn Xanthomonas sp. có thể đạt hiệu quả cao mà không cần dùng thuốc diệt khuẩn bằng cách áp dụng biện pháp kiểm soát sinh học và khả năng đề kháng của cây. Trong các nghiên cứu của Paulraj và O’Garro (1993) đã tìm ra được chủng vi khuẩn Pantoea agglomerans phân lập từ vùng rễ hành tây ở vùng Barbados có khả năng ức chế gần như hoàn toàn toàn vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành. Theo Jackson (1989), đã áp dụng thành công thực khuẩn thể trong việc quản lý một số bệnh do vi khuẩn gây hại trên cây trồng. Để chứng minh điều đó, Lang và ctv. (2007) đã thành công trong việc áp dụng thực khuẩn thể để làm giảm bệnh đốm lá hành do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra. Một chiến lược thay thế khác cho việc quản lý bệnh vi khẩn Xanthomonas sp. ở hành đó là sử dụng cơ chế kích kháng (systemic acquired resistance (SAR)). Chẳng hạn như acibenzolar-S-methyl (Actigard 50WG, Syngenta Crop Protection, Greensboro, NC) được nghiên cứu có khả năng kích kháng trên cây trồng chống lại nhiều loại mầm bệnh khác nhau. Acibenzolar-S-methyl là một sản phẩm phổ biến có thể được sử dụng để bảo vệ chống lại một loạt các vi khuẩn, nấm và virus gây bệnh và đã được chứng minh có hiệu quả trong việc quản lý bệnh héo do vi khuẩn trên cà chua (Anith và ctv., 2004), đốm vi khuẩn trên cà chua (Louws và ctv., 2001) và bệnh do vi khuẩn Xanthomonas sp. trên hành. Acibenzolar-S-methyl đóng vai trò tương tự như axít salicylic, một trong những hợp chất tín hiệu chính trong SAR. 6 Tuy nhiên, đối với Acibenzolar-S-methyl và các chất gây cảm ứng khác phải được sử dụng cẩn thận (Gent và Schwartz, 2005). 1.3. VI KHUẨN VÙNG RỄ TRONG PHÒNG TRỪ SINH HỌC BỆNH CÂY TRỒNG 1.3.1. Khái niệm phòng trừ sinh học Theo Phạm Văn Kim (2006), phòng trị sinh học bệnh cây là điều khiển môi trường, cây trồng và vi sinh vật đối kháng một cách thích hợp, nhằm tạo nên một thế cân bằng sinh học cần thiết, giúp giảm mật số của mầm bệnh xuống dưới ngưỡng gây hại. Nhờ đó bệnh cây trồng chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ, không gây ảnh hưởng quan trọng về mặt kinh tế. Theo Agrios (2005), phòng trừ sinh học bệnh cây là kiểm soát bằng sinh học một cách hoàn toàn hay một phần sự phá hủy mật số của mầm bệnh bởi những vi sinh vật khác xuất hiện trong tự nhiên. 1.3.2. Khái niệm vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ Vùng rễ (rhizosphere) là thể tích đất xung quanh bộ rễ và ảnh hưởng đến bộ rễ. Rhizoplane là thể tích bề mặt rễ và có ái lực mạnh với các phần tử đất (Kennedy, 2005). Theo Phạm Văn Kim (2006), trong đất có rất nhiều vi sinh vật sống được xếp vào 5 nhóm chính là nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn, tảo và nguyên sinh động vật. Trong đó nhóm vi khuẩn rất đa dạng và giữ vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất trong đất. Vi khuẩn vùng rễ là những vi khuẩn sống ở vùng rễ và được định vị ở rễ cây, chúng có khả năng sinh sôi và chiếm lĩnh các ổ sinh thái ở rễ vào tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây. Có khoảng 2-5% vi khuẩn vùng rễ khi được chủng vào đất có hệ vi sinh vật cạnh tranh, biểu hiện có lợi cho sự tăng trưởng của cây được gọi là vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng cây trồng (Plant Growth Promoting Rhizobacteria = PGPR) (Siddiqui, 2006). Theo Vessey (2003), vi khuẩn vùng rễ gồm hai nhóm:  Vi khuẩn quanh vùng rễ Nhiều vùng rễ non được định cư bởi vi khuẩn, nơi đây có nhiều hốc sinh thái thích hợp mà những vi khuẩn thuộc các loài như Azotobacter, Bacillus và Pseudomonas có thể phát triển. Những vi khuẩn này ngăn chặn vi sinh vật có hại. Nhiều báo cáo ghi nhận rằng vi khuẩn vùng rễ ảnh hưởng có lợi lên sự tăng trưởng của cây thông qua khả năng kiềm chế hay chiếm chỗ của mầm bệnh.  Vi khuẩn nội sinh rễ Vi khuẩn vùng rễ thường là các vi khuẩn sống tự do, nhưng một số loài có thể xâm nhập vào mô cây sống mà không làm cây biểu hiện triệu chứng bị xâm nhiễm, được gọi là vi khuẩn nội sinh rễ. Để thâm nhập vào rễ trước hết chúng phải là những vi khuẩn vùng rễ (Siddiqui, 2006). Vi khuẩn nội sinh rễ thường được 7 tách ra từ mô cây đã được khử trùng bề mặt hoặc được trích ra từ bên trong rễ cây (Kloepper và ctv., 2006). Theo Lian và ctv. (2008), nhóm vi khuẩn nội sinh rễ trên cây trồng được tìm thấy gồm Bacillus spp., Pseudomonas spp., Serratia spp., Clavibacter spp.… Vi khuẩn nội sinh rễ có thể sống nội sinh ở vị trí mầm bệnh và trực tiếp ức chế mầm bệnh hoặc gián tiếp kích thích tính kháng bệnh trên cây trồng chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh (Raaijmakers và ctv., 2002). 1.3.3. Vai trò của vi khuẩn vùng rễ  Vai trò của vi khuẩn vùng rễ trong kích thích tăng trưởng cây trồng - Theo Vessey (2003), có rất nhiều vi khuẩn vùng rễ có vai trò cố định đạm tự do trong không khí bổ sung cho cây trồng, bao gồm các vi khuẩn nội sinh như: Azoarcus sp., Burkholderia sp., Herbaspirillum sp., Gluconacetobacter diazotrophicus. và các vi khuẩn định vị quanh vùng rễ như: Azotobacter sp., Paenibacillus (Bacillus) polymyxa (Siddiqui, 2006). - Vi khuẩn vùng rễ có khả năng hòa tan lân dạng khó tiêu trở nên hữu dụng với cây trồng bằng cách tiết ra các axít làm thay đổi pH của môi trường hoặc tiết ra enzyme phytase hoặc một số cơ chế có lợi khác. Các chủng vi khuẩn B. subtilis, Klebsiella terrigena, Pseudomonas spp.... là các chủng có khả năng tiết ra phytase có thể thủy phân hợp chất phosphate hữu cơ. Cây trồng với sự hiện diện của các vi khuẩn B. amyloliquefaciens có thể tiết ra phytase hoặc khi tưới dịch trích lọc từ chúng có thể kích thích cây trồng tăng trưởng tốt hơn so với cây trồng không có sự hiện diện của vi khuẩn này (Siddiqui, 2006). - Vi khuẩn vùng rễ trực tiếp tác động vào cây bằng cách tăng cường sản xuất các phytohormone thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của cây như: indol3-acetic acid (IAA), gibberellin (GA) và cytokinin (Tien và ctv., 1979). Và hạ thấp mức ethylene của cây thông qua việc tiết enzyme 1-aminocyclopropane1carboxylic acid (ACC)-deaminase, từ đó kích thích sự phát triển của cây trồng (Glick, 1995; Arshad và Frankenberger, 2002). - Vi khuẩn vùng rễ giúp gia tăng tỷ lệ nảy mầm, tăng trưởng rễ, sản lượng (bao gồm cả hạt), khả năng chịu đựng khô hạn và làm chậm quá trình lão hoá của cây (Lucy và ctv., 2004).  Vai trò của vi khuẩn vùng rễ trong phòng trừ sinh học bệnh cây trồng - Cơ chế tiết chất kháng sinh: theo Fernando và ctv. (2006), vi khuẩn vùng rễ đóng vai trò rất quan trọng trong quản lý bệnh hại cây trồng. Chúng sở hữu nhiều cơ chế tác động có lợi cho cây trồng bởi có thể ức chế nhiều mầm bệnh. Cơ chế quan trọng chính yếu trong phòng trừ sinh học của các vi khuẩn vùng rễ là khả năng tiết ra các chất kháng sinh. Một số chất kháng sinh được biết đến của các vi khuẩn vùng rễ bao gồm: 2,4-diacetylphloroglucinol, phenazin-1-carboxylic acid, phenazine-1-carbonxamide, pyoluteorin, pyrrolnitrin, oomycin A, 8 viscosinamide, butryrolactones, kanosamine, zwittermycin–A, pseudomonic acid.... Nhóm vi khuẩn Pseudomonas spp. được ghi nhận tiết nhiều kháng sinh ức chế mầm bệnh do nấm, vi khuẩn, tuyến trùng và virus gây ra (Keel, 1992). - Cơ chế cạnh tranh: vi khuẩn vùng rễ cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian sống với mầm bệnh, chúng tiết ra các chất ái lực với sắt (siderophore) để lấy sắt không hữu dụng trong môi trường thành sắt hữu dụng cho vi khuẩn tạo nên sự bất lợi cho các vi sinh vật khác không có khả năng tạo ra phức chất này, đặc biệt là mầm bệnh. Các siderophore được sản xuất từ vi khuẩn vùng rễ bao gồm pyoverdin, pyochelin và salicylic axít (Duffy và Defágo, 1999; Bultreys và Gheyson, 2000). Cây trồng không bị ảnh hưởng do sự nghèo sắt trong đất vì cây tăng trưởng ở nồng độ sắt thấp hơn vi sinh vật (Siddiqui, 2006). - Cơ chế tiêu sinh: nhiều vi khuẩn vùng rễ có khả năng tiết ra các enzyme glucanase, chitinase, proteinase phân huỷ các thành phần glucan, chitin và protein là các thành phần cấu tạo nên vách tế bào của nấm và vi khuẩn gây bệnh (Siddiqui, 2006). - Cơ chế kích thích tính kháng bệnh lưu dẫn: cùng với việc ức chế bệnh trong đất theo cơ chế đối kháng, vi khuẩn vùng rễ cũng sở hữu cơ chế kích kháng lên cây trồng có thể hạn chế được cả bệnh ở rễ và trên tán lá. Các yếu tố được xác định trong cơ chế kích kháng liên quan đến vi khuẩn như thành phần lipopolysaccharide (hiện diện ở màng ngoài tế bào vi khuẩn), hay siderophore hoặc salicilyc axít do vi khuẩn tiết ra đóng vai trò như chất kích kháng trên cây trồng chống lại mầm bệnh (Van Loon và Bakker, 2005). 1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ PHÒNG TRỪ SINH HỌC BẰNG VI KHUẨN VÙNG RỄ Bởi mang lại nhiều lợi ích cho cây trồng nên các vi khuẩn vùng rễ không ngừng được nghiên cứu và ứng dụng trong suốt thời gian qua. Cụ thể rất nhiều công trình nghiên cứu trong nước và thế giới về lợi ích của chúng đã được ghi nhận: Theo Kloepper và ctv. (1993), các chủng vi khuẩn vùng rễ như Pseudomonas putida 89B-27, Serratia marcescens 90-166 và Flavimonas oryzihabitans INR-5 có hiệu quả giảm bệnh đốm lá góc cạnh và héo do vi khuẩn. Bacillus pumilus SE34 và Pseudomonas putida 89B61 được biết như là tác nhân kích kháng lưu dẫn cảm ứng chống lại bệnh do nấm và vi khuẩn gây ra trên cà chua và dưa leo (Wei và ctv., 1996; Zehnder và ctv., 2001). Chi vi khuẩn Pseudomonas sống ở vùng rễ như các loài P. fluorescens, P. cepacia, P. aureofaciens… được ghi nhận có khả năng phòng trị hầu hết các tác nhân gây bệnh trong đất như nấm Pythium, Phytophthora, Fusarium… khi áp dụng trên hạt giống và tưới vào rễ thì giúp hạn chế được bệnh héo cây con, thối nhũn (Agrios, 1997). 9 Theo Yang và Crowley (2000), pyoverdine và siderophore được tiết ra nhiều bởi Pseudomonas trong việc phòng trị hiệu quả tác nhân Pythium và Fusarium. Theo Kumar và ctv. (2002), trong 80 chủng vi khuẩn phân lập thì có 18 chủng Pseudomonas fluorescens có khả năng đối kháng mạnh với nấm Rhizoctonia solani và Fusarium oxysporium. Theo Nguyễn Thị Thu Nga và Phạm Văn Kim (2003), bước đầu khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn Burkholderia cepacia TG17 đối với nấm Rhizoctonia solani trong điều kiện in vitro bước đầu thành công. Tiếp theo, Phạm Văn Kim và Mew (2003), sử dụng vi khuẩn Burkholderia cepacia TG17 ở Tiền Giang nhằm quản lí bệnh đốm vằn ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Sau 4 vụ áp dụng giải pháp này thì vào vụ thứ 4 bệnh đốm vằn không còn quan trọng trên ruộng lúa nữa. Các loài thuộc chi Bacillus như B. amiloliquefaciens, B. subtilis, B. pasterii, B. pumilus, B. mycoides và B. sphaercus được biết có khả năng kích kháng hay đối kháng giúp giảm bệnh do nhiều loại tác nhân trên nhiều loại cây trồng (Kloepper và ctv., 2004). Sản phẩm Yield Shield với thành phần hoạt chất là nội bào tử của B. pumilus, chủng GB34 được đăng ký tại Mỹ năm 2003 để trị bệnh trên đậu nành. Sản phẩm BioYield với thành phần là 2 chủng B. amiloliquefaciens GB 99 và B. subtilis GB122, được khuyến cáo kích kháng trên bắp cải, cải bông, dưa leo, dưa hấu, ớt, cà chua chống lại nhiều tác nhân gây bệnh và kích thích tăng trưởng cây (Kloepper và ctv., 2004). Hai loài vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis và Pseudomonas fluorescens có thể được sử dụng như biện pháp sinh học trong phòng trừ tổng hợp bệnh héo xanh vi khuẩn hại cây trồng bởi nó có khả năng cạnh tranh, đối kháng, ức chế sự xâm nhiễm gây hại của R. solanacearum (Đỗ Tấn Dũng, 2005). Theo Ji và ctv. (2005), biện pháp áo hạt kết hợp với tưới đất và biện pháp phun lên lá với ba chủng vi khuẩn vùng rễ Pseudomonas syringae Cit7, Pseudomonas fluorescens 89B-61 và Bacillus pumilus SE34 đã giúp ngăn chặn bệnh đốm lá và đốm trái do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. tomato và Xanthomonas campestris pv. vesicatoria gây ra trên cây cà chua ở điều kiện ngoài đồng. Bằng cách áo hạt và tưới đất với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 23 1-1 qua thí nghiệm đã giảm được sự nhiễm bệnh trên lá do nấm Didymella bryoniae trên dưa hấu trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng (Nga và ctv., 2010). Theo Nguyễn Thị Tấm (2013), đã tiến hành thí nghiệm đánh giá hiệu quả phòng trị của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 23 1-1 đối với bệnh cháy bìa lá lúa (X. oryzae pv. oryzae) thì thấy rằng các nghiệm thức phun trước 1 ngày khi lây bệnh 10 với huyền phù vi khuẩn P. aeruginosa 23 1-1 ở mật số 10 8, 10 9 cfu/ml và phun sau 1 ngày khi lây bệnh với huyền phù vi khuẩn P. aeruginosa 23 1-1 ở mật số 10 7 , 10 8, 10 9 cfu/ml đều có hiệu quả giảm bệnh vào thời điểm 10 ngày sau khi lây bệnh. Theo Đoàn Thị Kiều Tiên (2010), chủng vi khuẩn 44 (P. fluorescens) cho hiệu quả phòng trị bệnh cao nhất đối với bệnh cháy lá và đốm trái dưa hấu do vi khuẩn Acidovorax avenae subsp. citrulli gây ra ở tất cả các biện pháp xử lý với vi khuẩn vùng rễ bao gồm ngâm hạt + tưới đất, phun lá trước, phun lá sau và kết hợp phun lá trước sau trong điều kiện nhà lưới. Chủng vi khuẩn vùng rễ 67 (Bacillus sp.) cho hiệu quả phòng trị cao nhất đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên ớt do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. vesicatoria gây ra khi xử lý kết hợp phun lá trước và sau trong điều kiện nhà lưới (Nguyễn Vũ Cương, 2011). 