Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của 5 nitroisatin và dẫn chất

B ộ Y TÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ QUỐC VĂN HIÉN TỎNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA - NITROISATIN VÀ DẪN CHẤT ( KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHÓA 2002 - 2007) Người hướng dẫn : PGS. TS. NGUYỄN QUANG ĐẠT : TS. TRẦN VIẾT HÙNG Nơi thực hiện: : B ộ MÔN HÓA HỮU c Thời gian thực : 02/2007 - 05/2007 HÀ NỘI 05/2007 LỜ3 CẢm ƠH. Để hoàn thành khóa luận , xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới QLạuụến Qju£utg. ^ i. (J)íếí '^ùíưig., quan tâm, hướng dẫn tận tình chu đáo thời gian thực khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Lê Thị Thúy Hạnh. Phòng Thí nghiệm Trung tâm-Trường đại học Dược Hà Nội. TS. Lê Mai Hương, ThS. Trần Thị Hồng Hà (Phòng thử nghiệm hoạt tính sinh học-Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện KH & CN Việt Nam), cán phòng phân tích khối phổ ( Viện hóa học - Viện KH & CN Việt Nam) toàn thầy cô, kĩ thuật viên môn Hóa hữu cơ, thầy cô trường, phòng ban, thư viện tạo điều kiện hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Cuối xin cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Hà Nội, ngày 19/5/2007. Sinh viên: Lê Quốc Văn Hiến MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐẺ PHẦN I. TỎNG QUAN 1.1. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA DẪN CHẤT ISA TIN 1.1.1. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm . 1.1.2. Tác dụng kháng lao . 1.1.3.Tác dụng chống phân bào . 1.1.4. Tác dụng kháng virus 1.1.5. Tác dụng ức chế men monoaminoxydase (MAO) 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỎNG HỢP - NITROISATIN VÀ DẪN C H Ấ T 1.2.1. Phản ứng nitro hoá isatin . 1.2.2. Phản ứng ngưng tụ isatin với thỉazolin - 2,4 - dion . 10 1.2.3. Phản ứng Mannich .12 PHẦN II. THựC NGHIỆM VÀ KÉTQUẢ 15 2.1.NGUYÊN L IỆ U VÀ PH Ư Ơ N G PH Á P T H ự C N G H IỆ M 15 2.1.1. Hoá chất . 15 2.1.2. Phương tiện . 15 2.1.3. Phương pháp thực nghiệm . 15 2.2.TỎNG HỢP HOÁ H Ọ C 16 2.2.1. Tổng hợp - nỉtroỉsatỉn (1) 16 2.2.2. Tổng hợp thỉazolindin-2,4-dỉon (2) 17 2.2.3. Tổng hợp 5-(5 -nitro - ’-o x o -3 ’-indolinyliden) thỉazolidỉn - 2,4dion(3) 18 2.2.4. Tổng hợp số dẫnchất base Mannich chất (3) 19 2.3. K IÊ M TR A Đ Ộ T IN H K H IẾ T VÀ XÁC NHẬN CẤU TRÚC 25 2.3.1. Sắc kí lớp mỏng 25 2.3.2. Phân tích phổ hồng ngoại . 25 2.3.3. Phân tích phổ tử ngoại 27 2.3.4. Phân tích phổ khối lượng . 28 2.4. THỬ TÁC DỤNG SINH H Ọ C 30 2.4.1. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 30 2.4.2. Thử hoạt tính dòng tế bào ung thư người 35 2.5. BÀN L U Ậ N . 37 2.5.1. Bàn luận tổng hợp hoá học 37 2.5.2. Bàn luận xác định cấu trúc . 37 2.5.3. Bàn luận hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm . 37 2.5.4. Bàn luận hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư người .38 PHẦN III. KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 39 3.1. KÊT L U Ậ N . 