vitro
- Mục đích: chọn ra các chủng vi khuẩn vùng rễ cho khả năng đối kháng cao nhất đối với vi khuẩn Xanthomonas sp.
- Vật liệu:
+ Nguồn vi khuẩn đối kháng: 30 chủng vi khuẩn vùng rễ.
+ Tác nhân gây bệnh: chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. có khả năng gây hại cao nhất được chọn ra từ thí nghiệm 2.2.2.
- Phương pháp: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố gồm 30 nghiệm thức với 4 lần lặp lại.
Chuẩn bị: các chủng vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn Xanthomonas
sp. được nuôi trong môi trường King’s B trong 2 ngày để vi khuẩn phát triển tạo khuẩn lạc. Sau đó, đem vi khuẩn cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa môi trường King’s B để vi khuẩn phát triển trong 2 ngày.
Cách thực hiện
+ Rút 100 µl huyền phù vi khuẩn gây bệnh (Xanthomonas sp.) vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường King's B đặc đã được nấu tan và giữ ấm ở 55oC. Lắc đều bằng vortex sau đó đổ ra đĩa Petri đã thanh trùng và để nguội.
+ Nhúng giấy thấm được đục thành khoanh tròn với đường kính 5 mm đã thanh trùng vào ống nghiệm có chứa huyền phù vi khuẩn đối kháng. Sau đó vớt ra để lên giấy thấm đã thanh trùng cho đến khi khoanh giấy khô và đặt khoanh giấy thấm này lên đĩa Petri có chứa vi khuẩn gây bệnh theo 5 điểm đã được đánh dấu trước (Hình 2.2). Tất cả thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Cuối cùng các đĩa Petri được đặt trong tủ úm 28oC.
Vi khuẩn Xanthomonas sp. trong môi trường King’s B
Vi khuẩn vùng rễ VK 1
VK 4 VK 5 VK 2
VK 3
Ghi nhận và đánh giá: ghi nhận chỉ tiêu bán kính vòng vô khuẩn (mm) vào 1, 3 và 5 ngày sau khi cấy. Số liệu ghi nhận được phân tích xử lý bằng phần mềm thống kê MSTATC (phiên bản 1.2) qua phép thử Duncan.
2.2.4. Đánh giá khả năng đối kháng của các loại thuốc hóa học đối vi khuẩn
Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện in vitro
- Mục đích: nhằm tìm ra thuốc hoá học có hiệu quả cao trong việc ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. trong điều kiện in vitro.
- Vật liệu:
+ Chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. có khả năng gây hại cao nhất được chọn ra từ thí nghiệm 2.2.2.
+ 8 loại thuốc hóa học (Bảng 2.2).
Bảng 2.2 Các loại thuốc hóa học được sử dụng trong thí nghiệm
- Phương pháp: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 8 nghiệm thức với 4 lần lặp lại.
Chuẩn bị: vi khuẩn Xanthomonas sp. được nuôi trong môi trường King’s B trong 2 ngày để vi khuẩn phát triển tạo khuẩn lạc. Sau đó đem vi khuẩn cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa môi trường King’s B để vi khuẩn phát triển trong 2 ngày.
Cách thực hiện:
+ Rút 100 µl huyền phù vi khuẩn gây bệnh (Xanthomonas sp.) vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường King's B đặc đã được nấu tan và giữ ấm ở 55oC. Lắc đều bằng vortex sau đó đỗ ra đĩa Petri đã thanh trùng và để nguội.
STT Tên thuốc Hoạt chất Liều lượng
sử dụng/50ml nước 1 Bordeaux 1% Ca(OH)2 + CuSO4 0,5 g Ca + 0,5 g
CuSO4
2 Ditacin 8SL Ningnamycin 0,034 ml 3 Kasumin 2SL Kasugamycin 0,125 ml 4 Starner 20WP Oxolinic axid 0,063 g 5 Super cook
85WP
Copper oxychloride 0,117 g
6 Visen 20SC Copper salt of 5,5′- (methylenediimino)bis(1, 3,4-thiadiazole-2-thiol)
0,039 ml
7 Nước vôi 10% Canxi hydroxit 5 g 8 Xantocin 40WP Bronopol 0,035 g
+ Mỗi loại thuốc được pha theo nồng độ khuyến cáo chứa trong ống nghiệm.