1.5. ĐẶC ĐIỂM CÁC LOẠI THUỐC HÓA HỌC DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM 1.5.1. Hỗn hợp Bordeaux Theo Trần Văn Hai (2005), nguyên tắc và cách pha chế: 4CuSO4 + 3Ca(OH)2  CuSO4.3Cu(OH)2 + 3CaSO4. Lượng vôi thường được dùng dư để tạo pH trung tính hay kiềm. Dạng thường dùng là Bordeaux 1% được pha chế theo tỷ lệ CuSO4 : Ca(OH)2 : H2 O = 1 kg : 1 kg : 100 lít. Với cây trồng có độ mẫn cảm cao với đồng, tác động có thể giảm tỷ lệ đồng (0,5 : 1 : 100). Huyền phù mới pha chế khá bền và có tính dính rất tốt. Ở thời kỳ cây ngủ nghỉ, có thể dùng ở nồng độ 3-6%, ở nồng độ này thuốc trừ được cả rêu và địa y. Công dụng và cách dùng: thuốc có tác động vạn năng, tuy nhiên ít hiệu lực với bộ nấm Erysiphales gây bệnh phấn trắng. - Dùng để phun lá: phòng trừ được rất nhiều loại nấm gây bệnh đốm lá, cháy lá. Bordeaux 1% có hiệu quả tốt trên bệnh mốc sương hại cà chua, khoai tây Phytophthora infestan, bệnh rỉ sắt cà phê Hemilia vastatrix, đốm đen hại cam Phoma citricarpa, bệnh phồng lá chè Exobasidium vexans, đốm mắt cua thuốc lá Cercospora nicotiana… - Dùng để quét lên vết thương bằng Bordeaux 5% sau khi cạo sạch phần bị nấm phá hại sẽ phòng trị được bệnh xì mủ cao su Phytophthora palmivora. - Xử lý vườn ươm: chống vi khuẩn Pseudomonas sp. gây bệnh chết cây con thuốc lá và nhiều nấm bệnh, vi khuẩn khác trong đất. 1.5.2. Ditacin 8SL Thuốc có chứa hoạt chất là Ningnamycin ((4-sarco-radical eacylacylaminoL-scryl-acyl acylamino-4-deoxidation-β-D glucopyranose aldehyde acylamino) cytimidin). Công thức phân tử: C16H23O8N7 . 11 Đặc tính: dạng bột trắng dễ tan trong nước và methanol, khó tan trong aceton và benzene. Là thuốc trừ bệnh sinh học có tác dụng nội hấp, lưu dẫn. Hoạt chất Ningnamycin có thể phòng trừ các bệnh héo rũ, bệnh khảm, bệnh sáng gân trên thuốc lá; sương mai trên cà chua; cháy bìa lá lúa, đốm vằn trên lúa; thối nõn trên dứa; héo xanh trên lạc, cà chua, dưa chuột… (Ma và Tredway, 2013) Cách dùng: phun thuốc khi cây chớm bệnh, nếu nặng phun 2 lần cách nhau 5 ngày. Pha 10-12 ml cho bình 10-16 lít. Thuốc được phân phối bởi công ty TNHH Nông Sinh. 1.5.3. Kasumin 2SL Thuốc có chứa hoạt chất là Kasugamycin ([5-amino-2-methyl-6(2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyloxy)tetrahydropyran-3-yl]amino-α-iminoacetic acid) được ly trích từ môi trường nuôi cấy nấm Streptomyces kasugaensis. Công thức phân tử: C14 H28ClN3 O10 (Trần Văn Hai, 2005). Đặc tính: Kasumin ở dạng tinh thể, tan trong nước (125 g/lít), tan ít hoặc không tan trong nhiều loại dung môi hữu cơ, không bền vững trong môi trường axít và kiềm mạnh. Thuốc thuộc nhóm độc IV. Thời gian cách ly: cây ăn quả 14-21 ngày; dưa chuột, cà chua, cải xanh, xà lách 7 ngày; chè 30 ngày. Thuốc không độc đối với cá và ong mật (Trần Văn Hai, 2005). Cách dùng: Kasumin được sản xuất qua quá trình lên men xạ khuẩn Streptomyces kasugaensis. Để trừ bệnh đạo ôn, bệnh đốm sọc vi khuẩn hại lúa dùng Kasumin dung dịch hoặc bột thấm nước 2% ở liều lượng 1-1,5 kg chế phẩm/ha. Cần phun lúc lúa trổ rộ để trừ đạo ôn cổ bông. Thuốc được phân phối bởi công ty Arysta LifeScience Vietnam Co., Ltd. 1.5.4. Starner 20WP Thuốc có chứa hoạt chất là Oxolinic axít (5-ethyl-5,8-dihydro-8oxo[1,3]dioxolo[4,5-g]quinoline-7-carboxylic acid). Công thức phân tử: C13 H11 NO5. Đặc tính: thuốc trừ vi khuẩn nội hấp, tiếp xúc mạnh, dạng bột, tan hoàn toàn trong nước. LD50 525 mg/kg đối với chuột và LD50 1890 mg/kg đối với chuột nhắt. Rất ít độc với người, vật nuôi và môi trường. Thời gian cách ly 7 ngày trước khi thu hoạch. Không thả vật nuôi vào nơi mới phun thuốc. Cách dùng : có tác dụng phòng và trừ các bệnh do các vi khuẩn Gram âm, như các loài Xanthomonas, Pseudomonas và Erwinia hại lúa, rau và cây ăn quả. Có thể pha thuốc với nước ở nồng độ 0,1% phun lên cây khi bệnh mới xuất hiện (tỷ lệ nhiễm bệnh dưới 5%), dùng xử lý hạt giống theo 2 cách: - Xử lý khô: 30-50 g thuốc trộn với 10 kg hạt giống rồi đem gieo. - Xử lý nước pha nồng độ nước thuốc 5%, ngâm hạt giống vào nước thuốc trong 10 phút. 12 Thuốc được phân phối bởi công ty TNHH Sumitomo Chemical Vietnam. 1.5.5. Super cook 85WP Thuốc có chứa hoạt chất là Copper oxychloride (dicopper chloride trihydroxide). Công thức phân tử: 3Cu(OH)2.CuCl2 hoặc 3CuO.CuCl2.4H2 O. Đặc tính: màu lục sáng, không mùi, ít tan trong nước và không tan trong các dung môi hữu cơ. Bền ở điều kiện bình thường, phân huỷ ở nhiệt độ cao, dễ tan trong các axít vô cơ và kiềm, dễ bị kiềm phân huỷ thành những chất ít độc đối với nấm và dễ tác dụng với nhưng muối amin tạo thành phức chất bền. Thuốc có tác động tiếp xúc, phòng trừ nấm bệnh phổ rộng và chống vi khuẩn qua hệ thống thân, lá và rễ của cây trồng. Thuốc ít độc với cá, ong, gia súc, gia cầm, con người và không ảnh hưởng đến môi trường sinh thái. Công dụng: phòng trừ được nhiều loài nấm bệnh trên lá cây trồng như các bệnh đốm đen, đốm nâu, ghẻ, bồ hóng trên cam, quýt, chanh…; bệnh rỉ sắt, thán thư trên cà phê; bệnh phồng lá, chấm xám lá trà; bệnh đốm lá, đốm mắt cua hại thuốc lá, bệnh giác ban bông; bệnh đốm nâu, sương mai cà chua; bệnh đốm lá, bệnh rỉ trên đậu… Cách dùng: Pha 12,5-25 g cho bình 8 lít, phun 4 bình cho 1000m 2. Phun ướt lá, thân lúc sáng sớm hoặc trời mát, phun hoặc tưới gốc để phòng trừ khi bệnh mới xuất hiện. Phun cách khoảng 7-14 ngày tùy tình trạng và bệnh của cây trồng. Thời gian cách ly: ngừng phun thuốc 7 ngày trước khi thu hoạch. Thuốc được phân phối bởi công ty Bảo Vệ Thực Vật An Hưng Phát. 1.5.6. Visen 20SC Thuốc có chứa hoạt chất là Saisentong (copper salt of 5,5′(methylenediimino)bis(1,3,4-thiadiazole-2-thiol)). Công thức phân tử: C5 H4CuN6 S4. Công dụng: thuốc tác động lưu dẫn cực mạnh, hấp thụ nhanh chóng ngay sau khi phun thuốc và phân tán đều khắp trong các mô cây. Có phổ tác dụng rộng trừ được nhiều nguồn bệnh do nhóm vi khuẩn gây hại như Erwinia, Xanthomonas…Hầu như không gây hại cho cá, chim và ong. Cách dùng: pha 10-15 ml cho bình 16 lít, dùng 0,25-0,35 lít thuốc pha với 320-400 lít nước phun cho một hecta. Phun thuốc khi bệnh chớm xuất hiện, phun lại lần 2 cách lần đầu khoảng 5-7 ngày nếu cần thiết. Được phân phối bởi công ty cổ phần Thuốc sát trùng Việt Nam. 1.5.7. Nước vôi Hoạt chất là canxi hydroxit. Công thức phân tử: Ca(OH)2. Tính chất: có tính bazơ trung bình-mạnh, có phản ứng mạnh với các axít và ăn mòn nhiều kim loại khi có sự tham gia của nước. 13 Khi dùng hydroxit canxi quá liều có thể gây ra các triệu chứng nguy hiểm, bao gồm: khó thở, chảy máu trong, hạ huyết áp, liệt cơ xương, gây nhiễu hệ thống actinmyosin, tăng pH trong máu và gây tổn thương các nội tạng. Cách dùng: pha loãng, để lắng xuống và lấy phần nước trong phun lên cây bệnh. Hoà vôi bột (vôi quét tường) vào nước với liều lượng 2 kg vôi/16 lít nước, lắng lấy nước trong và phun lên lá (2 bình/1000 m2) (trích dẫn Trần Thị Thu Thủy, 2007) hay có thể rải vôi 60-80 kg/ha lúc lúa mới chớm bệnh (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1998). 1.5.8. Xantocin 40WP Thuốc có chứa hoạt chất là Bronopol (2-bromo-2-nitropropane-1,3-diol). Công thức phân tử: C3H6 BrNO4. Công dụng: là thuốc trị bệnh vi khuẩn thế hệ mới, có tác động tiếp xúc và nội hấp mạnh. Phòng trừ bệnh bạc lá và thối gốc do vi khuẩn trên lúa. Liều lượng và cách sử dụng: pha 10-12,5 g cho bình 16 lít, phun tối thiểu 320 lít/hecta. Nên phun ướt đều tán cây trồng, nếu áp lực bệnh cao nên phun lần 2 cách 5-7 ngày. Thời gian cách ly: ngưng phun thuốc trước khi thu hoạch 7 ngày. Thuốc được phân phối bởi công ty cổ phần Khử trùng Việt Nam. 14 CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN – PHƯƠNG PHÁP 2.1. PHƯƠNG TIỆN 2.1.1. Thời gian và địa điểm - Thời gian: thí nghiệm được thực hiện từ tháng 12/2012 đến tháng 10/2013. - Địa điểm: phòng thí nghiệm bệnh cây và nhà lưới Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. 2.1.2. Dụng cụ và hóa chất - Dụng cụ: kính hiển vi, máy đo pH, cân điện tử, tủ thanh trùng ướt, tủ thanh trùng khô, đĩa Petri, bình tam giác, ống nghiệm, waterbath, micropipette, tủ lạnh, tủ úm… - Hóa chất: cồn, các hoá chất cần thiết cho môi trường King’s B… - Công thức môi trường King’s B (Shurtleff và Averre, 1997): Peptone 20 g K2HPO4 1,5 g MgSO4.7H2 O 1,5 g Glycerol 15 ml Agar 20 g Nước cất 1000 ml pH 7,0-7,4 2.1.3. Vật liệu - Giống hành: giống địa phương được mua tại xã Tân Quới, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long. - Nguồn vi khuẩn gây bệnh: lá bị bệnh được thu thập tại các tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long và An Giang. Sau đó, lá bệnh được mang về phòng thí nghiệm phân lập, tách ròng và trữ trên môi trường King’s B ở 4o C. - Nguồn vi khuẩn vùng rễ: gồm 30 chủng vi khuẩn vùng rễ được cung cấp tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật đã ghi nhận có khả năng đối kháng với một trong các loại vi khuẩn và nấm gây bệnh trên cây trồng gồm: Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Acidovorax avenae subsp. citrulli, Erwinia carotovora, Colletotrichum lagenarium và Didymella bryoniae (Bảng 2.1). 