39 3.2. ĐỀ X U Ấ T 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CÁC CHỮ VIÉT TẮT DMF : Dimethylformamid. : Dimethylsulfoxyd DMSO IR KLPT MIC MS SKLM uv vsv : Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại). : Khối lượng phân tử. : Minimal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu). : Mass spectroscopy (Phổ khối lượng) : Sắc kí lóp mỏng. : Ultraviolet spectroscopy (Phổ tử ngoại) : Vi sinh vật ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày với phát triển mạnh mẽ khoa học kĩ thuật xuất nhiều bệnh có mức độ nguy hiểm cao. Khi nhu cầu phòng chữa bệnh ngày tăng, chế phẩm thiên nhiên dùng làm thuốc khó đáp ứng nhu cầu đó. Do nhà khoa học tiến hành nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp hóa học để tìm chất có hoạt tính sinh học. Trong kỉ 21, nhu cầu chăm sóc sức khỏe người ngày quan tâm đặc biệt, vấn đề tìm loại thuốc có hiệu điều trị cao, an toàn cho người sử dụng đặt lên hàng đầu. Tuy nhiên để tìm loại thuốc nhà sản xuất phải đầu tư lượng kinh phí khổng lồ (300-800triệu USD/1 thuốc) cho hoạt động nghiên cứu, tổng hợp, thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng. Do vậy, nhà khoa học tập trung nghiên cứu, tổng hợp loại thuốc từ chất biết tác dụng sinh học sử dụng làm thuốc cách thay đổi cấu trúc hóa học chất để giảm chi phí thời gian nghiên cứu. Isatin dẫn chất dãy chất hữu nghiên cứu cách có hệ thống cấu trúc hóa học tác dụng sinh học. Nhiều công trình nghiên cứu công bố cho thấy chất isatin có hoạt tính sinh học phong phú như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng lao, chống phân bào, ức chế men monoaminoxydase . nhiều tác dụng dược lí khác [3-5], [25], [27], [33], [37]. Đáng ý số công trình nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn hợp chất nitro dị vòng, có 5-nitroisatin [16],[23],[29]. Vì để góp phần nghiên cứu dẫn chất isatin tiến hành tổng họp thăm dò tác dụng sinh học -nitroisatin dẫn chất với mục tiêu sau: + Tổng hợp 5-nitroisatin sổ dẫn chất 5-nitroisatin phản ứng ngimg tụ phản ứng Mannich. + Thử tác dụng sinh học chất tổng hợp với hi vọng tìm chất có tác dụng sinh học rút nhận xét sơ mối liên quan cấu trúc tác dụng. Chúng hi vọng ràng, nghiên cứu góp phần nhỏ vào nghiên cứu, tìm kiếm hoạt chất có tác dụng sinh học cao thuộc dẫn chất isatin. PHẦN I: TỒNG QUAN 1.1.TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẴN CHẤT CỦA ISATIN: Qua tham khảo tài liệu nghiên cứu isatin dẫn chất [3 5], [12], [25], [28], [33], [36] cho thấy dẫn chất isatin có nhiều tác dụng sinh học đáng quý sau: • Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm. • Tác dụng kháng lao. • Tác dụng chống ung thư. • Tác dụng kháng virus. • Tác dụng ức chế men m o n o a m i n o x y d a s e (MAO). 1.1.1.Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm. Tác giả D. Maysinger M. Movrin M. M. Saric [33] nghiên cứu tổng hợp thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 17 dẫn chất base Mannich hydrazon 5-iodoisatin 5-cloroisatin vào năm 1980. ------NHR X=-I, -C1 R=-H, -CH3 -COCH3 -cs, -NH2 NRR' = -N(CH2CH20H)2 -N(CH(CH3)2)2 -----N o \__y /■ -N Kết thu chất tác dụng tốt với vi khuẩn Gram(+) Staphylococcus aureus. Staphylococcus albus vi khuẩn Gram(-) : Escherichia coli, Klebsỉela preumoniae nồng độ khác nhau. Cũng thời gian tác giả K.C.V.N. Pathark S.K. Jain [28] tổng hợp thử tác dụng vi khuẩn