Tại phòng thí nghiệm trung tâm trưòng Đại học Dược Hà Nội, 6 chất
(1-6) được ghi phổ tử ngoại trên máy lE UV-Visible Spectrophotometer,
dung môi ethanol ở nồng độ 2 0ịj,g/ml.
Các phổ được trình bày ở phụ lục 2,1-2.6
Các giá trị Xmax được ghi ở bảng 5, các số liệu này phù hợp với tài liệu
tham khảo [20 ], [21],[37].
Bảng 5: Giá trị >iniax của các chất tổng hợp được.
Chất Amax (nm) (1) 244 324 (2) 220 (3) 215 239 352 (4) 240 326 (5) 240 338 (6) 233 325
Nhận xét về mối liên quan cấu trúc - phổ tử ngoại,
Phổ tử ngoại của chất (1) có 2 cực đại hấp thụ ở 244nm và 324nm được
q u y c h o m ứ c c h u y ể n n ă n g l ư ợ n g 7Ü-71* c ủ a n h â n t h ơ m v à h ệ l i ê n h ợ p c ủ a p h â n
tử 5-nitroisatin.
Phổ tử ngoại của chất (2) có cực đại hấp thụ ở 220nm được quy cho
mức chuyển năng lượng n-n* của dị vòng thiazolidin-2,4-dion.
Phổ tử ngoại của chất (3) có 3 cực đại hấp thụ ở 215nm, 239nm và
352nm được quy cho mức chuyển năng lượng 7C-7C* của nhân thom và hệ liên
hợp phân tử do sự ngưng tụ 5-nitroisatin với thiazolidin-2,4-dion.
Phổ tử ngoại của 3 dẫn chất base Mannich (4-6) có dạng phổ khá giống nhau và giống chất (3) và có A^ax khác nhau rất ít do có cùng khung phân tử, đồng thời có thể nhận thấy các nhóm base Mannich ít ảnh hưởng đến phổ tử ngoại tổng họp được.
2.2.4. Phân tích phổ khối lượng
Phổ khối lượng được ghi trên máy HP-5989 và máy LC-MSD-Trap SL tại phòng phân tích khổ phối thuộc Viện Hoá học-Viện KH & CN Việt Nam. Do điều kiện có hạn chúng tôi chỉ tiến hành ghi phổ 3 chất (1), (3), (5). Ba chất (1), (3), (5) được đo bằng máy HP 5989 và chất (5) được đo thêm bằng máy LC-MSD-Trap SL để ghi được ion phân tử do phân tử này cồng kềnh và có độ phân cực cao đồng thời kém bền dưới năng lượng bắn phá lớn. Phổ đồ được ghi ở phụ lục 3.1-3.3.
Chất CTPT m/z 0 , N (1) K L P T :192,13 H 192 (M^) 164 (M -C O ) 134 (164-N O ) 1 1 8 ( 1 6 4 - N 0 2 ) 106 (134-C O ) 90 (118-C O ) 63 (9 0 -H C N ) Oo N (3) KLPT: 2 9 1 , 2 5 291(M^) 220(M - HNCO - CO) 174 (2 2O -N O2) 146 (174-C O ) 119(146-H C N ) 6 9 ( 1 1 9 - C 4 H 3 + 1H) 5 5 ( 1 1 9 - C 5 H 4 ) 0,N •N--- CHj— N (5) s ồ CI^—N o KLPT: 525,26 \ ^ í ~ \ ' w ° 489 (M") ^ ^ 390 ( M H - C H r V 0 ) 291 (390- C H3- N 0 + IH v _ y 174 ( 2 9 1 - H N C O - C O - N O , ) 100( — C H j—N o )
Kết quả phân tích phổ cho thấy ba chất (1), (3), (5) có pic phân tử và có số khối đúng bằng số khối của chất dự kiến. Ngoài ra còn cho phép nhận ra các ion mảnh của 3 chất trên phù hợp với sơ đồ phân mảnh. Riêng chất (1) có phổ đồ MS trùng với phổ đồ 5-nitroisatin ở thư viện phổ.
m/z 192 H - N O , ơ2N's,,^:íí=\,____ —ỉIh m/z 164 - C O m/z 118 - N O - C O m/z 134 m/z 90 - H C N C 5H 3" m/z 63 islH m/z 106 2.4. TH Ử TÁC DỤNG SINH HỌC. 2.4.1. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm.