15 Bảng 2.1 Đặc điểm các chủng vi khuẩn vùng rễ sử dung trong thí nghiệm Đặc tính đối kháng được ghi nhận Phân lập từ vùng rễ cây trồng STT Mã số 1 2 1 7 Bacillus sp cxđ Ô Môn – Cần Thơ Chợ Mới – An Giang Dưa hấu Khổ qua + A. avenae subsp. citrulli + - 3 18 cxđ 4 5 231-1 28 P. aeruginosa P. fluorescens Cái Bè – Tiền Giang ĐBSCL Dưa hấu Dưa hấu - + - + - - - + Bình Thủy – Cần Thơ Dưa hấu - + - - - - 6 7 38 44 P. fluorescens P. fluorescens Vườn quả – ĐHCT NTCĐ – Cần Thơ Dưa hấu Dưa hấu - + + - - - - 8 53 cxđ 9 10 56 62 P. fluorescens P. fluorescens Chợ Mới – An Giang Chợ Mới – An Giang Khổ qua Khổ qua + + - + - - - Thốt Nốt – Cần Thơ Bắp cải - - - + + - 11 12 64 65 P. fluorescens Pseudomonas sp. Chợ Mới – An Giang Chợ Mới – An Giang Khổ qua Dưa hấu + - - - - + - 13 67 Bacillus sp. 14 15 69 74 P. fluorescens cxđ Vườn quả – ĐHCT Thới Lai – Cần Thơ Dưa hấu Dưa hấu - - + - - - - Thới Lai – Cần Thơ Bắp cải - - - + + - 16 17 77 83 Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. Bình Minh – Vĩnh Long Bình Tân – Vĩnh Long Khổ qua Dưa hấu + - - - - - - 18 96 P. fluorescens Phong Điền – Cần Thơ Dưa hấu - - - - + - Phân loại Vị trí phân lập Ghi chú: 16 R. solana cearum X. campestris pv. vesicatoria E. caroto vora C. lagena rium D. bryoniae - - + - - Bảng 2.1 Đặc điểm các chủng vi khuẩn vùng rễ sử dung trong thí nghiệm (tiếp theo) 19 97 Bacillus sp Bình Thuỷ – Cần Thơ Dưa hấu - - - - - + 20 113 Bacillus sp. 21 22 119 130 Bacillus sp. Pseudomonas sp. Kế Sách – Sóc Trăng Mỹ Xuyên – Sóc Trăng Khổ qua Bắp cải + - - + - - - + Mỹ Xuyên – Sóc Trăng Bắp cải - - - + - - 23 24 150 163 Bacillus sp. P. fluorescens Mỹ Tú – Sóc Trăng Bình Thuỷ – Cần Thơ Bắp cải Dưa hấu - - - - + - + - 25 165 Bacillus sp. 26 27 174 177 P. fluorescens Bacillus sp. Thới Lai – Cần Thơ Phong Điền – Cần Thơ Bắp cải Dưa hấu - - - - + + - Bắp cải - - - - + - 28 29 184 199 Bacillus sp. P. fluorescens Cờ Đỏ – Cần Thơ Phường 8 – Sóc Trăng Cờ Đỏ – Cần Thơ Dưa hấu Dưa hấu - - - - + + + 30 200 Bacillus sp. Bình Thuỷ – Cần Thơ Dưa hấu - - - - + - cđx: Chưa xác định. NTCĐ: Nông trường Cờ Đỏ. ĐHCT: Đại học Cần Thơ ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long +: đối kháng -: không đối kháng 17 2.2. PHƯƠNG PHÁP 2.2.1. Phương pháp thu mẫu bệnh và phân lập vi khuẩn - Phương pháp thu mẫu bệnh: mẫu bệnh thu phải tươi, vết bệnh còn mới và có viền úng nước, không chọn những lá có vết bệnh đã hoại tử nhằm mục đích còn vi khuẩn kí sinh ở giai đoạn đang hoạt động và hạn chế sự hiện diện của nhiều loài vi sinh vật hoại sinh khác. - Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh: mẫu lá thu về được đặt trong túi nylon riêng biệt và ghi nhãn cụ thể và được phân lập ngay trong ngày hoặc một ngày sau đó. Ở phòng thí nghiệm, quan sát dưới kính hiển vi có sự tuôn dòng vi khuẩn nhằm xác định đúng tác nhân gây bệnh trước khi phân lập trên đĩa Petri.  Cách phân lập: + Bước 1: khử trùng bề mặt lam kính. + Bước 2: nhẹ nhàng lau khử trùng bề mặt lá bằng cồn ethanol 70%. + Bước 3: dùng dao đã được khử trùng cắt 1 phần của mẫu lá bệnh (giữa phần mô khỏe và mô bệnh), sau đó cắt nhỏ phần lá bệnh đó. Tiếp tục nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên mẫu bệnh, để khoảng 1-2 phút cho vi khuẩn có đủ thời gian phóng thích vào giọt nước. + Bước 4: dùng micropipette rút 50 µl huyền phù vi khuẩn cho vào đĩa Petri chứa môi trường King’s B. + Bước 5: dùng que cấy vi khuẩn đã được khử trùng vạch giọt huyền phù vi khuẩn theo hình dưới đây. Giọt huyền phù vi khuẩn Hình 2.1 Sơ đồ minh họa đĩa cấy vi khuẩn + Ủ đĩa vi khuẩn trong 48 giờ ở điều kiện phòng thí nghiệm. + Sau đó tiến hành tách ròng vi khuẩn gây bệnh từ khuẩn lạc đơn phát triển từ đĩa cấy mới và vi khuẩn gây bệnh được trữ trong ống nghiệm chứa 18 môi trường King’s B đã tạo mặt nghiêng ở 4oC dùng làm nguồn tác nhân gây bệnh cho các thí nghiệm sau. 2.2.2. Đánh giá khả năng gây hại của các chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện nhà lưới - Mục đích: chọn ra chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. có khả năng gây hại cao nhất từ các chủng vi khuẩn đã phân lập được nhằm phục vụ cho các nghiên cứu phòng trị sau này. - Vật liệu: + Giống hành: giống địa phương được mua tại xã Tân Quới, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long. + Nguồn bệnh: 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. - Phương pháp: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố gồm 5 nghiệm thức (5 chủng vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas sp.) với 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 chậu hành.  Cách lây bệnh: trước và sau khi lây bệnh 1 ngày các chậu hành được chuyển vào phòng ủ bệnh (25 oC), phun huyền phù vi khuẩn với mật số 10 8 cfu/ml lên từng lá hành đến khi ướt đều. Từng chậu hành đã lây bệnh được đặt trong khung có túi nylon giữ ẩm và ủ tối. Sau 24 giờ, chuyển cây ra nhà lưới, phun nước tạo lớp sương bề mặt lá (2 giờ/lần) nhằm duy trì độ ẩm cho vi khuẩn gây bệnh xâm nhiễm đến khi bệnh xuất hiện và tiến hành lấy chỉ tiêu.  Ghi nhận và đánh giá: Theo dõi và ghi nhận sự xuất hiện của bệnh + Tỷ lệ bệnh: đếm số lá bị nhiễm bệnh trong tổng số lá trên chậu. + Cấp bệnh: theo Horsfall-Barratt (1945), bệnh được phân cấp thành 12 cấp có hiệu chỉnh như sau: Cấp 1: Không có bệnh. Cấp 2: Dưới 4% diện tích lá bị bệnh. Cấp 3: Từ 4% đến 8% diện tích lá bị bệnh. Cấp 4: > 8% đến 16% diện tích lá bị bệnh. Cấp 5: > 16% đến 24% diện tích lá bị bệnh. Cấp 6: > 24% đến 32% diện tích lá bị bệnh. Cấp 7: > 32% đến 40% diện tích lá bị bệnh. Cấp 8: > 40% đến 50% diện tích lá bị bệnh. Cấp 9: > 50% đến 60% diện tích lá bị bệnh. Cấp 10: > 60% đến 75% diện tích lá bị bệnh. Cấp 11: > 75% đến 85% diện tích lá bị bệnh. Cấp 12: > 85% đến 100% diện tích lá bị bệnh.  Xử lý số liệu: Số liệu ghi nhận được phân tích xử lý bằng phần mềm thống kê MSTATC (phiên bản 1.2) qua phép thử Duncan. 19 2.2.3. Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện điều kiện in vitro - Mục đích: chọn ra các chủng vi khuẩn vùng rễ cho khả năng đối kháng cao nhất đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. - Vật liệu: + Nguồn vi khuẩn đối kháng: 30 chủng vi khuẩn vùng rễ. + Tác nhân gây bệnh: chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. có khả năng gây hại cao nhất được chọn ra từ thí nghiệm 2.2.2. - Phương pháp: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố gồm 30 nghiệm thức với 4 lần lặp lại.  Chuẩn bị: các chủng vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn Xanthomonas sp. được nuôi trong môi trường King’s B trong 2 ngày để vi khuẩn phát triển tạo khuẩn lạc. Sau đó, đem vi khuẩn cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa môi trường King’s B để vi khuẩn phát triển trong 2 ngày.  Cách thực hiện + Rút 100 µl huyền phù vi khuẩn gây bệnh (Xanthomonas sp.) vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường King's B đặc đã được nấu tan và giữ ấm ở 55 o C. Lắc đều bằng vortex sau đó đổ ra đĩa Petri đã thanh trùng và để nguội. + Nhúng giấy thấm được đục thành khoanh tròn với đường kính 5 mm đã thanh trùng vào ống nghiệm có chứa huyền phù vi khuẩn đối kháng. Sau đó vớt ra để lên giấy thấm đã thanh trùng cho đến khi khoanh giấy khô và đặt khoanh giấy thấm này lên đĩa Petri có chứa vi khuẩn gây bệnh theo 5 điểm đã được đánh dấu trước (Hình 2.2). Tất cả thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Cuối cùng các đĩa Petri được đặt trong tủ úm 28 o C. Vi khuẩn Xanthomonas sp. trong môi trường King’s B VK 1 VK 4 VK 5 VK 2 Vi khuẩn vùng rễ VK 3 Hình 2.2 Cách bố trí các chủng vi khuẩn đối kháng 20  Ghi nhận và đánh giá: ghi nhận chỉ tiêu bán kính vòng vô khuẩn (mm) vào 1, 3 và 5 ngày sau khi cấy. Số liệu ghi nhận được phân tích xử lý bằng phần mềm thống kê MSTATC (phiên bản 1.2) qua phép thử Duncan. 2.2.4. Đánh giá khả năng đối kháng của các loại thuốc hóa học đối vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện in vitro - Mục đích: nhằm tìm ra thuốc hoá học có hiệu quả cao trong việc ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. trong điều kiện in vitro. - Vật liệu: + Chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. có khả năng gây hại cao nhất được chọn ra từ thí nghiệm 2.2.2. + 8 loại thuốc hóa học (Bảng 2.2). Bảng 2.2 Các loại thuốc hóa học được sử dụng trong thí nghiệm STT 1 2 3 4 5 6 7 8 Tên thuốc Hoạt chất Bordeaux 1% Ca(OH)2 + CuSO 4 Ditacin 8SL Kasumin 2SL Starner 20WP Super cook 85WP Visen 20SC Ningnamycin Kasugamycin Oxolinic axid Copper oxychloride Nước vôi 10% Xantocin 40WP Copper salt of 5,5′(methylenediimino)bis(1, 3,4-thiadiazole-2-thiol) Canxi hydroxit Bronopol Liều lượng sử dụng/50ml nước 0,5 g Ca + 0,5 g CuSO 4 0,034 ml 0,125 ml 0,063 g 0,117 g 0,039 ml 5g 0,035 g - Phương pháp: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 8 nghiệm thức với 4 lần lặp lại.  Chuẩn bị: vi khuẩn Xanthomonas sp. được nuôi trong môi trường King’s B trong 2 ngày để vi khuẩn phát triển tạo khuẩn lạc. Sau đó đem vi khuẩn cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa môi trường King’s B để vi khuẩn phát triển trong 2 ngày.  Cách thực hiện: + Rút 100 µl huyền phù vi khuẩn gây bệnh (Xanthomonas sp.) vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường King's B đặc đã được nấu tan và giữ ấm ở 55 o C. Lắc đều bằng vortex sau đó đỗ ra đĩa Petri đã thanh trùng và để nguội. 21 + Mỗi loại thuốc được pha theo nồng độ khuyến cáo chứa trong ống nghiệm. + Nhúng giấy thấm được đục thành khoanh tròn với đường kính 5 mm đã thanh trùng vào ống nghiệm có chứa dung dịch thuốc hóa học. Sau đó vớt ra để lên giấy thấm đã thanh trùng cho đến khi khoanh giấy khô, dùng kẹp gấp lần lượt các khoanh giấy thấm thuốc đặt lên đĩa Petri có chứa vi khuẩn gây bệnh theo thứ tự các điểm đã được đánh dấu trước (Hình 2.3). Mỗi lần thay đổi loại thuốc phải thay đổi kẹp hoặc rửa sạch lại bằng nước cất . + Mang các đĩa Petri đã bố trí đặt vào tủ úm rồi tiến hành theo dõi và quan sát để lấy chỉ tiêu. Vi khuẩn Xanthomonas sp. trong môi trường King’s B Thuốc 1 Thuốc 4 Thuốc hóa học Thuốc 3 Thuốc 2 Hình 2.3 Cách bố trí các loại thuốc hóa học đối kháng với vi khuẩn  Ghi nhận và đánh giá: ghi nhận chỉ tiêu bán kính vòng vô khuẩn (mm) vào 1, 3 và 5 ngày sau khi cấy. Số liệu ghi nhận được phân tích xử lý bằng phần mềm thống kê MSTATC (phiên bản 1.2) qua phép thử Duncan. 2.2.5. Đánh giá hiệu quả phòng trị của hai chủng vi khuẩn đối kháng và hai loại thuốc hoá học đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện nhà lưới - Mục đích: nhằm đánh giá hiệu quả của hai chủng vi khuẩn đối kháng và 2 loại thuốc ức chế cao nhất đối với bệnh đốm lá hành do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới và tìm ra biện pháp xử lý đạt hiệu quả phòng trị cao để ứng dụng ngoài đồng. - Vật liệu: + Nguồn vi khuẩn lây bệnh: chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. có khả năng gây hại cao nhất được chọn ra từ thí nghiệm 2.2.2. 22 + Nguồn vi khuẩn đối kháng: hai chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng đối kháng cao nhất với vi khuẩn gây bệnh đốm lá hành (Xanthomonas sp.) được chọn ra từ thí nghiệm 2.2.3. + Thuốc hóa học: hai loại thuốc hóa học (Starner 20WP và Xantocin 40WP) có khả năng đối kháng cao nhất với vi khuẩn gây bệnh đốm lá hành (Xanthomonas sp.) được chọn ra từ thí nghiệm 2.2.4. + Giống hành: giống địa phương được mua tại xã Tân Quới, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long. - Phương pháp: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 9 nghiệm thức với 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một chậu hành.  Chuẩn bị: + Nguồn vi khuẩn lây bệnh: vi khuẩn Xanthomonas sp. được nuôi cấy trên đĩa Petri chứa môi trường King’s B trong 2 ngày. Sau đó dùng nước muối sinh lý 0,9% hòa thành huyền phù vi khuẩn. Lắc đều và pha loãng bằng nước cất thanh trùng đạt mật số 10 8 cfu/ml dựa trên đường chuẩn vi khuẩn. + Nguồn vi khuẩn đối kháng: hai chủng vi khuẩn đối kháng 28 và 64 được nuôi cấy trên từng đĩa Petri riêng biệt chứa môi trường King’s B trong 2 ngày. Sau đó dùng nước muối sinh lý 0,9% hoàn thành huyền phù vi khuẩn. Lắc đều và pha loãng đạt mật số 10 8 cfu/ml dựa trên đường chuẩn vi khuẩn. + Thuốc hóa học: mỗi loại thuốc (Starner 20WP và Xantocin 40WP) được pha theo nồng độ khuyến cáo của nhà sản xuất.  Cách thực hiện: Mỗi chủng vi khuẩn vùng rễ và mỗi loại dung dịch thuốc được phun ở 2 thời điểm: 1 ngày trước khi lây bệnh và 1 ngày sau khi lây bệnh. + Nghiệm thức 1: phun lên lá 20 ml chủng vi khuẩn 28 ở mật số 10 8 cfu/ml vào 1 ngày trước khi lây bệnh (28 T). + Nghiệm thức 2: phun lên lá 20 ml chủng vi khuẩn 64 ở mật số 10 8 cfu/ml vào 1 ngày trước khi lây bệnh (64 T). + Nghiệm thức 3: phun lên lá 20 ml dung dịch thuốc Starner 20WP vào 1 ngày trước khi lây bệnh (Star T). + Nghiệm thức 4: phun lên lá 20 ml dung dịch thuốc Xantocin 40WP vào 1 ngày trước khi lây bệnh (Xan T). + Nghiệm thức 5: phun lên lá 20 ml chủng vi khuẩn 28 ở mật số 10 8 cfu/ml vào 1 ngày sau khi lây bệnh (28 S). + Nghiệm thức 6: phun lên lá 20 ml chủng vi khuẩn 64 ở mật số 10 8 cfu/ml vào 1 ngày sau khi lây bệnh (64 S). + Nghiệm thức 7: phun lên lá 20 ml dung dịch thuốc Starner 20WP vào 1 ngày sau khi lây bệnh (Star S). 