Gram(-) Gram(+) isatin dẫn chất có tác dụng vi khuẩn như: Staphylococcus albus, Escherichia coli nồng độ khác nhau. X n N----NHCO \ / -OH vNH2 Tác giả Nguyễn Quang Đạt, Trần Viết Hùng cộng nghiên cứu, tổng họp thử tác dụng sinh học dẫn chất -fluoroisatin [10], [13], [14; kết thu 5-fluoroisatin, 5-fluoro-l-morpholinomethylisatin, 5fluoro-1-piperidinomethylisatin có tác dụng mạnh với chủng vi khuẩn thử nghiệm base Mannich có tác dụng mạnh hon so với chất dãy, chúng có tác dụng với nấm Candida albicans. / \ \ / / \ \ / T B = .T S r L Tiếp theo vào năm 2000, tác giả tiếp tục nghiên cứu tổng hợp thăm dò tác dụng sinh học 5-bromo-l-morpholinomethylisatin dẫn chất chúng [9], có tác dụng mạnh với chủng vi sinh vật thử nghiệm nộng độ Img/ml, 1.1.2.Tác dụng kháng lao Năm 1967, tác giả A.B.Tomchin cộng thử tác dụng kháng lao isonicotinoylhydrazon isatin. Kết cho thấy chất có tác dụng ức chế trực khuẩn lao nồng độ 2ịig/ml. Đặc biệt tác dụng tốt với chủng Mycobacterium tubercuclosỉs kháng rimifon streptomycin. — m i— C— C5 H4 N Năm 2000 tác giả Nguyễn Quang Đạt Trần Viết Hùng cộng sâu nghiên cứu tác dụng kháng lao số dẫn chất thiosermicarbazon isonicotinoylhydrazon isatin -halogenoisatin [ 13]. Kết cho thấy 12 dẫn chất có tác dụng mạnh với với trực khuẩn lao ( MIC: 0,2-50 |ag/ml) dẫn chất 5-bromo có tác dụng mạnh dẫn chất không thế. Trong ý có số dẫn chất có tác dụng với trực khuẩn lao kháng rimifon (MIC: 5fig/ml) : ------^NH------ C -------C H N T -C H n / \ / / -NT / 1.1.3. Tác dụng chống ung thư. ưng thư bệnh nguy hiểm mà loài người mắc phải có xu hướng ngày tăng nên vấn đề đặt tìm chất r^RKiNBLỈỳĩBrĩ -NH N \^ ;^ 33.47- Xĩ N o rti/iiI Aỉì\ „ư / ỉ *1 ìỉ ỉị .Mí ỉ^' li ỉ !; ~3.2B-V - . ^ 4000 3500 3000 2500 07/04/30 09:14 Phon3 TNTT-DH Duoc Z; scan, 4.0cm~l, smooth Mau L3 £000 1500 1000 :-0Ũ FHERKiN E L M B R 3S ■;T — N— C íí------ I s A o \ CH /C H / : h 2-------- N \ CH3 ^V\A i AM . in i i '■ ị Ỉ p 'lí/ n ! ji I/ 01^10 :: 1,7790 m :: 207.00 ZUY.UU -> Base 1ine Erase Uieu Re-scale Zoom Cursor lĩBBBiT More Urite labels aw the graph_______________________________ 600.00 Phụ lục 2.1: Phổ tử ngoại chất (1) ABS ABS 1.150 NM 041.0 Gain Baseline 20 .000 Ụaii Hien 93 OFF SBW Page May 2007 2.0 ftBS_____________ : -Q.B598 -> 1.2Q86__________ Nil Baseline Erase Uieu Re-scale Zoom Cursor Urite labels on the graph__________________________ 0 . 0 _______ : . Q Q ->600.00 -^208.00 i^jHI More NM .9 : 0.66812 0.86358 ABS ABS ABS NM NM NM May 2007 0.0413 - Baseline ABS 352.000 239.000 215.000 92 OFF SBU Page 2.0 600.00 NM ____ _ DISPLAY DATA 0.8OOO-. 0.4000“ 0.0000. ABS_____________ : -Q.0446 -> 0.9850___________ NM : 209.00 -> 600.00 Baseline Erase Uiew Re-scale Zoom Cursor More Write labels on the graph____ __ _____________________________________________ Phu luc 2.3: Ph6 tu ngoai cua chdt (3) ABS ABS - .45220 0.36105 0.0437 ABS NM NM 326.000 24 .000 Le Quoc Man Hien Gain 93 Basel ine____ OFF 250.00 SBU Page 350.00 May 2007 2.0 3___________ 450.00 ABS_____________ : -0.0232 -> 0.4816___________ NM Basel ine Erase Uiew Re-scale Zoom Cursor Write labels on the graph 600.00 _______ NM 550.00 : 210.00 -> HBBBH More 