Với mục đích tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học cao, có khả năng sử dụng làm thuốc. Chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng sinh học các dẫn chất tổng hợp được.
Với 6 mẫu chất tổng hợp được chúng tôi đã gửi tới Phòng Sinh học thực nghiệm Viện Hoá học các họp chất thiên nhiên (Viện KH & CN Việt Nam) tiến hành thử tác dụng sinh học theo phương pháp hiện đại nhằm thu được kết quả chính xác và khách quan,
a> Nguyên tắc thử.
Để sàng lọc các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm chúng tôi tiến hành thử hoạt tính vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 giếng của các chất tổng hợp được theo phưong pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlnck (1994) theo 2 bước:
+ Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính.
+ Kháng sinh kiểm định bao gồm Ampicilin đối với vi khuẩn Gram(+), Tetracyclin đối với vi khuẩn Gram(-), Nystatin đối với nấm sợi và nấm men.
Vi khuẩn kiểm định bao gồm;
Vi khuẩn Gram(+): Bacillus subtỉllỉs (ATCC 27212)
Staphylococcus aureus
Vi khuẩn Gram(-): Escherichia colỉ (ATCC 25922)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25932)
Nấm sợi: Aspergillus niger
Fusarium oxysporum.
Nấm men: Candida albicans
Saccharomyces cerevỉsỉae
Nấm và vi khuẩn được nuôi trong môi trường dinh dưỡng: Sabouraud dextrose broth và Trypease soya broth (TBS). Các chủng kiểm định được hoạt hoá trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn và 48 giờ với nấm) trước khi tiến hành thử nghiệm.
Mầu thử nghiệm được hoà tan trong DM^O, với 4 - 1 0 thang nồng độ được pha loãng từ dung dịch gốc rồi chuyển sang phiến vi lượng 96 giếng. Vi sinh vật kiểm định sau khi hoạt hoá được pha loãng bằng môi trường dinh dưõng cho tới nồng độ tương đương 0,5dv Meland (khoảng 10^ vsv/ml). Đe
tủ ấm 37^C/24h đối với vi khuẩn và 30^c/48h với nấm. Sau đó đọc kết quả và
tính giá trị ức chế tối thiểu (MIC).
Mầu thô có MIC < 200|j,g/ml. Mầu tinh có MIC < 50|^g/ml là có hoạt tính.
b> Các bươc tiến hành:
Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính.
Nấm và vi khuẩn được nuôi dưỡng trong môi trường dinh dưỡng Sabouraud dextrose broth và Trypease soya broth (TBS). Các chủng kiểm định được hoạt hoá trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn và 48 giờ với nấm) trước khi tiến hành thử nghiệm,
+ Chuẩn bị mẫu thử:
Hoà tan các chất trong dimg môi DMSO 100% bằng máy Vortex với nồng độ 4mg/ml.
Từ dung dịch gốc chuyển sang phiến vi lượng 96 giếng.
Nhỏ vào mỗi giếng đã có mẫu sẵn dung dịch v s v đã hoạt hoá.
+ Chuẩn bị mẫu đối chứng dương.
Dãy 1: Môi trường.
Dãy 2: Kháng sinh Ampicilin + vi khuẩn Gram(+) kiểm định
(Ampicilin được pha trong dung dịch DMSO 100% ở nồng độ 0,4nm/ml).
Dãy 3: Kháng sinh tetracyclin + vi khuẩn Gram(-) kiểm định
(Tetracyclin được pha trong dung dịch DMSO 100% ở nồng độ 0,4nm/ml)
+ Chuẩn bị mẫu đổi chứng âm.