23 + Nghiệm thức 8: phun lên lá 20 ml dung dịch thuốc Xantocin 40WP vào 1 ngày sau khi lây bệnh (Xan S). + Nghiệm thức đối chứng: lây bệnh không xử lí vi khuẩn vùng rễ và thuốc hóa học (ĐC). Cách lây bệnh: trước và sau khi lây bệnh 1 ngày các chậu hành được chuyển vào phòng ủ bệnh (25 oC). Sau đó, cây được phun đều với huyền phù vi khuẩn (10 8 cfu/ml) Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá. Từng chậu hành đã lây bệnh được đặt trong khung có túi nylon giữ ẩm và ủ tối. Sau 24 giờ, chuyển c ây ra nhà lưới, phun nước tạo lớp sương bề mặt lá (2 giờ/lần) nhằm duy trì độ ẩm cho vi khuẩn gây bệnh xâm nhiễm đến khi bệnh xuất hiện và tiến hành lấy chỉ tiêu.  Ghi nhận và đánh giá: + Theo dõi và ghi nhận sự xuất hiện của bệnh giống thí nghiệm 2.2.2. + Xử lý số liệu: số liệu ghi nhận được phân tích xử lý bằng phần mềm thống kê MSTATC (phiên bản 1.2) qua phép thử Duncan. 24 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY HẠI CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN XANTHOMONAS SP. 3.1.1. Kết quả phân lập Quá trình thu mẫu bệnh và lây bệnh nhân tạo được thực hiện tuần tự theo quy trình Koch, kết quả bước đầu phân lập được 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. từ các ruộng hành thuộc các tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long và An Giang (Bảng 3.1). Vi khuẩn sau khi được nuôi cấy trên môi trường King’s B hình thành các khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bóng, với rìa mịn, có màu vàng đặc trưng của chi Xanthomonas và không phát huỳnh quang. Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. phân lập được từ các ruộng hành ở các tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long và An Giang STT Mã số Địa điểm thu mẫu bệnh 1 Xan TN-CT3 Quận Thốt Nốt – thành phố Cần Thơ 2 Xan BT-VL4 Xã Tân Quới – huyện Bình Tân – tỉnh Vĩnh Long 3 Xan CM-AG6 Xã Kiến An – huyện Chợ Mới – tỉnh An Giang 4 Xan CM-AG8 Xã Kiến An – huyện Chợ Mới – tỉnh An Giang 5 Xan CM-AG9 Xã Kiến An – huyện Chợ Mới – tỉnh An Giang Sau khi phân lập được 5 chủng vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên hành. Tiến hành chủng bệnh nhân tạo trên những cây hành sạch bệnh bằng cách phun huyền phù vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá với mật số 10 8 cfu/ml lên lá hành. Triệu chứng của bệnh bắt đầu biệu hiện rõ ở thời điểm 2 ngày sau khi lây bệnh (NSKLB). Đầu tiên là sự xuất hiện của những đốm úng nước nhỏ màu trắng trong ở trên mặt lá hoặc hai bên mép lá, bệnh gây hại nặng trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ cao, các vết bệnh lớn dần và liên kết lại tạo thành các khu vực bị hoại tử một phần hoặc cả lá. Kết quả này giống như triệu chứng ban đầu khi thu mẫu ngoài đồng và phù hợp với miêu tả của Alvarez và ctv. (1978); Roumagnac và ctv. (2004b). 25 A B C Hình 3.1 Triệu chứng bệnh đốm lá trên hành do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra (A), (B): Triêu chứng bệnh ban đầu (C): Triệu chứng khi bệnh tiến triển nặng 3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng gây hại Thí nghiệm đánh giá khả năng gây hại của 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố trong điểu kiện nhà lưới. Kết quả thí nghiệm được ghi nhận thông qua chỉ tiêu tỷ lệ bệnh và cấp bệnh được trình bài trong Bảng 3.2 và Bảng 3.3. Qua kết quả tỷ lệ bệnh Bảng 3.2, nhìn chung qua 4 thời điểm khảo sát cho thấy mức độ gây hại của 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. là tương đối cao và có sự khác biệt thống kê giữa 5 chủng ở mức ý nghĩa 5%. Ở thời điểm 2 NSKLB, bệnh vừa mới xuất hiện nên tỷ lệ bệnh giữa 5 chủng vi khuẩn gây ra chưa cao từ 2,5 đến 47,7%. Trong đó, hai chủng vi khuẩn Xan TNCT3 và Xan CM-AG6 với tỷ lệ bệnh lần lượt là 47,7% và 41,4%, cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với các chủng vi khuẩn còn lại. Bên cạnh đó, hai chủng vi khuẩn có tỷ lệ bệnh thấp nhất là chủng Xan BT-VL4 (2,5%) và Xan CM-AG8 (2,8%). Ở thời điểm 3 NSKLB, tỷ lệ bệnh trên chậu do các chủng vi khuẩn gây ra đều tăng, trong đó các chủng vi khuẩn Xan TN-CT3 (50,9%), Xan CM-AG6 (50,1%) và Xan CM-AG9 (38,1%) có tỷ lệ bệnh cao hơn và khác biệt với các chủng vi khuẩn còn lại. Hai chủng vi khuẩn Xan BT-VL4 và Xan CM-AG8 vẫn là hai chủng có tỷ lệ bệnh thấp nhất với tỷ lệ bệnh lần lượt là 13,7% và 13,8%. Tương tự, ở điểm 4 NSKLB, tỷ lệ bệnh trên chậu do các chủng vi khuẩn gây ra đều tăng, trong đó ba chủng vi khuẩn Xan TN-CT3 (57,1%), Xan CM-AG6 (56,4%) và Xan CM-AG9 (45,0%) vẫn duy trì khả năng gây hại cao hơn và khác biệt với chủng vi khuẩn Xan BT-VL4 (25%). 26 Đến thời điểm 5 NSKLB, mức độ tỷ lệ bệnh trên chậu do các chủng vi khuẩn gây ra trở nên trầm trọng, trong đó ba chủng vi khuẩn có tỷ lệ bệnh cao nhất là chủng Xan TN-CT3, Xan CM-AG6 và Xan CM-AG9 với tỷ lệ bệnh lần lượt là 60,2%, 61,1% và 55,0%; cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với hai chủng vi khuẩn còn lại Xan BT-VL4 (29,3%) và Xan CM-AG8 (36,0%). Nhìn chung, trung bình qua 4 thời điểm khảo sát cho thấy khả năng gây hại của 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. là khá cao và tăng theo từng giai đoạn khảo sát. Trong đó hai chủng vi khuẩn Xan TN-CT3 và Xan CM-AG6 đều có khả năng gây hại cao nhất và như nhau, kế đến là chủng Xan CM-AG9, và sau cùng là hai chủng vi khuẩn Xan BT-VL4 và Xan CM-AG8 có khả năng gây hại thấp hơn. Bảng 3.2 Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới qua các ngày sau khi lây bệnh Chủng vi khuẩn Xan TN-CT3 Xan BT-VL4 Xan CM-AG6 Xan CM-AG8 Xan CM-AG9 Mức ý nghĩa CV(%) 2 NSKLB 47,7 a 2,5 c 41,4 a 2,8 c 22,4 b * 29,5 Tỷ lệ bệnh (%) qua các thời điểm 3 NSKLB 4 NSKLB 50,9 a 57,1 a 13,7 b 25,0 c 50,1 a 56,4 a 13,8 b 33,7 bc 38,1 a 45,0 ab * * 20,2 14,9 5 NSKLB 60,2 a 29,3 b 61,1 a 36,0 b 55,0 a * 18,0 Ghi chú: Trong cùng một cột những chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% theo phép thử Duncan. *: Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Tỷ lệ phần trăm bệnh đốm lá được chuyển đổi sang arcsin khi phân tích thống kê. Qua kết quả cấp bệnh đốm lá Bảng 3.3 cho thấy mức độ nhiễm bệnh đốm lá trên hành do 5 chủng vi khuẩn gây ra có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. Ở thời điểm 2 NSKLB, do bệnh mới xuất hiện nên cấp bệnh do các chủng vi khuẩn gây ra chưa cao và không có sự khác biệt ý nghĩa giữa các chủng vi khuẩn. Ở thời điểm 3 NSKLB, cấp bệnh trên chậu do các chủng vi khuẩn gây ra bắt đầu có sự khác biệt về mặt thống kê. Chủng Xan CM-AG6 có cấp bệnh là 4,0; cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với các chủng vi khuẩn còn lại, kế đến là chủng Xan TNCT3 (3,3). Chủng Xan BT-VL4, Xan CM-AG8 và Xan CM-AG9 là ba chủng vi khuẩn có cấp bệnh thấp nhất và không khác biệt ý nghĩa với cấp bệnh lần lượt là 2,0; 2,0 và 2,3. Đến thời điểm 4 NSKLB, cấp bệnh trên chậu do các chủng vi khuẩn gây ra đều tăng, trong đó hai chủng Xan TN-CT3 và Xan CM-AG6 với cấp bệnh tuần tự là 7,8 và 7,5; cao hơn và khác biệt hơn so với các chủng còn lại. 27 Đến thời điểm 5 NSKLB, cấp bệnh trên lá do các chủng vi khuẩn gây ra tăng cao, trong đó bốn chủng vi khuẩn có cấp bệnh cao đó là chủng Xan TN-CT3, Xan CM-AG6, Xan CM-AG8 và Xan CM-AG9 với cấp bệnh tuần tự là 10,3; 10,0; 9,0 và 8,3 không khác biệt thống kê. Tuy nhiên, hai chủng vi khuẩn Xan TN-CT3, Xan CM-AG6 có cấp bệnh cao hơn và khác biệt với chủng Xan BT-VL4. Qua các thời điểm khảo sát cho thấy cấp bệnh do 5 chủng vi khuẩn gây ra là khác nhau. Trong đó, chủng Xan CM-AG6 là chủng có cấp bệnh cao và duy trì khả năng gây hại bền vững qua các ngày khảo sát. Bảng 3.3 Cấp bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trongđiều kiện nhà lưới qua các ngày sau khi lây bệnh Cấp bệnh trên chậu qua các thời điểm Chủng vi khuẩn 2 NSKLB 3 NSKLB 4 NSKLB 5 NSKLB Xan TN-CT3 2,0 3,3 b 7,8 a 10,3 a Xan BT-VL4 1,5 2,3 c 3,5 b 7,5 b Xan CM-AG6 2,0 4,0 a 7,5 a 10,0 a Xan CM-AG8 1,5 2,0 c 4,3 b 9,0 ab Xan CM-AG9 2,0 2,0 c 5,3 b 8,3 ab Mức ý nghĩa CV(%) ns 20,3 * 17,9 * 23,4 * 15,8 Ghi chú: Trong cùng một cột những chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% theo phép thử Duncan. *: Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%, ns: không khác biệt ý nghĩa. Tóm lại, qua kết quả từ Bảng 3.2 và Bảng 3.3 cho thấy khả năng gây bệnh của cả 5 chủng vi khuẩn được thể hiện thông qua tỷ lệ bệnh và cấp bệnh. Trong đó, chủng Xan CM-AG6 là chủng vi khuẩn có khả năng gây hại cao và ổn định qua các thời điểm được thu thập tại xã Kiến An – huyện Chợ Mới – tỉnh An Giang thông qua tỷ lệ bệnh và cấp bệnh. Do đó, chủng vi khuẩn Xan CM-AG6 được chọn để phục vụ cho các nghiên cứu phòng trị tiếp theo. Từ đó thấy rằng mỗi chủng vi khuẩn khác nhau thì khả năng gây hại cũng khác nhau, có thể nguyên nhân của sự khác biệt này là do mỗi chủng vi khuẩn có thể có đặc tính di truyền khác nhau về khả năng gây bệnh trên cùng loại kí chủ, kết quả này cũng thể hiện theo quy luật gen đối gen của Flor (1971), chủng vi khuẩn gây độc trên kí chủ này do sỡ hữu gen gây độc đối với kí chủ, trong khi chủng vi khuẩn khác thì không. Thực vậy, kết quả thí nghiệm này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Vũ Cương (2011), trong việc đánh giá khả năng gây hại của các chủng vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. vesicatoria phân lập từ các mẫu ớt bệnh thu được từ các tỉnh Vĩnh Long, Trà Vinh và An Giang. Kết quả thu được cho thấy chủng vi khuẩn gây hại X4 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) được phân lập từ ruộng ớt thuộc xã Kiến An – huyện Chợ Mới – tỉnh An Giang có khả năng gây hại cao nhất. 28 Theo kết quả nghiên cứu của Roumagnac và ctv. (2004b), thấy rằng vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. allii là nguyên nhân gây hại nghiêm trọng trên hành và một số loại thuộc họ hành khác. Hơn nữa, sự bùng phát của vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv. allii trên các loài thực vật là khác nhau. Bên cạnh đó, bệnh đốm lá trên hành được ghi nhận gây hại nặng ở các vùng địa lí khác nhau như các tiểu bang của Hoa Kỳ (Isakeit và ctv., 2000; Schwartz và ctv., 2000; Nunez và ctv., 2002; Sanders và ctv., 2003), Nhật Bản (Kadota và ctv., 2000), Cộng hòa Nam Phi (Serfontein, 2001), quần đảo Caribbean (O’Garro và Paulraj, 1997), đảo Réunion (Roumagnac và ctv., 2000) và Úc (Persley và ctv., 2010). 