680.00 0.38298 0.31872 -0.0415 ^BS Gain 92 Basel ine____ OFF SBU Page 2.0 _________ ftBS_____________ : -Q.Q232 ~> 0.4816___________NT Baseline Erase Uiew Fe~scale Zoom Cursor Write labels on the graph_____________________ _ Hay 2007 600.00 _________ 21Q.0B ~> More NH 606.QQ Phụ lục 2.5: Phổ tử ngoại chất (5) ABS ABS ABS 0.18328 0.13207 .20094 325.000 288.000 233.000 NM NM NM -0.0418 Gain ỈĨ.S“ “ "ềr 93 Basel ine____ OFF ABS__________ ABS_____________ : -Q.Q172 -> SBW Page May 2007 2. 3__________ 0.3241___________ m 600.00 _______m ^ .0 Baseline Erase Uiew Re-scale Zoom Cursor fiorc ¿rite labels on the cyraph . . . File Operator Acquired Instrument: Sample Name Misc Info Vial N u m b e r C : \ H P C H E M \ \ D A T A \ D - D I P .D P h o n g C a u true, V i e n H o a h o c M a y 107 3:25 pm usi n g A c q M e t h o d 5989B MS LI C H C -f C H H DEFAULT Abundance 4500Q Scan T O ( .340 mih) : D - D I P I . D 90 63 40000 35000 30000 25000 20000 75 15000 10000 192 52 79 134 118 5000 96 50 60 70 80 90 1 65 117 --I I . ' ^ '1 148 i ~ |; léo 170 ĨỖỖ/ 1^0 20 Sea. . 102 (5.340 r n) : D - D I P . D L1 m/z abund. m/z abund. 61.05 5516 10156 50.10 21344 62.05 9174 51.10 63,05 10490 41280 52,10 9035 64.05 5461 53.10 65.05 1450 88 54.10 1787 66.05 2286 55.10 804 67.05 2035 56.10 68.05 809 57.20 2291 1421 69.05 320 58.20 70.15 767 587 .Ĩ0 71.15 2145 60.10 S e a n (5[...]... 33 35 1770 NO 2 benzen 1619 153 3 1242 1336 3 11 95 (1) 1127 3 158 2821 (2 ) 1736 1390 1 656 31 85 1747 1621 16 85 (3) 152 2 1460 1341 1 257 1188 1 151 2960 1746 16 15 1690 (4) 152 5 1469 1336 1238 1189 11 35 2 959 2 856 (5) 1747 1611 16 85 152 0 1 457 1341 1228 11 65 11 15 2937 2 853 (6 ) 17 45 16 85 1611 152 2 1339 1447 1208 1178 1 152 „ - r isatin) và hai dải hấp thụ của nitro (v asN0 2 153 3cm'’ và VsN0 2 1336cm‘’) Chất. .. gồm 5 - nitroisatin (1) và thiazolidin-2,4-dion (2), dẫn chất ngưng tụ của 5 nitroisatin và thiazolidin-2,4-dion (3) và 3 dẫn chất base di-Mannich của chất (3) là các chất (4 -6 ) 2 Đã tiến hành khảo sát thông số thời gian phản ứng bằng SKLM để tìm thời gian đem lại hiệu xuất tối đa 3 Đã kiểm tra độ tinh khiết của chất tổng hợp được bằng SKLM và nhiệt độ nóng chảy của chúng 4 Các chất được tổng hợp. .. sự nghiên cứu sơ bộ về tác dụng kháng MAO của isatin, B.Grinberg và cộng sự đã tổng hợp và thử tác dụng của 18 dẫn chất isatin trên gan lọn Kết quả cho thấy 18 dẫn chất này đều có tác dụng ức chế men MAO trong dịch đồng nhất của gan lợn [26' Bảng tóm tắt tác dụng sinh học của isatin được tóm tắt ở bảng 1: Bảng 1: Tóm tắt tác dụng sinh học của các dẫn chất của ỉsatỉn STT Tác dụng R =-B r,-N O 2 •Q R... học các dẫn chất tổng hợp được Với 6 mẫu chất tổng hợp được chúng tôi đã gửi tới Phòng Sinh học thực nghiệm Viện Hoá học các họp chất thiên nhiên (Viện KH & CN Việt Nam) tiến hành thử tác dụng sinh học theo phương pháp hiện đại nhằm thu được kết quả chính xác và khách quan, a> Nguyên tắc thử Để sàng lọc các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm chúng tôi tiến hành thử hoạt tính vi sinh vật trên phiến... 