Chỉ có vi sinh vật kiểm định.
+ Đọc kết quả:
Mầu dưong tính khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt không thấy có vi sinh vật kiểm định phát triển giống như hình ảnh ở các giếng chứng dương.
Mức dương ở bước một sẽ được tiếp tục thử bước 2 để tính giá trị MIC.
Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu của các chất có hoạt tính.
Các bước tiến hành như bước 1, riêng mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ở
bước 1 được pha loãng theo các nồng độ thấp dần từ 4- 10 thang nồng độ để tính giá trị tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.
Đọc kết quả: Nồng độ dương tính là nồng độ ở đó không có vi sinh vật phát triển như mẫu thô có MIC < 200|ag/ml. Mầu tinh có MIC < 50|ag/ml là có hoạt tính.
c> Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.
Nồng độ ức chế tối thiểu ( MIC: |xg/ml)
Chất Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn Gr (+) Nâm môcr ĩ Nấm men
E. coli p. aerugỉnosa B.subtillis s. aureus Asp,nỉger F. oxysporum Sxerevisỉae CMỈbicans
1 (-) (-) 50 (-) (-) (") (“)
3 (-) (-) (-) (-) (■) (-) (■) (-)
4 (-) (-) (-) (-) (-) (“) (")
5 (-) (-) (-) (■) (") (") (■)
Sau khi tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của 6 hợp chất tổng hợp được tại phòng sinh học thực nghiệm-Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên (Viện KH & CN Việt Nam) trên 4 chủng vi khuẩn chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:
Chỉ có chất (1) có hoạt tính kháng vi khuẩn Bacỉllus subtillis (MIC =
50|ag/ml) và không tác dụng trên các vi khuẩn, vi nấm kiểm định khác.
Các chất (3); (4); (5); (6); cho kết quả âm tính với các vi khuẩn, vi nấm
kiểm định.
2.4.2. Thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư người.
Ngày nay, bệnh ung thư ngày càng phát triển, vấn đề tìm ra các chất có tác dụng trong điều trị ung thư trở nên cấp thiết. Từ yêu cầu này chúng tôi quyết định nghiên cứu hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người của một số chất tổng hợp được với mong muốn tìm được các chất chống ung thư mới.
a> Nguyên tắc:
Tiến hành theo phương pháp của Likhiwitayawuid đang được tiến hành tại viện nghiên cứu ung thư quốc gia Hoa Kỳ.
Dòng tế bào nghiên cứu:
+ Hep-2: Tế bào ung thư gan ở người.
+ LU: xế bào ung thư phổi ở người.
b> Tiến hành.
Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện ở phòng sinh học thực nghiệm, viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên thuộc viện KH& CN Việt Nam.
xế bào ung thư được duy trì liên tục ở điều kiện chuẩn. Sau khi tế bào
thử đã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại 3 lần trên phiến vi lượng 96 giếng trong dung môi DMSO.
Phiến thử nghiệm được ủ ấm trong tủ ấm C0 2/3 7°C/ 48h - 72h dể tế
bào tiếp tục phát triển, bao gồm: xế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử.
Sau đó lấy ra cố định tế bào, rửa, nhuộm tế bào và hoà lại bằng dung dịch chuẩn. Đọc kết quả trên máy Elisa, bước sóng 495-515nm.
Nồng độ ức chế tế bào ung thư của chất thử được tính bắng giá trị IC50.
Giá trị này được tính bằng chương trình Table curve với giá trị logarid dựa trên giá trị dãy thang nồng độ khác nhau của chất thử và giá trị mật độ quang (Optical density-OD) đo được.
Các chất mẫu tinh khiết có giá trị IC50 < 5)j,g/ml coi là có hoạt tính
c> Kết quả.
Kết quả thực nghiệm được ghi ở bảng 8:
Bảng 8: Kết quả thử hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư ngưcrí của chất thử.