29 Xan TN-CT3 Xan BT-VL4 Xan CM-AG6 Xan CM-AG8 Hình 3.2 Triệu chứng bệnh đốm lá do các chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra ở thời điểm 5 NSKLB 30 Xan CM-AG9 3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÙNG RỄ ĐỐI VỚI VI KHUẨN XANTHOMONAS SP. CM-AG6 GÂY BỆNH ĐỐM LÁ HÀNH TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của 30 chủng vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 cho thấy có 9 chủng vi khuẩn vùng rễ thể hiện khả năng đối kháng thông qua sự hình thành vòng vô khuẩn. Khi thực hiện so sánh khả năng đối kháng của các chủng này, kết quả trình bày Bảng 3.4 cho thấy: Ở thời điểm 1 NSKC, chỉ có 5 chủng thể hiện khả năng đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6. Trong đó, chủng vi khuẩn 64 (P. fluorescens) là chủng thể hiện khả năng đối kháng cao nhất với bán kính vòng vô khuẩn là 4,1 mm và khác biệt ý nghĩa so với các chủng vi khuẩn còn lại, kế đến là chủng vi khuẩn 74 (chưa xác định) và 28 (P. fluorescens) với bán kính vòng vô khuẩn lần lượt là 2,5 mm và 2,3 mm không khác biệt nhau và khác biệt với các chủng vi khuẩn còn lại. Ở thời điểm 3 NSKC, có tổng cộng 9 chủng vi khuẩn vùng rễ thể hiện khả năng đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6. Trong đó, bán kính vòng vô khuẩn của chủng 28 (P. fluorescens) gia tăng một cách mạnh mẽ, với bán kính vòng vô khuẩn là 15,4 mm; cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với các chủng vi khuẩn còn lại. Kế đến là chủng 62 (P. fluorescens) và 64 (P. fluorescens) với bán kính vòng vô khuẩn lần lượt là 6,5 mm và 6,3 mm. Chủng vi khuẩn thể hiện khả năng đối kháng thấp nhất là 97 (chưa xác định) với bán kính vòng vô khuẩn là 1,1 mm. Đến thời điểm 5 NSKC, có nhiều biến đổi đối với bán kính vòng vô khuẩn của các chủng vi khuẩn. Trong đó, có 5 chủng vi khuẩn có bán kính vòng vô khuẩn tăng bao gồm 62 (P. fluorescens), 64 (P. fluorescens), 74 (chưa xác định), 130 (Pseudomonas sp.) và 199 (P. fluorescens) với bán kính vòng vô khuẩn lần lượt là 7,3 mm, 7,0 mm, 4,1 mm, 6,1 mm và 5,4 mm. Chủng P. aeruginosa 23 1-1 và 97 (chưa xác định) không còn thể hiện khả năng đối kháng. Bên cạnh đó, bán kính vòng vô khuẩn của các chủng 28 (P. fluorescens) và 38 (P. fluorescens) cũng giảm xuống 12,3 mm và 1,0 mm. Mặc dù vậy, chủng 28 (P. fluorescens) vẫn là chủng có bán kính vòng vô khuẩn cao nhất và khác biệt ý nghĩa so với các chủng còn lại. Qua ba thời điểm khảo sát cho thấy 9 trong tổng số 30 chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6. Trong đó chủng 28 (P. fluorescens) là chủng thể hiện khả năng đối kháng cao nhất, cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với các chủng vi khuẩn còn lại, kế đến là chủng 64 (P. fluorescens). Do đó, hai chủng vi khuẩn 28 (P. fluorescens) và 64 (P. fluorescens) đều thể hiện khả năng đối kháng cao nên được chọn là tác nhân phòng trị sinh học bệnh đốm lá do vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới. Theo Siddiqui (2006), nhóm vi khuẩn P. fluorescens có tiềm năng cao trong phòng trừ sinh học vì chúng có nhiều ưu điểm. 31 Thật vậy, nhóm vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được ghi nhận chiếm mật số cao và là tác nhân phòng trừ sinh học rất hiệu quả đối với nhiều bệnh trên những cây trồng khác nhau (Yan và ctv., 2002; Nguyễn Thị Thu Nga, 2007). Cơ chế phòng trị bệnh của nhóm vi khuẩn này có liên quan đến những đặc tính như sau: - Chúng tiết ra rất nhiều loại chất kháng sinh ức chế nhiều tác nhân gây bệnh như 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) (Leij, 2002), pyrrolnitrin (PRN) (Cartwright và ctv., 1995), pyoluteorin (PLT), phenazine-1-carboxyclic acid (PCA), 2-hydroxy phenazines, phenazine-1-carboxamide (PCN) ( Fernado và ctv., 2006),.. Đặc biệt nhóm P. fluorescens ức chế vi khuẩn bằng cách tiết ra các Pseudomonic acid (Fuller và ctv., 1971) và Azomycin (Shoji và ctv., 1990). - P. fluorescens còn có khả năng tiết ra một số enzyme phân hủy vách tế bào nấm như chitinase, β-1,3-glucanase và protease (Trích dẫn Siddiqui, 2006). Bên cạnh đó, trong điều kiện in vitro nhóm vi khuẩn này đã được ghi nhận là có khả năng đối kháng với vi khuẩn Acidovorax avenae subsp. citrulli gây bệnh cháy lá và đốm trái dưa hấu (Đoàn Thị Kiều Tiên, 2010), Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên khổ qua (Nguyễn Lê Kim Ngân, 2011), Erwinia carotovora gây bệnh thối nhũn trên bắp cải (Phạm Thị Thắm, 2011) và Xanthomonas campestris pv. vesicatoria gây bệnh đốm lá trên ớt (Nguyễn Vũ Cương, 2011). Hơn thế nữa, trong nghiên cứu của Đoàn Thị Kiều Tiên (2010), chủng vi khuẩn vùng rễ 28 (P. fluorescens) cũng đã được ghi nhận đối kháng cao với vi khuẩn Acidovorax avenae subsp. citrulli gây bệnh cháy lá và đốm trái dưa hấu với bán kính vòng vô khuẩn là 6,6 mm. Chủng vi khuẩn vùng rễ 64 (P. fluorescens) được ghi nhận đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên khổ qua với bán kính vòng vô khuẩn là 3,5 mm (Đặng Kim Đào, 2010). 32 Bảng 3.4 Khả năng đối kháng của 9 chủng vi khuẩn vùng rễ với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 qua các thời điểm 1, 3 và 5 ngày sau khi cấy STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Chủng Mã số 231-1 P. aeruginosa 28 P. fluorescens 38 P. fluorescens 62 P. fluorescens 64 P. fluorescens 74 cxđ 97 cxđ 130 Pseudomonas sp. 199 P. fluorescens Mức ý nghĩa CV(%) Bán kính vòng vô khuẩn (mm) qua các thời điểm 1 NSKC 3 NSKC 5 NSKC 0,0 d 1,9 e 0,0 g 2,3 b 15,4 a 12,3 a 1,4 c 2,6 d 1,0 f 0,0 d 6,5 b 7,3 b 4,1 a 6,3 b 7,0 b 2,5 b 4,0 c 4,1 e 1,1 c 1,1 f 0,0 g 0,0 d 3,8 c 6,1 c 0,0 d 2,3 de 5,4 d * * * 20,1 9,7 10,7 Ghi chú: Trong cùng một cột những chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% theo phép thử Duncan. *: Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% 28 64 74 Hình 3.3 Bán kính vòng vô khuẩn của vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 trong điều kiện in vitro ở thời điểm 3 NSKC 33 3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC LOẠI THUỐC HÓA HỌC ĐỐI VỚI VI KHUẨN XANTHOMONAS SP. CM-AG6 GÂY BỆNH ĐỐM LÁ HÀNH TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của 8 loại thuốc hóa học đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 cho thấy có 2 loại thuốc thể hiện hiệu quả ức chế vi khuẩn này đó là Starner 20WP (Oxolinic acid) và Xantocin 40WP (Bronopol). Hiệu quả đối kháng được trình bày ở Bảng 3.5 cho thấy: Ở thời điểm 1 NSKC, thuốc Xantocin 40WP với bán kính vòng vô khuẩn là 5,9 mm cho hiệu quả đối kháng cao hơn và khác biệt với thuốc Starner 20WP có bán kính vòng vô khuẩn là 3,9 mm. Đến thời điểm 3 NSKC, bán kính vòng vô khuẩn do hai loại thuốc này tạo ra đều tăng, tuy nhiên trong giai đoạn này thuốc Starner 20WP lại cho hiệu quả cao hơn với bán kính vòng vô khuẩn là 7,9 mm khác biệt ý nghĩa so với thuốc Xantocin 40WP (6,0 mm). Tương tự, đến thời điểm 5 NSKC, thuốc Starner 20WP có bán kính vòng vô khuẩn không thay đổi nhưng vẫn thể hiện hiệu quả cao hơn so với Xantocin 40WP, bán kính vòng vô khuẩn do Xantocin 40WP tạo ra ở giai đoạn này đã giảm từ 6,0 mm xuống 5,8 mm. Nhìn chung qua ba thời điểm khảo sát, chỉ có 2 trong tổng số 8 loại thuốc thể hiện khả năng đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6. Mặc dù vậy, cả hai loại thuốc (Starner 20WP và Xantocin 40WP) đều thể hiện khả năng đối cao và tương đối ổn định qua các thời điểm khảo sát. Theo Hikichi và ctv. (1989), oxolinic acid có khả năng kiểm soát được các bệnh do vi khuẩn trên lúa, hoa màu chẳng hạn như bắp cải, khoai tây và hành tây. Oxolinic acid có khả năng đối kháng với nhiều loại vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn Gram âm, điều trị bằng oxolinic acid ở giai đoạn trổ bông ức chế sự gia tăng mật số vi khuẩn trên bông con và hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh lép vàng hạt lúa gây ra bởi Burkholderia sp. (Hikichi, 1993). Hiệu quả của oxolinic cũng được ghi nhận đối với vi khuẩn Erwinia amylovora, khi được đánh giá trong 43 vườn cây ăn quả được thí nghiệm ở Israel với nồng độ là 300 mg/ml, kết quả cho thấy oxolinic acid hiệu quả cao và làm giảm đáng kể mức độ nghiêm trọng của bệnh trong tất cả các thí nghiệm (Shtienberg và ctv., 2001). Thực vậy, theo Ngô Thị Ngọc Yến (2010), thuốc Starner 20WP có khả năng ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá trên hồng. Hiệu lực của Starner vẫn tiếp tục được kiểm chứng và thu được nhiều kết quả tích cực qua công trình nghiên cứu của Vũ Xuân Thắng (2013), trong việc phòng trị thối củ gừng do vi khuẩn Ralstonia solanacearum và cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Khấu Vũ Linh, 2013). Điều này cho thấy thuốc Starner 20WP có khả năng ức chế trực tiếp sự phát triển của vi khuẩn. Bên cạnh đó, Thuốc Xantocin 40WP (Bronopol) có một cơ chế kháng khuẩn phức tạp và phổ rộng. Hiệu quả của hoạt chất được thể qua khả năng ức chế các loại 34 vi khuẩn gây hại như Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Xanthomonas campestris pv. malvacearum và Erwinia amylovora (BASF, 2009). Theo nghiên cứu của Wong (1985), hoạt chất bronopol giúp chống lại bệnh đốm vi khuẩn do Pseudomonas tolaasii gây ra trong ngành công nghiệp trồng nấm. Theo nghiên cứu của Phan Quốc Huy (2013), thuốc Xanthocin 40WP có khả năng ức chế vi khuẩn Burkholderia glumae gây bệnh lép vàng trên lúa trong điều kiện in vitro. Do đó, Starner 20WP và Xantocin 40WP được chọn để đánh giá khả năng phòng trị bệnh đốm lá trên hành (Xanthomonas sp. CM-AG6) trong điều kiện nhà lưới. Bảng 3.5 Khả năng đối kháng của các loại thuốc hóa học với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 qua các thời điểm 1, 3 và 5 ngày sau khi cấy. STT Bán kính vòng vô khuẩn (mm) qua các thời điểm Tên thương mại 1 Bordeaux 1 NSKC 0,0 c 2 Ditacin 8SL 0,0 c 0,0 c 0,0 c 3 Kasumin 2SL 0,0 c 0,0 c 0,0 c 4 Starner 20WP 3,9 b 7,9 a 7,9 a 5 Super cook 85WP 0,0 c 0,0 c 0,0 c 6 Visen 20SC 0,0 c 0,0 c 0,0 c 7 Nước Vôi 10% 0,0 c 0,0 c 0,0 c 8 Xantocin 40WP 5,9 a 6,0 b 5,8 b Mức ý nghĩa CV (%) 3 NSKC 0,0 c 5 NSKC 0,0 c * * * 10,3 5,1 11,6 Ghi chú: Trong cùng một cột những chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% theo phép thử Duncan. *: Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. 35 Xantocin 40WP Starner 20WP Hình 3.4 Bán kính vòng vô khuẩn của các loại thuốc hóa học đối với Xanthomonas sp. CM-AG6 trong điều kiện in vitro ở thời điểm 3 NSKC 36 3.4. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ CỦA HAI CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG VÀ HAI LOẠI THUỐC HOÁ HỌC ĐỐI VỚI VI KHUẨN XANTHOMONAS SP. CM-AG6 GÂY BỆNH ĐỐM LÁ HÀNH TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI Thí nghiệm đánh giá hiệu quả phòng trị của hai chủng vi khuẩn và hai loại thuốc hóa học qua hai biện pháp xử lý (phun trước khi lây bệnh 1 ngày và sau khi lây bệnh 1 ngày) đối với bệnh đốm lá hành do vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố trong điều kiện nhà lưới. Kết quả thí nghiệm được ghi nhận thông qua chỉ tiêu tỷ lệ bệnh và cấp bệnh được trình bày trong Bảng 3.6 và Bảng 3.7. Qua kết quả tỷ lệ bệnh Bảng 3.6, nhìn chung ở 4 thời điểm khảo sát cho thấy hai chủng vi khuẩn đối kháng và hai loại thuốc hóa học qua hai biện pháp xử lí (phun trước và sau khi lây bệnh 1 ngày) đều thể hiện hiệu quả phòng trị bệnh khác biệt so với đối chứng ở mức ý nghĩa 5%. Tuy nhiên, chưa có sự khác biệt rõ rệt giữa các nghiệm thức. Ở thời điểm 3 NSKLB, bệnh vừa mới xuất hiện nhưng đã có sự khác biệt trong khả năng thể hiện hiệu quả phòng trị của các nghiệm thức. Trong đó, nghiệm thức Star T, Xan T và Star S là ba nghiệm thức có tỷ lệ bệnh thấp nhất với tỷ lệ bệnh lần lượt là 13,0%; 12,3% và 12,2% thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại, nhưng không thể hiện sự khác biệt so với nghiệm thức 28 T (15,5%). Ở thời điểm 5 NSKLB, các nghiệm thức 28 T, Star T, Xan T, 64 S, Star S và Xan S với tỷ lệ bệnh lần lượt là 25,8%; 27,4%; 26,2%; 29,9%; 27,2% và 30,1% thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (42%), nhưng không thể hiện sự khác biệt so với nghiệm thức 64 T (34,4%) và 28 S (32,1%). Ở thời điểm 7 NSKLB, nghiệm thức 28 T, Star T, Xan T, 28 S, 64 S, Star S và Xan S với tỷ lệ bệnh lần lượt là 38,6%; 37%; 40,1%; 41,9%; 43,2%; 35,7% và 39,2% thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với nghiệm đối chứng (54,6%). Nghiệm thức 64 T (46,9%) không thể hiện hiệu quả. Đến thời điểm 9 NSKLB, nghiệm thức Star T (47,7%) và Xan S (48,1%) có tỷ lệ bệnh thấp nhất, thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Tuy nhiên, không thể hiện sự khác biệt đối với các nghiệm thức 28 T (50,2%), Xan T (54,2%), 28 S (56,0%), 64 S (56,9%) và Star S (50,4%). Trong khi nghiệm thức đối chứng với tỷ lệ bệnh là 73,4%. Nhìn chung qua 4 thời điểm khảo sát hai loại thuốc hóa học và hai chủng vi khuẩn vùng rễ qua hai biện pháp xử lý đều cho thấy khả năng khống chế bệnh. Trong đó, thuốc Starner 20WP