3 158 em'’ (vNH imid) và 2821 em'' (vCH2 ở dị vòng) Chất (3) trong cấu trúc phân tử có nhóm-NH của dị vòng thiazolidin2,4-dion và dị vòng isatin, thể hiện ở dải hấp thụ 3185cm'’ Ba chất (4-6) không có dải hấp thụ của nhóm -NH và xuất hiện các dải hấp thụ ở 2960-2937cm'’ (VCH2) và 2 856 -2 853 em'' (VCH2) chứng tỏ phản ứng tạo dẫn chất base di-Mannich đã xảy ra và tạo chất đúng như dự kiến Năm chất gồm chất. .. c ủ a p h â n tử 5- nitroisatin Phổ tử ngoại của chất (2) có cực đại hấp thụ ở 220nm được quy cho mức chuyển năng lượng n-n* của dị vòng thiazolidin-2,4-dion Phổ tử ngoại của chất (3) có 3 cực đại hấp thụ ở 215nm, 239nm và 352 nm được quy cho mức chuyển năng lượng 7C-7C của nhân thom và hệ liên * hợp phân tử do sự ngưng tụ 5- nitroisatin với thiazolidin-2,4-dion Phổ tử ngoại của 3 dẫn chất base Mannich... chất (1) có phổ đồ MS trùng với phổ đồ 5- nitroisatin ở thư viện phổ -N O , -C O m/z 90 m/z 118 -H C N C 5H 3" ơN's,,^:íí=\, 2 — m/z 192 H m/z 63 ỉIh m/z 164 -C O islH -N O m/z 134 m/z 106 2.4 THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC 2.4.1 Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Với mục đích tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học cao, có khả năng sử dụng làm thuốc Chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng sinh học các dẫn chất. .. cấu trúc bằng phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại và phổ khối lượng sẽ được trình bày ở phần sau Bảng 2: Hiệu suất và hằng số vật lí các dẫn chất 5 - nitroỉsatin tổng hợp được •N R 0,N (3-6) Chất Nhóm thế ( R ) (5) * (6 )* C 8H4N 2O4 291. 25 R=H (3) (4)* CTPT,KLPT CisHioNsSOs 4 05, 42 R = CH2-N(CH3)2 R- R= ch2 W CHj -J b C2,H2,N5S07 489,26 C23H25N 5SO5 4 85, 57 (* : Chất chưa thấy công bố trong các tài liệu... thư [ ] 20 [ 35] 1.2 PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP 5- NITROISATIN VÀ DẪN CHẤT Do cấu trúc phân tử của isatin có nhân thom và có nhóm thế c=0, N-H nên có nhiều khả năng tham gia các phản ứng chuyển hóa để tạo thành các dẫn chất khác nhau Trong phần này chúng tôi trình bày ngắn gọn các phản ứng được sử dụng để tổng họp các chất dự kiến - Phản ứng nitro hóa isatin - Phản ứng ngưng tụ is a tin và dẫn chất với thiazolidin-2,4-dion.. .tổng hợp có tác dụng chống ung thư có hiệu quả cao trong điều trị Một hướng tổng hợp các dẫn chất xuất phát từ các dẫn chất isatin đã thu lại nhiều thành công, đặc biệt là các dẫn chất base Mannich và một số dẫn chất hydrazon ngưng tụ với thiazolidin-2,4-dion đã được nghiên cứu chúng có tác dụng chống ung thư F.D Pop [33] đa tổng hợp và công bố tác dụng chống ung thư của 3 (o-nitrophenyl) . các dẫn chất isatin chúng tôi tiến hành tổng họp và thăm dò tác dụng sinh học của 5- nitroisatin và dẫn chất với các mục tiêu như sau: + Tổng hợp 5- nitroisatin và một sổ dẫn chất của 5- nitroisatin. nghiệm 15 2.2.TỎNG HỢP HOÁ HỌC 16 2.2.1. Tổng hợp 5 - nỉtroỉsatỉn (1) 16 2.2.2. Tổng hợp thỉazolindin-2,4-dỉon (2) 17 2.2.3. Tổng hợp 5- (5 -nitro -2 ’-oxo-3’-indolinyliden) thỉazolidỉn - 2, 4- dion(3). Hùng và cộng sự đã nghiên cứu, tổng họp và thử tác dụng sinh học của dẫn chất 5- fluoroisatin [10], [13], [14; kết quả thu được 5- fluoroisatin, 5- fluoro-l-morpholinomethylisatin, 5- fluoro-1-piperidinomethylisatin