+ Nhúng giấy thấm được đục thành khoanh tròn với đường kính 5 mm đã thanh trùng vào ống nghiệm có chứa dung dịch thuốc hóa học. Sau đó vớt ra để lên giấy thấm đã thanh trùng cho đến khi khoanh giấy khô, dùng kẹp gấp lần lượt các khoanh giấy thấm thuốc đặt lên đĩa Petri có chứa vi khuẩn gây bệnh theo thứ tự các điểm đã được đánh dấu trước (Hình 2.3). Mỗi lần thay đổi loại thuốc phải thay đổi kẹp hoặc rửa sạch lại bằng nước cất .
+ Mang các đĩa Petri đã bố trí đặt vào tủ úm rồi tiến hành theo dõi và quan sát để lấy chỉ tiêu.
Ghi nhận và đánh giá: ghi nhận chỉ tiêu bán kính vòng vô khuẩn (mm) vào 1, 3 và 5 ngày sau khi cấy. Số liệu ghi nhận được phân tích xử lý bằng phần mềm thống kê MSTATC (phiên bản 1.2) qua phép thử Duncan.
2.2.5. Đánh giá hiệu quả phòng trị của hai chủng vi khuẩn đối kháng và hai loại thuốc hoá học đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá hành trong điều kiện nhà lưới
- Mục đích: nhằm đánh giá hiệu quả của hai chủng vi khuẩn đối kháng và 2 loại thuốc ức chế cao nhất đối với bệnh đốm lá hành do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới và tìm ra biện pháp xử lý đạt hiệu quả phòng trị cao để ứng dụng ngoài đồng.
- Vật liệu:
+ Nguồn vi khuẩn lây bệnh: chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. có khả năng gây hại cao nhất được chọn ra từ thí nghiệm 2.2.2.
Vi khuẩn Xanthomonas sp. trong môi trường King’s B Thuốc 1
Thuốc hóa học
Thuốc 3
Thuốc 4
Thuốc 2
+ Nguồn vi khuẩn đối kháng: hai chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng đối kháng cao nhất với vi khuẩn gây bệnh đốm lá hành (Xanthomonas sp.) được chọn ra từ thí nghiệm 2.2.3.
+ Thuốc hóa học: hai loại thuốc hóa học (Starner 20WP và Xantocin 40WP) có khả năng đối kháng cao nhất với vi khuẩn gây bệnh đốm lá hành
(Xanthomonas sp.) được chọn ra từ thí nghiệm 2.2.4.
+ Giống hành: giống địa phương được mua tại xã Tân Quới, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long.
- Phương pháp: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 9 nghiệm thức với 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một chậu hành.
Chuẩn bị:
+ Nguồn vi khuẩn lây bệnh: vi khuẩn Xanthomonas sp. được nuôi cấy trên đĩa Petri chứa môi trường King’s B trong 2 ngày. Sau đó dùng nước muối sinh lý 0,9% hòa thành huyền phù vi khuẩn. Lắc đều và pha loãng bằng nước cất thanh trùng đạt mật số 108 cfu/ml dựa trên đường chuẩn vi khuẩn.
+ Nguồn vi khuẩn đối kháng: hai chủng vi khuẩn đối kháng 28 và 64 được nuôi cấy trên từng đĩa Petri riêng biệt chứa môi trường King’s B trong 2 ngày. Sau đó dùng nước muối sinh lý 0,9% hoàn thành huyền phù vi khuẩn. Lắc đều và pha loãng đạt mật số 108 cfu/ml dựa trên đường chuẩn vi khuẩn.