qua hai biện pháp xử lý (phun trước khi lây bệnh 1 ngày và sau khi lây bệnh 1 ngày) và thuốc Xantocin 40WP cùng với chủng vi khuẩn 37 vùng rễ 28 (P. fluorescens) ở biện pháp phun trước khi lây bệnh 1 ngày thể hiện rõ nhất khả năng làm giảm tỷ lệ bệnh khá tốt. Bảng 3.6 Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do khuẩn Xanthomonas sp. chủng CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới qua các ngày Nghiệm thức 3NSKLB Tỷ lệ bệnh (%) qua các thời điểm 5NSKLB 7 NSKLB 9 NSKLB 28 T 15,5 cd 25,8 b 38,6 b 50,2 bc 64 T 21,5 b 34,4 ab 46,9 ab 58,2 b Star T 13,0 d 27,4 b 37,0 b 47,7 c Xan T 12,3 d 26,2 b 40,1 b 54,2 bc 28 S 20,9 bc 32,1 ab 41,9 b 56,0 bc 64 S 20,4 bc 29,9 b 43,2 b 56,9 bc Star S 12,2 27,2 b 35,7 b 50,4 bc Xan S 19,8 bc 30,1 b 39,2 b 48,1 c 29,5 a 42,0 a 54,6 a 73,4 a * 14,6 * 15,2 * 11,9 * 7,6 ĐC Mức ý nghĩa CV(%) d Ghi chú: Trong cùng một cột những chữ theo sau giống nhau thi khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5% theo phép thử Duncan. *: Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Tỷ lệ phần trăm bệnh đốm lá được chuyển đổi sang arcsin khi phân tích thống kê. Qua kết quả cấp bệnh đốm lá Bảng 3.7 cho thấy mức độ nhiễm bệnh của từng nghiệm thức là khác nhau và có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. Ở thời điểm 3 NSKLB, do bệnh mới xuất hiện nên cấp bệnh do các chủng vi khuẩn gây ra chưa cao và không có sự khác biệt ý nghĩa giữa các chủng. Ở thời điểm 5 NSKLB, chỉ có một nghiệm thức thể hiện sự khác biệt và có cấp bệnh thấp hơn so với các nghiệm thức còn lại đó là 64 T có cấp bệnh là 3,4. Ở thời điểm 7 NSKLB, 5 nghiệm thức gồm 28 T, Star T, 28 S, , Star S, Xan S đều có cấp bệnh thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng. Trong đó, nghiệm thức 28 S và Xan S có cấp bệnh 8,0 thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với các nghiệm thức 64 T và đối chứng; nhưng không thể hiện sự khác biệt đối với các nghiệm thức 28 T, Star T, Xan T, 64 S và Star S có cấp bệnh lần lượt là 8,4; 8,6; 9,0; 8,8 và 8,4. Nghiệm thức có cấp bệnh cao nhất là nghiệm thức đối chứng (9,8). Đến thời điểm 9 NSKLB, nghiệm thức Xan S là nghiệm thức thể hiện sự khác biệt và có cấp bệnh thấp hơn so với các nghiệm thức còn lại (8,6). 38 Tóm lại, qua các thời điểm khảo sát tình hình cấp bệnh của mỗi nghiệm thức, có thể thấy được cấp bệnh trên hầu hết các nghiệm thức có cấp bệnh thấp hơn đối chứng ngoại trừ nghiệm thức Xan T và 64 S. Trong đó, thuốc Xanthocin 40WP ở biện pháp xử lý phun sau khi lây bệnh 1 ngày có cấp bệnh thấp và khác biệt ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Bảng 3.7 Cấp bệnh đốm lá trên chậu do khuẩn Xanthomonas sp. chủng CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới qua các ngày Cấp bệnh trên chậu qua các thời điểm Nghiệm thức 3 NSKLB 5 NSKLB 7 NSKLB 9 NSKLB 28 T 2,0 5,6 a 8,4 bc 10,2 a 64 T 2,0 3,4 b 9,4 ab 10,0 a Star T 2,0 5,2 a 8,6 bc 9,6 a Xan T 2,0 5,4 a 9,0 abc 10,4 a 28 S 2,0 6,6 a 8,0 c 9,8 a 64 S 2,0 5,6 a 8,8 abc 10,2 a Star S 2,0 5,2 a 8,4 bc 9,6 a Xan S 2,0 5,4 a 8,0 8,6 b ĐC 2,0 5,8 a 9,8 a 10,4 a Mức ý nghĩa ns * * * CV(%) 0,0 23,6 9,5 6,4 c Ghi chú: Trong cùng một cột những chữ theo sau giống nhau thi khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5% theo phép thử Duncan. *: Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%, ns: không khác biệt ý nghĩa. Từ Bảng 3.6 và Bảng 3.7 cho thấy khả năng làm giảm bệnh ở mỗi loại thuốc và mỗi loại vi khuẩn vùng rễ đều khác nhau. Trong hai loại thuốc hóa học được sử dụng trong thí nghiệm thì cả thuốc Starner 20WP và Xantocin 40WP đều thể hiện hiệu quả trong việc làm giảm bệnh, tuy nhiên Starner 20WP thể hiện sự ổn định hơn qua các thời điểm và hai biện pháp xử lý. Riêng đối với hai chủng vi khuẩn vùng rễ 28 (P. fluorescens) và 64 (P. fluorescens) được áp dụng trong thí nghiệm thì chủng 28 (P. fluorescens) thể hiện khá hiệu quả trong việc làm giảm khả năng gây bệnh đốm lá do vi khuẩn Xanthomonas sp. trên hành qua biện pháp phun trước khi lây bệnh một ngày. Kết quả này phù hợp với kết quả đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ và một số loại thuốc loại thuốc hóa học đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện in vitro. Theo Agrios (2005), tác nhân phòng trừ sinh học có thể đối kháng với mầm bệnh bằng nhiều cơ chế để làm suy yếu hoặc tiêu diệt mầm bệnh như ký sinh lên trên tác nhân gây bệnh, tiết kháng sinh tiêu diệt mầm bệnh, cạnh tranh với mầm 39 bệnh về dinh dưỡng và không gian sống, tiết enzyme phân giải thành phần tế bào tác nhân gây bệnh và kích thích tính kháng trong cây để ức chế mầm bệnh. Điều này hoàn toàn phù hợp đối với các chủng vi khuẩn đối kháng được áp dụng trong thí nghiệm ở điều kiện nhà lưới. Theo Phạm Văn Kim (2006), khi phun trực tiếp huyền phù vi khuẩn đối kháng lên tán lá cho hiệu quả phòng trị cao đối với bệnh đốm vằn trên lúa ở điều kiện ngoài đồng, mà không cần phải dùng đến thuốc hóa học. Ngoài ra, khi áp dụng biện pháp phun trước khi lây bệnh với huyền phù vi khuẩn đối kháng đã tạo điều kiện cho các vi khuẩn đối kháng này có được ưu thế cạnh tranh về không gian sống cũng như nhu cầu dinh dưỡng, điều này cũng phù hợp với quan điểm của Agrios (2005) về khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn gây bệnh, cũng có thể là do vi khuẩn đối kháng kích thích tính kháng bệnh của cây và đến khi mầm bệnh xuất hiện và tấn công, cây trồng có thể kháng lại sự xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh và vi khuẩn đối kháng có thể tiết kháng sinh trực tiếp ức chế tác nhân gây bệnh khi chúng đã xâm nhiễm vào bên trong cây trồng. 40 28 T Star T 64 T Xan T Hình 3.5a Mức độ nhiễm bệnh đốm lá do Xanthomonas sp. CM-AG 6 của các nghiệm thức tại thời điểm 7 NSKLB trong điều kiện nhà lưới 41 ĐC 28 S Star S 64 S Xan S Hình 3.5b Mức độ nhiễm bệnh đốm lá do Xanthomonas sp. CM-AG6 của các nghiệm thức tại thời điểm 7 NSKLB trong điều kiện nhà lưới 42 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN Trong 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. được phân lập thì chủng Xan CM-AG6 (xã Kiến An – huyện Chợ Mới – tỉnh An Giang) là chủng có khả năng gây hại cao nhất. Có 9 chủng vi khuẩn trong 30 chủng vi khuẩn vùng rễ được khảo sát thể hiện đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 trong điều kiện in vitro. Trong đó, hai chủng vi khuẩn vùng rễ thể hiện khả năng đối kháng cao gồm 28 (P. fluorescens) và 64 (P. fluorescens). Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của 8 loại thuốc hóa học đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 trong điều kiện in vitro cho thấy thuốc Starner 20WP (Oxolinic acid) thể hiện hiệu quả cao nhất, kế đến là thuốc Xantocin 40WP (Bronopol). Kết quả đánh giá hiệu quả phòng trị của hai chủng vi khuẩn đối kháng 28 (P. fluorescens) và 64 (P. fluorescens) và hai loại thuốc hoá học (Starner 20WP và Xantocin 40WP) đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện nhà lưới qua biện pháp xử lý phun trước khi lây bệnh 1 ngày và phun sau khi lây bệnh 1 ngày cho thấy tất cả các nghiệm thức có áp dụng biện pháp xử lý đều thể hiện hiệu quả phòng trị, trong đó thuốc Starner 20WP và chủng vi khuẩn vùng rễ 28 (P. fluorescens) thể hiện sự hiệu quả ổn định trong việc làm giảm tỷ lệ bệnh và cấp bệnh trên lá qua cả hai biện pháp xử lý. 4.2. ĐỀ NGHỊ Tiếp tục đánh giá hiệu quả phòng trị của chủng vi khuẩn vùng rễ 28 (P. fluorescens) và thuốc Starner 20WP trong phòng trị bệnh đốm lá trên hành trong điều kiện ngoài đồng. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alvarez, A. M., Buddenhagen, I. W., Buddenhagen, E. S., and Domen, H. Y. (1978). Bacterial blight on onion, a new disease caused by Xanthomonas sp. Phytopathology. 68: 11321136. Agrios, G. N. (1997). Plant Pathology, 4th edition. Academic Press, New York, 637p. Agrios, G. N. (2005). Plant Pathology, 5th edition. San Diego, California: Elsevier Academic Press, 922p. Anith, K. N., Momol, M. T., Kloepper, J. W., Marois, J. J., Olson, S. M., and Jones, J. B. (2004). Efficacy of plant growth-promoting rhizobacteria, acibenzolar-S-methyl, and soil amendment for integrated management of bacterial wilt of tomato. Plant Dis. 88: 669673. Arshad, M. and Frankenberger, T. W. (2002). Ethylene Agricultural sources and applications, Springer, pp. 342. BASF (2009). Protectol and Myacide Bronopol Products, BASF SE Care Chemicals & Formulators Europe, 12p. Bender, C. L. and Cooksey, D. A. (1986). Indigenous plasmids in Pseudomonas syringae pv. tomato: Conjugative transfer and role in copper resistance. J. Bacteriol. 165: 534-541. Black, L., Conn, K., Gabor, B., Kao, J. and Lutton, J. (2012). Onion Disease Guide, Seminis Vegetable Seeds. Inc., pp.14. Bultreys, A. and Gheyson, I. (2000). Production and comparision of peptide siderophores from strains of distantly related pathovars of Pseudomonas syringae and Pseudomonas viridiflava LMG 2352. Applied and Environmental Microbiology, 66: 325-331. CABI (2007). Crop Protection Compendium. Allium fistulosum L. CABI (2007). Crop Protection Compendium. Xanthomonas axonopodis pv. allii. Dowson, W.J. (1939). "On the systematic position and generic names of the gram negative bacterial plant pathogens". Zentralblatt fur Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrank heiten und Hygiene.: 177–193. Duffy, B. K. and Defágo, G. (1999). Enviromental factors modulating antibiotic and siderophore biosynthesis by Pseudomonas fluorescens bio-control strains. Applied and Environmental Microbiology, 65: 2429-2438. Đặng Kim Đào (2010). Phân lập vi khuẩn vùng rễ và đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh héo dây do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cây khổ qua (Momordica charantia). Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Đoàn Thị Kiều Tiên (2010). Nghiên cứu biện pháp phòng trị bệnh cháy lá và đốm trái (Acidovorax avenae subsp. citrulli) trên dưa hấu trong điều kiện in vitro và nhà lưới. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Đỗ Tấn Dũng (2004). Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum (Smith) gây hại một số bệnh cây trồng vùng Hà Nội và phụ cận, 1998-2003. Hội thảo Quốc gia Bệnh cây và Sinh học phân tử, Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Trang 49-62. FAOstat (Food Agricultura Organization). 2013. Online. Http://faostat3.fao.org/faostatgateway/go/to/download/Q/QC/E Fernando, W. G., Nakkeeran, S. and Zhang, Y. (2006). Biosynthesis of antibiotics by PGPR and its relation in biocontrol of plant disease. In: PGPR: Biocontrol and Biofertilization, Siddiqui, Z. A. (ed.). 2006. The Netherlands: Springer, pp. 67-110. 44 Flor, H. H. (1971). Current startus of the gene-for-gene concept. Annu. Rev. Phytopathol.. 9: 275-296. Gent, D. H. and Schwartz, H. F. (2005). Management of Xanthomonas leaf blight of onion with a plant activator, biological control agents, and copper bactericides. Plant Dis. 89: 631-639. Gent, D. H., Lang, J. M. and Schwartz, H. F. (2005). Epiphytic survival of Xanthomonas axonopodis pv. allii and X. axonopodis pv. phaseoli on leguminous hosts and onion. Plant Dis. 89: 558-564. Gent, D. H., Schwartz, H. F., Ishimaru, C. A., Louws, F. J., Cramer, R. A. and Lawrence, C. B. (2004). Polyphasic characterization of Xanthomonas strains from onion. Phytopathology 94: 184-195. Glick, R. B. (1995). The enhancement of plant growth promotion by free-living bacteria. Canadian Journal of Microbiology, 41: 109-117. Hikichi, Y. (1993). Mode of action of oxolinic acid against bacterial seedling rot of rie caused by Pseudomonas glumae. 2. Efficacy of oxolinic acid against secondary infection. Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 59: 441-451. Hikichi, Y., Noda, C. and Shimizu, K. (1989). Oxolinic acid. Jpn. Pestic. Inform. 