STT Chât Dòng tê bào
H e p -2
Dòng tê bào Lu
Kêt luận
IC50 (%) Tê bào
sống sót IC50 (|ig/ml) (%) Tê bào sống sót 1 (1) >5 83,8± 0,4 >5 95,5 ±0,49 (-) 2 (3) >5 79,2±0,5 >5 73,3±0,5 (-) 3 (5) >5 81,9 ±0,5 >5 97,2±0,6 (-)
Từ bảng kết quả chúng tôi nhận xét rằng: Các chất đem thử nghiệm đều cho kết quả âm tính với 2 dòng tế bào ung thư ở người là Hep - 2, và Lu.
2.6. BÀN LUẬN.
2.6.1. về tổng hợp hoá học.
- Chúng tôi đã tổng hợp được 5-nitroisatin với hiệu xuất cao hơn tài liệu đă công bố [16] (84,6% so với 77%). Chúng tôi nhận xét rằng hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ thấp khá đặc và sánh cần được khuấy trộn tốt. Mặt khác chúng tôi tìm được phưoTig pháp tinh chế sản phẩm phản ứng bằng cách khuấy trộn đều sản phẩm thô trong ethanol sôi, khi đó isatin chưa phản ứng bị hòa tan và được loại đi dễ dàng, trong khi đó nếu kết tinh bằng ethanol 90*^ như tài liệu [16] thì sản phẩm vẫn còn isatin khi kiểm tra bằng SKLM.
- Phản ứng ngưng tụ của 5-nitroisatin với thiazolidin-2,4-dion được thực hiện trong môi trường acid acetic băng và xúc tác là natriacetat khan cho hiệu xuất cao hon tài liệu công bố [16] (87,6% so với 75,5%).
- Phản ứng Mannich của chất (3) với các amin bậc 2: dimethylamin, moĩpholin, piperidin xảy ra tương đối dễ dàng ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ đã tạo ra các dẫn chất base di-Mannich (4-6). Kết quả này phù hợp với các công trình đã công bố [6], [15] về tổng hợp các dẫn chất isatin tương tự.
2.6.2. về xác định cấu trúc
Các kết quả phân tích phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại và phổ khối lượng đã cho phép chúng tôi kết luận cấu trúc các chất tổng hơp đúng như dự kiến, đặc biệt phổ hồng ngoại và phổ khối lượng đã xác định rõ cấu trúc của sản phẩm ngưng tụ và các dẫn chất base di - Mannich dự kiến tổng họp được.
2.6.3. v ề hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm
Từ kết quả đã nêu ở bảng 6 và cho thấy 5-nitroisatin và dẫn chất tổng hợp được hầu như không có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. Trong khi đó isatin và 5-methylisatin có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm khá mạnh [6].Có thể giải thích sự khác biệt trên như sau :
• Nhóm nitro gắn vào isatin làm thay đổi các tính chất lí hóa đặc biệt là hệ số phân bố nước/lipid nên chúng khó thấm qua màng tế bào vi khuẩn, vi nấm do đó không gây ra tác dụng.
• Các base di-Mannich có công thức phân tử rất cồng kềnh đã trực tiếp gây cản trở không gian ngăn cản chúng đi qua màng tế bào vi khuẩn, vi nấm để gây ra tác dụng.
2.6.4. về hoạt tính kháng tế bào ung thư ở người.
Từ kết quả về hoạt tính kháng tế bào ung thư ở người ở bảng 8, với 3
chất thử nghiệm là (1), (3), (5) đều cho kết quả âm tính. Điều này có thể lí
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT.
3.1. KỂT LUẬN
Từ một số nghiên cứu được trình bày trên chúng tôi đưa ra một sổ kết luận như sau:
1. Chúng tôi đã tổng hợp được 6 chất gồm 5-nitroisatin (1), thiazolidin-2,4-dion (2), và 4 dẫn chất của 5-nitroisatin (3-6), trong đó có 3 chất (4), (5), (6) chưa thấy công bố trong các tài liệu mà chúng tôi tham khảo được.