+ Thuốc hóa học: mỗi loại thuốc (Starner 20WP và Xantocin 40WP) được pha theo nồng độ khuyến cáo của nhà sản xuất.
Cách thực hiện:
Mỗi chủng vi khuẩn vùng rễ và mỗi loại dung dịch thuốc được phun ở 2 thời điểm: 1 ngày trước khi lây bệnh và 1 ngày sau khi lây bệnh.
+ Nghiệm thức 1: phun lên lá 20 ml chủng vi khuẩn 28 ở mật số 108 cfu/ml vào 1 ngày trước khi lây bệnh (28 T).
+ Nghiệm thức 2: phun lên lá 20 ml chủng vi khuẩn 64 ở mật số 108 cfu/ml vào 1 ngày trước khi lây bệnh (64 T).
+ Nghiệm thức 3: phun lên lá 20 ml dung dịch thuốc Starner 20WP vào 1 ngày trước khi lây bệnh (Star T).
+ Nghiệm thức 4: phun lên lá 20 ml dung dịch thuốc Xantocin 40WP vào 1 ngày trước khi lây bệnh (Xan T).
+ Nghiệm thức 5: phun lên lá 20 ml chủng vi khuẩn 28 ở mật số 108 cfu/ml vào 1 ngày sau khi lây bệnh (28 S).
+ Nghiệm thức 6: phun lên lá 20 ml chủng vi khuẩn 64 ở mật số 108 cfu/ml vào 1 ngày sau khi lây bệnh (64 S).
+ Nghiệm thức 7: phun lên lá 20 ml dung dịch thuốc Starner 20WP vào 1 ngày sau khi lây bệnh (Star S).
+ Nghiệm thức 8: phun lên lá 20 ml dung dịch thuốc Xantocin 40WP vào 1 ngày sau khi lây bệnh (Xan S).
+ Nghiệm thức đối chứng: lây bệnh không xử lí vi khuẩn vùng rễ và thuốc hóa học (ĐC).
Cách lây bệnh: trước và sau khi lây bệnh 1 ngày các chậu hành được chuyển vào phòng ủ bệnh (25oC). Sau đó, cây được phun đều với huyền phù vi khuẩn (108 cfu/ml) Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá. Từng chậu hành đã lây bệnh được đặt trong khung có túi nylon giữ ẩm và ủ tối. Sau 24 giờ, chuyển cây ra nhà lưới, phun nước tạo lớp sương bề mặt lá (2 giờ/lần) nhằm duy trì độ ẩm cho vi khuẩn gây bệnh xâm nhiễm đến khi bệnh xuất hiện và tiến hành lấy chỉ tiêu.
Ghi nhận và đánh giá:
+ Theo dõi và ghi nhận sự xuất hiện của bệnh giống thí nghiệm 2.2.2. + Xử lý số liệu: số liệu ghi nhận được phân tích xử lý bằng phần mềm thống kê MSTATC (phiên bản 1.2) qua phép thử Duncan.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ – THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY HẠI CỦA
CÁC CHỦNG VI KHUẨN XANTHOMONAS SP.
3.1.1. Kết quả phân lập
Quá trình thu mẫu bệnh và lây bệnh nhân tạo được thực hiện tuần tự theo quy trình Koch, kết quả bước đầu phân lập được 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas
sp. từ các ruộng hành thuộc các tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long và An Giang (Bảng 3.1).
Vi khuẩn sau khi được nuôi cấy trên môi trường King’s B hình thành các khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bóng, với rìa mịn, có màu vàng đặc trưng của chi
Xanthomonas và không phát huỳnh quang.
Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. phân lập được từ các ruộng hành ở các tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long và An Giang
STT Mã số Địa điểm thu mẫu bệnh 1 Xan TN-CT3 Quận Thốt Nốt – thành phố Cần Thơ
2 Xan BT-VL4 Xã Tân Quới – huyện Bình Tân – tỉnh Vĩnh Long 3 Xan CM-AG6 Xã Kiến An – huyện Chợ Mới – tỉnh An Giang 4 Xan CM-AG8 Xã Kiến An – huyện Chợ Mới – tỉnh An Giang 5 Xan CM-AG9 Xã Kiến An – huyện Chợ Mới – tỉnh An Giang
Sau khi phân lập được 5 chủng vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên hành. Tiến hành chủng bệnh nhân tạo trên những cây hành sạch bệnh bằng cách phun huyền phù vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá với mật số 108 cfu/ml lên lá hành. Triệu chứng của bệnh bắt đầu biệu hiện rõ ở thời điểm 2 ngày sau khi lây bệnh (NSKLB). Đầu tiên là sự xuất hiện của những đốm úng nước nhỏ màu trắng trong ở trên mặt lá hoặc hai bên mép lá, bệnh gây hại nặng trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ cao, các vết bệnh lớn dần và liên kết lại tạo thành các khu vực bị hoại tử một phần hoặc cả lá. Kết quả này giống như triệu chứng ban đầu khi thu mẫu ngoài đồng và phù hợp với miêu tả của Alvarez và ctv. (1978); Roumagnac và ctv. (2004b).
A B C
Hình 3.1 Triệu chứng bệnh đốm lá trên hành do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra
(A), (B): Triêu chứng bệnh ban đầu (C): Triệu chứng khi bệnh tiến triển nặng
3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng gây hại
Thí nghiệm đánh giá khả năng gây hại của 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas
sp. được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố trong điểu kiện nhà lưới. Kết quả thí nghiệm được ghi nhận thông qua chỉ tiêu tỷ lệ bệnh và cấp bệnh được trình bài trong Bảng 3.2 và Bảng 3.3.
Qua kết quả tỷ lệ bệnh Bảng 3.2, nhìn chung qua 4 thời điểm khảo sát cho thấy mức độ gây hại của 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. là tương đối cao và có sự khác biệt thống kê giữa 5 chủng ở mức ý nghĩa 5%.
Ở thời điểm 2 NSKLB, bệnh vừa mới xuất hiện nên tỷ lệ bệnh giữa 5 chủng vi khuẩn gây ra chưa cao từ 2,5 đến 47,7%. Trong đó, hai chủng vi khuẩn Xan TN- CT3 và Xan CM-AG6 với tỷ lệ bệnh lần lượt là 47,7% và 41,4%, cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với các chủng vi khuẩn còn lại. Bên cạnh đó, hai chủng vi khuẩn có tỷ lệ bệnh thấp nhất là chủng Xan BT-VL4 (2,5%) và Xan CM-AG8 (2,8%).
Ở thời điểm 3 NSKLB, tỷ lệ bệnh trên chậu do các chủng vi khuẩn gây ra đều tăng, trong đó các chủng vi khuẩn Xan TN-CT3 (50,9%), Xan CM-AG6 (50,1%) và Xan CM-AG9 (38,1%) có tỷ lệ bệnh cao hơn và khác biệt với các chủng vi khuẩn còn lại. Hai chủng vi khuẩn Xan BT-VL4 và Xan CM-AG8 vẫn là hai chủng có tỷ lệ bệnh thấp nhất với tỷ lệ bệnh lần lượt là 13,7% và 13,8%.
Tương tự, ở điểm 4 NSKLB, tỷ lệ bệnh trên chậu do các chủng vi khuẩn gây ra đều tăng, trong đó ba chủng vi khuẩn Xan TN-CT3 (57,1%), Xan CM-AG6 (56,4%) và Xan CM-AG9 (45,0%) vẫn duy trì khả năng gây hại cao hơn và khác biệt với chủng vi khuẩn Xan BT-VL4 (25%).