55: 21-23. Horsfall, J. G. and Barratt, R. W. (1945). An improved grading system for measuring diseases. Phyotpathology 35: 665. Houeto, P., Bindoula, G., and Hoffman, J. R. (1995). Ethylene-bisdithiocarbamates and ethylenethiourea: Possible human health hazards. Environ. Health Perspect. 103: 568573. Isakeit, T., Miller, M. E., Barnes, L. W., Dickstein, E. R. and Jones, J. B. (2000). First report of leaf blight of onion caused by Xanthomonas campestris in the continental United States. Plant Dis. 84: 201. Jackson, L. E. (1989). Bacteriophage prevention and control of harmful plant bacteria. US Patent, Patent No. 4,828,999. Ji, P., Campbell, H. L., Kloepper, J. W., Jones, J. B., Suslow, T. V. and Wilson, M. (2005). Integrated biological control of bacteria speck and spot of tomato under field conditions using foliar biological control agents and plant growth-promoting rhizobacteria. Biological Control, 36: 358-367. Kadota, I., Uehara, K., Shinohara, H., and Nishiyama, K. (2000). Bacterial blight of welsh onion: A new disease caused by Xanthomonas campestris pv. allii pv. nov. J. Gen. Plant Pathol. 66: 310-315. Keel, C., Schnider, U., Maurhofer, M., Viosard, C., Laville, J., Burger, U., Withner, P., Hass, O. and Defágo, G. (1992). Suppression of root disease by Pseudomonas fluorescens CHA0: important of the bacterial secondary metabolite 2,4 diacetylphloroglucinol. Molecular Plant Microbiology Interaction, 5: 4-13. Kennedy, A. C. (2005). Rhizosphere, in: Principles and Application of soil Microbiology, D. M., Sylvia, J.J., Fuhrmann, P.G., Hartel, and D.A., Zuberer, eds., 2nd ed. Pearson, Prentice Hall, New Jersey, 242-262p. Khấu Vũ Linh (2013). Hiệu quả đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa của một số nông dược và vi khuẩn vùng rễ trong điều kiện in vitro. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. 45 Kiehr, M., Delhey, R. and Azpilicueta, A. (2012). Smudge and other diseases of onion caused by Colletotrichum circinans, in southern Argentina. Vicente López jul. 81(2): 161 -163. Kim, W. G., Hong, S. K. and Kim, J. H. (2008). Occurrence of Anthranose an Welsh Onion Caused by Colletotrichum Circinans. Mycobiology 36(4): 274-276. Kloepper, J. W. and Ryu, C. M. (2006). Bacterial endophytes as elicitors of induced systemic resistance. In Microbial Root Endophytes Soil Biology. Schulz B., C. Boyle, T. N. Sieder (Eds) Soil Biology, Vol. 9, Microbial Root Endophytes. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp. 33-52. Kloepper, J. W., CM. Ryu, and Zhang, S. (2004). Induced systemic resistance and promotion of plant growth by Bacillus spp. Phytopathology 94: 1259-1266. Kloepper, J. W., Tuzun, S., Liu, L. and Wei, G. (1993). Plant growth promoting rhizobacteria as inducers of systemic disease resistance. In Pest Management: Biologically Based Technologies. American Chemical Society Books, Washington, DC, pp. 156-165. Kumar, N.R., Arasu, V.T. and Gunasekaran. P., (2002). Genotypeing of antifungal compounds producing plant growth-promoting rhizobacteria, Pseudomonas fluorescens. Curren Science, 82: 1463-1466. Lang, J. M., Gent, D. H. and Schwartz, H. F. (2007). Management of Xanthomonas leaf blight of onion with bacteriophages and a plant activator. Plant Dis. 91: 871-878. Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân (1998). Giáo trình bệnh cây nông nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. 294 trang. Lian, J., Wang, Z. and Zhou, S. (2008). Response of endophytic bacterial communities in banana tissue culture plantlets to Fusarium wilt pathogen infection, Journal Genetic Applied Microbiology, 54(2): 83-92. Louws, F. J., Wilson, M., Campbell, H. L., Cuppels, D. A., Jones, J. B., Shoemaker, P. B., Sahin, F., and Miller, S. A. (2001). Field control of bacterial spot and bacterial speck of tomato using a plant activator. Plant Dis. 85: 481-488. Lucy, M., Reed, E. and Glick, B. R. (2004). Application of free living plant growth promoting rhizobacteria. Antonie Van Leeuwenhoek , 86: 1-25. Ma, P. and Tredway, L. P.(2013). Compositions comprising ningnanmycin and uses therefor. North Carolina State University. US. Provisional Patent Application Ser. No. 61/654,357, filed Jun. 1, 2012, and U.S. Provisional Patent Application Ser. No. 61/705,801, filed Sep. 26, 2012 Nguyễn Lê Kim Ngân (2011). Nghiên cứu biện pháp phòng trị bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên khổ qua bằng vi khuẩn vùng rễ trong điều kiện nhà lưới. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa (2007). Trồng – chăm sóc & phòng trừ sâu bệnh Rau Gia Vị. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. Trang 34-49. Ngô Thị Ngọc Yến (2010). Giám định bệnh đốm lá trên hồng và hiệu quả của một số loại thuốc hóa học trong điều kiện phòng thí nghiệm. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Thị Tấm (2013). Đánh giá hiệu quả phòng trị của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 231-1 đối với bệnh đốm vằn do nấm Rhizoctonia solani và bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây ra trên lúa trong điều kiện in vitro và nhà lưới. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. 46 Nguyễn Thị Thu Nga (2007). Defence responses and induced resistance in watermelon against Didymella bryoniae. Ph. D. Thesis. University of Copenhagen. Denmark. Nguyễn Thị Thu Nga và Phạm Văn Kim (2003). Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn Burkholderia cepacia TG17 đối với nấm Rhizoctonia solani gây bệnh đốm vằn trên lúa. Tạp chí khoa học chuyên ngành Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Nga, N.T.T., Giau, N.T, Long, N.T., Lübeck, M., Shetty, N.P., De Neergaard, E., Thuy, T.T.T., Kim, P.V. and Jørgensen, H.J.L, (2010). Rhizobacterially induced protection of watermelon against Didymella bryoniae. Journal Of Applied Microbiology. 109: 567–582. Nguyễn Vũ Cương (2011). Đánh giá khả năng gây hại của vi khuẩn gây bệnh đốm lá ớt Xanthomonas campestris pv. vesicatoria và nghiên cứu phòng trị sinh học bằng vi khuẩn vùng rễ trong điều kiện in vitro và nhà lưới. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Nunez, J. J., Gilbertson, R. L., Meng, X. and Davis, R. M. (2002). First report of Xanthomonas leaf blight of onion in California. Plant Dis. 86: 330. Obradovic, A., Jones, J. B., Momol, M. T., Balogh, B. and Olson, S. M. (2004). Management of tomato bacterial spot in the field by foliar applications of bacteriophages and SAR inducers. Plant Dis. 88: 736-740. O’Garro, L. W. and Paulraj, L. P. (1997). Onion leaf blight caused by Xanthomonas campestris: Alternative hosts and resistant onion genotypes. Plant Dis. 81:978-982. Oyen, L.P.A. and Messiaen, C.-M., (2004). Allium fistulosum L. PROTA (Plant Resources of Tropical Africa / Ressources végétales de l’Afrique tropicale), Wageningen, Netherlands. Paulraj, L. and O’Garro, L. W. (1993). Leaf blight of onions in Barbados caused by Xanthomonas campestris. Plant Dis. 77: 198-201. Pathak CS, (1994). Allium crop situation in Asia. ISHS Acta Horticulturae, 433p. Persley, D., Cooke, T. and House, S. (2012). Diseases of Vegetable Crops in Australia, Csiro Publishing, 304p. Phạm Thị Thắm (2011). Phân lập và đánh giá khả năng gây hại của vi khuẩn Erwinia carotovora trên bắp cải và nghiên cứu biện pháp phòng trị sinh học bằng vi khuẩn vùng rễ. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ Phạm Văn Kim (2006). Phòng trị sinh học bệnh cây trồng. Giáo trình dành cho sinh viên, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. 38 trang. Phạm Văn Kim và T.W. Mew (2003). Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn đối kháng Burkholderia cepacia TG17 để quản lý bệnh đốm vằn (khô vằn) hại lúa một cách bền vững tại Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tạp chí khoa học chuyên ngành Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông nghiệp, Đại học Cần Thơ. Raaijmakers, J. M., Vlami, M. and De Souza, J. T. (2002). Antibiotic production by bacteria biocontrol agents. Antonie Van Leeuwenhoek, 81: 537-547. Roumagnac, P., Gagnevin, L. and Pruvost, O. (2000). Detection of Xanthomonas sp., the causal agent of onion bacterial blight, in onion seeds using a newly developed semiselective isolation medium. Eur. J. Plant Pathol. 106: 867-877. Roumagnac, P., Gagnevin, L., Gardan, L., Sutra, L., Manceau, C., Dickstein, E. R., Jones, J. B., Rott,P. and Pruvost, O. (2004a). Polyphasic characterization of xanthomonas isolated from onion, garlic and Welsh onion (Allium spp.) and their relatedness to different Xanthomonas species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 15-24. 47 Roumagnac, P., Pruvost, O., Chiroleu, F. and Hughes, G. (2004b). Spatial and temporal analyses of bacterial blight of onion caused by Xanthomonas axonopodis pv. allii. Phytopathology 94: 138-146. Sanders, F. H., Langston, D. B., Jr., Brock, J. H., Gitaitis, R. D., Curry, D. E. and Torrance, R.L. (2003). First report of a leaf blight of onion caused by Xanthomonas spp. in Georgia. Plant Dis. 87: 749. Schwartz, H. F. and Gent, D. H, (2007). Xanthomonas Leaf Blight. High Plains IPM Guide, a cooperative effort of the University of Wyoming, University of Nebraska, Colorado State University and Montana State University. Schwartz, H. F. and Otto, K. (2000). First report of leaf blight of onion caused by Xanthomonas campestris in Colorado. Plant Dis. 84:922. Schwartz, H. F. and Otto, K. J. (1998). Onion bacterial disease management in Colorado. in: Proc. 1998 Nat. Onion (and other Allium) Res. Conf., Sacramento, CA, Pages 214-218. Schwartz, H. F., Otto, K. L. and Gent, D. H. (2003). Relation of temperature and rainfall to development of Xanthomonas and Pantoea leaf blights of onion in Colorado. Plant Dis. 87: 11-14. Serfontein, J. J. (2001). Xanthomonas blight of onion in South Africa. Plant Dis. 85: 442. Shurtleff, M.C. and Averre III., W.C. (1997). The plant disease clinic and field diagnosis of abiotic diseases. APS press. The America Phytopathological Soceity. St. Paul, Minnesata. 245p Shtienberg, D., Zilberstaine, M., Oppenheim, D., Herzog, Z., Manulis, S., Shwartz, H., and Kritzman, G. (2001). Efficacy of oxolinic acid and other bactericides in suppression of Erwinia amylovorain pear orchards in Israel. Phytoparasitica 29: 143-154. Siddqui, Z. A. (2006). PGPR: Prospective biocontrol agent of plant pathogens. In PGPR: Biocontrol and Biofertilization, Siddiqui, Z. A. (ed.). Springer Publisher. The Netherlands, pp. 111-142. Stackebrandt, E., Frederiksen, W., Garrity, G. M. and 10 other authors (2002). Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology. Int J Syst Evol Microbiol 52, 1043–1047. Stall, R. E., Loschke, D. C., and Jones, J. B. (1986). Linkage of copper resistance and avirulence loci on a self-transmissible plasmid in Xanthmonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 76: 240-243. Tien, T. M., Gaskins, M. H. and Hubbell, D. H. (1979). Plant growth substances produced by Azospirillum brasilense and their effect on the growth of pearl millet (Pennisetum americanum L.), Applied and Environmental Microbiology, 37: 1016-1024. Trần Khắc Thi và Nguyễn Công Hoan, (2005). Kỹ thuật trồng rau sạch- rau an toàn và chế biến rau xuất khẩu. Nhà Xuất bản Thanh Hóa. Trần Văn Hai (2005). Giáo trình hóa bảo vệ thực vật. Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng. Đại học Cần Thơ. Trần Văn Hai, Trần Thị Ba, Nguyễn Lê Quỳnh Thiện và Võ Thị Bích Thủy (2005). Rau an toàn: kỹ thuật trồng, sâu bệnh hại và biện pháp phòng trị. Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng. Đại học Cần Thơ. Trần Thị Thu Thủy (2007). Bệnh hại lúa. Bài giảng dành cho sinh viên khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. 48 Van Loon, L.C. and Bakker, P.A.H.M., (2005). Induced systemic resistance as a mechanism of disease suppression by rhizobacteria. In PGPR: Biocontrol and Biofertilization, Siddqui, Z.A. (ed) Springer Publisher. The Netherlands, 39-66p. Vessey, J. K. (2003). Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant and Soil (255): 571-586. Võ Văn Chi (2005), Cây Rau, Trái Đậu Dùng Để Ăn Và Trị Bệnh, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, 132-133. Vũ Xuân Thắng (2013). Hiệu quả phòng trị bệnh thối củ gừng do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra của một số loại nông dược và vi khuẩn vùng rễ. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Wayne, L. G., Brenner, D. J., Colwell, R. R. and 9 other authors (1987). International Committee on Systematic Bacteriology. Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics. Int J Syst Bacteriol 37: 463–464. Wei, G., Kloepper, J. W. and Tuzun, S. (1996). Induced systemic resistance to cucumber diseases and increased plant growth by plant growth-promoting rhizobacteria under field conditions, Phytopathology 86: 221-224. Wong, W. C. and Preece, T. F. (1985). Pseudomonas tolaasii in mushroom (Agaricus bisporus) crops: activity of formulations of 2-bromo-2-nitropropane-1,3-diol (bronopol) against the bacterium and the use of this compound to control blotch disease. Journal of Applied Bacteriology, 58: 275-281. Yan, Z., Reddy, M.S., Ryu, C.M. and McInroy, J.A., (2002). Induced systemic protection against tomato late blight elicitied by plant growth-promoting rhizobacterial. Phythopathology 92: 1329-1333. Yang, C.H. and Crowley, D.E., (2000). Rhizophere microbal community structure in relation to root location and plant iron nutritional status. Application. Environ. Microbiol 66: 345351. Zehnder, G. W., Murphy, J. F., Sikora, E. and Kloepper, J. W. (2001). Application of rhizobacteria for induced resistance, Eur. J, Plant Pathol, 107: 39-50. 49 PHỤ CHƯƠNG Phụ bảng 1: Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 2 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 4 4812,996 1203,249 21,8257 0,0000 Sai số 15 826,950 55,130 Tổng cộng 19 5639,946 CV: 29,5% Phụ bảng 2: Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 3 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 4 2460,340 615,085 13,0385 0,0001 Sai số 15 707,620 47,175 Tổng cộng 19 3167,960 CV: 20,2% Phụ bảng 3: Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 4 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 4 1129,882 282,470 7,5414 0,0015 Sai số 15 561,840 37,456 Tổng cộng 19 1691,722 CV: 14,9% Phụ bảng 4: Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 5 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 4 1243,192 310,798 4,9362 0,0097 Sai số 15 944,443 62,963 Tổng cộng 19 2187,635 CV: 18,0% ` Phụ bảng 5: Cấp bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 2 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 4 1,200 0,300 2,2500 0,1123 Sai số 15 2,000 0,133 Tổng cộng 19 3,200 CV: 20,3% Phụ bảng 6: Cấp bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 3 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 4 12,700 3,175 13,6071 0,0001 Sai số 15 3,500 0,233 Tổng cộng 19 16,200 CV: 17,9% Phụ bảng 7: Cấp bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 4 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 4 58,300 14,575 8,3286 0,0010 Sai số 15 26,250 1,750 Tổng cộng 19 84,550 CV: 23,4% Phụ bảng 8: Cấp bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 5 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 4 21,500 5,375 2,6434 0,0750 Sai số 15 30,500 2,033 Tổng cộng 19 52,000 CV: 15,8% Phụ bảng 9. : Khả năng đối kháng của 9 chủng vi khuẩn vùng rễ với vi khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 qua các thời điểm 1 NSKC Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 8 68,431 8,554 127,4224 0,0000 Sai số 27 1,813 0,067 Tổng cộng 35 70,243 CV: 20,1% Phụ bảng 10: Khả năng đối kháng của 9 chủng vi khuẩn vùng rễ với Xanthomonas sp. CM-AG6 qua các thời điểm 3 NSKC Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính động phương bình phương Nghiệm thức 8 607,306 75,913 341,6094 Sai số 27 6,000 0,222 Tổng cộng 35 613,306 CV: 9,7% Phụ bảng 11: Khả năng đối kháng của 9 chủng vi khuẩn vùng rễ với Xanthomonas sp. CM-AG6 qua các thời điểm 5 NSKC Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính động phương bình phương Nghiệm thức 8 517,625 64,703 247,3606 Sai số 27 7,063 0,262 Tổng cộng 35 524,688 CV: 10,7% Phụ bảng 12: Khả năng đối kháng của 8 loại thuốc hóa học với Xanthomonas sp. CM-AG6 qua các thời điểm 1 NSKC Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính động phương bình phương Nghiệm thức 7 150,594 21,513 1376,8571 Sai số 24 0,375 0,016 Tổng cộng 31 150,969 CV: 10,3% Phụ bảng 13: Khả năng đối kháng của 8 loại thuốc hóa học với Xanthomonas sp. CM-AG6 qua các thời điểm 3 NSKC Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính động phương bình phương Nghiệm thức 7 295,805 42,258 5409,0000 Sai số 24 0,188 0,008 Tổng cộng 31 295,992 CV: 5,1% Phụ bảng 14: Khả năng đối kháng của 8 loại thuốc hóa học với Xanthomonas sp. CM-AG6 qua các thời điểm 5 NSKC Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính động phương bình phương Nghiệm thức 7 287,492 41,070 1051,4000 Sai số 24 0,938 0,039 Tổng cộng 31 288,430 CV: 11,6% vi khuẩn Xác suất 0,0000 vi khuẩn Xác suất 0,0000 vi khuẩn Xác suất 0,0000 vi khuẩn Xác suất 0,0000 vi khuẩn Xác suất 0,0000 Phụ bảng 15: Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 3 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 8 709,996 88,750 6,6624 0,0000 Sai số 36 479,554 13,321 Tổng cộng 44 1189,554 CV: 14,6% Phụ bảng 16: Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 5 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 8 420,258 52,532 2,0540 0,0673 Sai số 36 920,727 25,576 Tổng cộng 44 1340,985 CV: 15,2% Phụ bảng 17: Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 7 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 8 469,282 58,660 2,5436 0,0263 Sai số 36 830,245 23,062 Tổng cộng 44 1299,527 CV: 11,9% Phụ bảng 18: Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 9 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 8 886,826 110,853 8,2633 0,0000 Sai số 36 482,944 13,415 Tổng cộng 44 1369,770 CV: 7,6% Phụ bảng 19: Cấp bệnh đốm lá trên chậu do khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 3 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 8 0,000 0,000 0,000 Sai số 36 0,000 0,000 Tổng cộng 44 0,000 CV: 0,0% Phụ bảng 20: Cấp bệnh đốm lá trên chậu do khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 5 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 8 28,711 3,589 2,2431 0,0468 Sai số 36 57,600 1,600 Tổng cộng 44 86,311 CV: 23,6% Phụ bảng 21: Cấp bệnh đốm lá trên chậu do khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 7 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 8 14,844 1,856 2,7377 0,0181 Sai số 36 24,400 0,678 Tổng cộng 44 39,244 CV: 9,5% Phụ bảng 22: Cấp bệnh đốm lá trên chậu do khuẩn Xanthomonas sp. CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 9 NSKLB Nguồn biến Tổng bình Trung bình Độ tự do F Tính Xác suất động phương bình phương Nghiệm thức 8 12,800 1,600 4,0000 0,0018 Sai số 36 14,400 0,400 Tổng cộng 44 27,200 CV: 6,4% [...]... Promoting Rhizobacteria = PGPR) thể hiện hiệu quả tốt trong phòng trị bệnh trên cây trồng (Siddiqui, 2006) Do đó, đề tài: Đánh giá khả năng gây hại của vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh đốm lá hành và hiệu quả phòng trị bằng vi khuẩn vùng rễ và thuốc hóa học trong điều kiện in vitro và nhà lưới được thực hiện nhằm tìm ra loại thuốc hóa học và vi khuẩn vùng rễ đối kháng hiệu quả cao trong phòng trị bệnh. .. 2.2.5 Đánh giá hiệu quả phòng trị của hai chủng vi khuẩn đối kháng và hai loại thuốc hoá học đối với vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện nhà lưới - Mục đích: nhằm đánh giá hiệu quả của hai chủng vi khuẩn đối kháng và 2 loại thuốc ức chế cao nhất đối với bệnh đốm lá hành do vi khuẩn Xanthomonas sp gây ra trong điều kiện nhà lưới và tìm ra biện pháp xử lý đạt hiệu quả phòng trị. .. lý bằng phần mềm thống kê MSTATC (phiên bản 1.2) qua phép thử Duncan 19 2.2.3 Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện điều kiện in vitro - Mục đích: chọn ra các chủng vi khuẩn vùng rễ cho khả năng đối kháng cao nhất đối với vi khuẩn Xanthomonas sp - Vật liệu: + Nguồn vi khuẩn đối kháng: 30 chủng vi khuẩn vùng rễ. .. vô khuẩn (mm) vào 1, 3 và 5 ngày sau khi cấy Số liệu ghi nhận được phân tích xử lý bằng phần mềm thống kê MSTATC (phiên bản 1.2) qua phép thử Duncan 2.2.4 Đánh giá khả năng đối kháng của các loại thuốc hóa học đối vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện in vitro - Mục đích: nhằm tìm ra thuốc hoá học có hiệu quả cao trong vi c ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp trong điều kiện in vitro. .. khuẩn Triệu chứng bệnh đốm lá trên hành do vi khuẩn Xanthomonas sp gây ra Triệu chứng bệnh đốm lá do các chủng vi khuẩn Xanthomonas sp gây ra ở thời điểm 5 NSKLB Bán kính vòng vô khuẩn của vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn Xanthomonas sp CM-AG6 trong điểu kiện in vitro ở thời điểm 3 NSKC Bán kính vòng vô khuẩn của các loại thuốc hóa học đối với Xanthomonas sp CM-AG6 trong điều kiện in vitro ở thời điểm... Nguồn vi khuẩn lây bệnh: chủng vi khuẩn Xanthomonas sp có khả năng gây hại cao nhất được chọn ra từ thí nghiệm 2.2.2 22 + Nguồn vi khuẩn đối kháng: hai chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng đối kháng cao nhất với vi khuẩn gây bệnh đốm lá hành (Xanthomonas sp.) được chọn ra từ thí nghiệm 2.2.3 + Thuốc hóa học: hai loại thuốc hóa học (Starner 20WP và Xantocin 40WP) có khả năng đối kháng cao nhất với vi khuẩn. .. các biện pháp xử lý với vi khuẩn vùng rễ bao gồm ngâm hạt + tưới đất, phun lá trước, phun lá sau và kết hợp phun lá trước sau trong điều kiện nhà lưới Chủng vi khuẩn vùng rễ 67 (Bacillus sp.) cho hiệu quả phòng trị cao nhất đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên ớt do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv vesicatoria gây ra khi xử lý kết hợp phun lá trước và sau trong điều kiện nhà lưới (Nguyễn Vũ Cương, 2011)... trong điều kiện nhà lưới qua các ngày sau khi lây bệnh Khả năng đối kháng của 9 chủng vi khuẩn vùng rễ với vi khuẩn Xanthomonas sp CM-AG6 qua các thời điểm 1, 3 và 5 ngày sau khi cấy Khả năng đối kháng của các loại thuốc hóa học với vi khuẩn Xanthomonas sp CM-AG6 qua các thời điểm 1, 3 và 5 ngày sau khi cấy Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do khuẩn Xanthomonas sp CM-AG6 gây ra trong điều kiện nhà lưới qua... và khả năng đề kháng của cây Trong các nghiên cứu của Paulraj và O’Garro (1993) đã tìm ra được chủng vi khuẩn Pantoea agglomerans phân lập từ vùng rễ hành tây ở vùng Barbados có khả năng ức chế gần như hoàn toàn toàn vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh đốm lá hành Theo Jackson (1989), đã áp dụng thành công thực khuẩn thể trong vi c quản lý một số bệnh do vi khuẩn gây hại trên cây trồng Để chứng minh điều. .. chủng vi khuẩn vùng rễ sử dụng trong thí nghiệm Các loại thuốc hoá học được sử dụng trong thí nghiệm Các chủng vi khuẩn Xanthomonas sp phân lập được từ các ruộng hành ở các tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long và An Giang Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp gây ra trong điều kiện nhà lưới qua các ngày sau khi lây bệnh Cấp bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp gây ra trong