2. Các phản ứng tổng họp đã được theo dõi bằng SKLM để xác định thời gian phản ứng thích hợp.
3. Đã kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng họp được bằng SKLM và xác định cấu trúc bằng phổ hồng ngoại, tử ngoại và phổ khối. Kết quả cho phép chúng tôi kết luận đã tổng hợp được các chất đúng như dự kiến.
4. Đã thử tác dụng kháng khuẩn kháng nấm của 5 chất tổng hợp được
(1), (3), (4), (5), (6) với 4 chủng vi khuẩn {Bacillus subtỉllis. Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) và 4 chủng vi nấm
(Aspergillus nỉger, Fusarium oxysporum, Candida albicans, Saccharomyces
cerevisiae). Kết quả chất (3) có hoạt tính kháng vi khuẩn Bacillus subtillis
(MIC = 50|ig/ml), các chất còn lại đều âm tính với các vi sinh vật kiểm định. 5. Đã tiến hành thử hoạt tính kháng hai dòng tế bào ung thư ở người là: Hep-2 và Lu với 3 chất: (1), (3), (5). Kết quả các chất đem thử đều âm tính với hai dòng tế bào ung thư ở người.
3.2. Đ Ề XUẤT.
Với kết quả đạt được trong quá trình thực nghiệm chúng tôi hi vọng góp phần nhỏ làm phong phú thêm các nghiên cứu về dẫn chất isatin. Đe tiếp tục và phát triển các kết quả đã đạt được chúng tôi đề xuất như sau:.
• Nghiên cứu các hoạt tính sinh học khác của 5-nitroisatin và dẫn chất tổng hợp được như hoạt tính kháng virus hay khả năng ức chế monoaminoxydase (MAO) như một số công trình về dẫn chất isatin đã công bố.
• Tổng hợp các dẫn chất isatin tương tự với các nhóm thế khác nhau ở vị trí 5 và thử sàng lọc hoạt tính sinh học của chúng để tìm kiếm các dẫn chất isatin mới có hoạt tính sinh học cao.
TÀI LIỆU THAM KHẢO.
1. Bộ môn Hoá hữu cơ. Truờng đại học Dược Hà Nội (2006). Hoả hữu
cơ tập 1.
2. Dược điển Việt Nam / / (1994), NXB Y học, tập 3 trang 504.
3. Nguyễn Quang Đạt, Bùi Kim Liên (1977). Nghiên cứu tác dụng chống
phân bào. Thông báo khoa học. Đại học dược Hà Nội. số 27. Trang 9 7 -1 0 3 .
4. Nguyễn Quang Đạt, Nguyễn Xuân Thủy, Phạm Minh Tâm (1981).
Tóm tắt các báo cáo khoa học hội nghị khoa học toàn quốc. Trang 37.
5. Nguyễn Quang Đạt, Trần Viết Hùng và cộng sự (1998). Tổng hợp và
thăm dò tác dụng sinh học của một số dẫn chất Isatin. Tạp chí dược học, số
12, trang 8 -10. (1998).
6. Nguyễn Quang Đạt, Trần Viết Hùng, Hà Quốc Khánh (2007). Tổng
hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất isatin, Tạp chí dược học, số
4, trang 26-28.
7. Vũ Thị Thu Hà. Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của 7 -
cloroỉsatin và dẫn chất. Khoá luận tốt nghiệp của dược sĩ khoá 54.
8. Nguyễn Thị Bích Hạnh. Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của 7 -
cloroisatin và dẫn chất. Khoá luận tốt nghiệp của dược sĩ khoá 55.
9. Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt (1999). Tổng hợp và thăm dò tác dụng kháng khuẩn kháng nấm của N - hydroxymethyl - 5 - bromoisatin và
dẫn chất. Tạp chỉ Dược học, số 10, trang 4 - 5 .
10. Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Nguyễn Thị Phượng (1999). Tổng hợp và thăm dò tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 5 - fl ouroisatin
11. Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Chu Thị Lộc. Tổng hợp và thăm dò tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 5 - fl ouroisatin - 3 - arylimin và