Đến thời điểm 5 NSKLB, mức độ tỷ lệ bệnh trên chậu do các chủng vi khuẩn gây ra trở nên trầm trọng, trong đó ba chủng vi khuẩn có tỷ lệ bệnh cao nhất là chủng Xan TN-CT3, Xan CM-AG6 và Xan CM-AG9 với tỷ lệ bệnh lần lượt là 60,2%, 61,1% và 55,0%; cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với hai chủng vi khuẩn còn lại Xan BT-VL4 (29,3%) và Xan CM-AG8 (36,0%).
Nhìn chung, trung bình qua 4 thời điểm khảo sát cho thấy khả năng gây hại của 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. là khá cao và tăng theo từng giai đoạn khảo sát. Trong đó hai chủng vi khuẩn Xan TN-CT3 và Xan CM-AG6 đều có khả năng gây hại cao nhất và như nhau, kế đến là chủng Xan CM-AG9, và sau cùng là hai chủng vi khuẩn Xan BT-VL4 và Xan CM-AG8 có khả năng gây hại thấp hơn.
Bảng 3.2 Tỷ lệ bệnh đốm lá trên chậu do 5 chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trong điều kiện nhà lưới qua các ngày sau khi lây bệnh
Ghi chú: Trong cùng một cột những chữ theo sau giống nhau thì k hông k hác biệt thống k ê ở mức ý nghĩa 5% theo phép thử Duncan. *: Khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Tỷ lệ phần trăm bệnh đốm lá được chuyển đổi sang arcsin k hi phân tích thống k ê.
Qua kết quả cấp bệnh đốm lá Bảng 3.3 cho thấy mức độ nhiễm bệnh đốm lá trên hành do 5 chủng vi khuẩn gây ra có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5%.
Ở thời điểm 2 NSKLB, do bệnh mới xuất hiện nên cấp bệnh do các chủng vi khuẩn gây ra chưa cao và không có sự khác biệt ý nghĩa giữa các chủng vi khuẩn.
Ở thời điểm 3 NSKLB, cấp bệnh trên chậu do các chủng vi khuẩn gây ra bắt đầu có sự khác biệt về mặt thống kê. Chủng Xan CM-AG6 có cấp bệnh là 4,0; cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với các chủng vi khuẩn còn lại, kế đến là chủng Xan TN- CT3 (3,3). Chủng Xan BT-VL4, Xan CM-AG8 và Xan CM-AG9 là ba chủng vi khuẩn có cấp bệnh thấp nhất và không khác biệt ý nghĩa với cấp bệnh lần lượt là 2,0; 2,0 và 2,3.
Đến thời điểm 4 NSKLB, cấp bệnh trên chậu do các chủng vi khuẩn gây ra đều tăng, trong đó hai chủng Xan TN-CT3 và Xan CM-AG6 với cấp bệnh tuần tự là 7,8 và 7,5; cao hơn và khác biệt hơn so với các chủng còn lại.
Chủng vi khuẩn
Tỷ lệ bệnh (%) qua các thời điểm
2 NSKLB 3 NSKLB 4 NSKLB 5 NSKLB Xan TN-CT3 47,7 a 50,9 a 57,1 a 60,2 a Xan BT-VL4 2,5 c 13,7 b 25,0 c 29,3 b Xan CM-AG6 41,4 a 50,1 a 56,4 a 61,1 a Xan CM-AG8 2,8 c 13,8 b 33,7 bc 36,0 b Xan CM-AG9 22,4 b 38,1 a 45,0 ab 55,0 a Mức ý nghĩa * * * * CV(%) 29,5 20,2 14,9 18,0
Đến thời điểm 5 NSKLB, cấp bệnh trên lá do các chủng vi khuẩn gây ra tăng cao, trong đó bốn chủng vi khuẩn có cấp bệnh cao đó là chủng Xan TN-CT3, Xan
CM-AG6, Xan CM-AG8 và Xan CM-AG9 với cấp bệnh tuần tự là 10,3; 10,0; 9,0 và 8,3 không khác biệt thống kê. Tuy nhiên, hai chủng vi khuẩn Xan TN-CT3, Xan