nghiên cứu bệnh đen thân trên cá sặc rằn (trichogaster pectoralis) nuôi thâm canh ở tỉnh đồng tháp

Đề tài phân lập được 75 chủng vi khuẩn trên cá sặc rằn có dấu hiệu đen thân mắt cá mờ đục, xuất huyết ở các góc vây ở 23 hộ nuôi khác nhau.. Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn gâ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

PHAN THỊ LỆ HOA

NGHIÊN CỨU BỆNH ĐEN THÂN TRÊN CÁ SẶC RẰN

(Trichogaster pectoralis) NUÔI THÂM CANH

Ở TỈNH ĐỒNG THÁP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

PHAN THỊ LỆ HOA

NGHIÊN CỨU BỆNH ĐEN THÂN TRÊN CÁ SẶC RẰN

(Trichogaster pectoralis) NUÔI THÂM CANH

Ở TỈNH ĐỒNG THÁP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

Cán bộ hướng dẫn PGs Ts Từ Thanh Dung

2014

NGHIÊN CỨU BỆNH ĐEN THÂN TRÊN CÁ SẶC RẰN

(Trichogaster pectoralis) NUÔI THÂM CANH Ở TỈNH ĐỒNG THÁP

Phan Thị Lệ Hoa và Từ Thanh Dung

Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

Email: hoa112961@student ctu edu vn

ABSTRACT

Aim of this research is to determine the causitive agent that caused ”dark body”

disease on Snakeskin gourami (Trichogaster pectoralis) cultured in Dong Thap

province There are 75 strains of bacteria were isolated on diseased fish with some clinical signs such as: dark coloration, eyes with corneal opacity and hemorrhage from 23 different farms Based on morphological, physiological, biochemical characteristics and API 20 test, the result showed that the bacteria

belongs to Streptococcus agalactiae Parasites also were found on skins and

gills of diseased fish with low densities and did not affect to fish health After

antibiotics sensitivity testing process, S agalactiae is only resised Gentamycin

in total 10 types of probiotics that used in this study LD50 trials was carried out

with two strains Streptococcus sp2 and Streptococcus sp3, at concentration

from 104 to 107 CFU/mL in healthy Snakeskin gourami (8 ± 1g body weight), with values of SRĐT41 and SRĐT43 are 2,15x105 CFU/mL and 3,59x103 CFU/mL respectively after 7 days Isolation and identification process indicated

that the bacteria that caused ”dark body” on Snakeskin gourami belongs to S

agalactiae group

Keyword: snakeskin gourami (Trichogaster pectoralis), Streptococcus

agalactiae, LD50, “dark body”

Title: Sudy ”dark body” disease on Snakeskin gourami (Trichogaster

pectoralis) cultured in Dong Thap province

TÓM TẮT

Đề tài nhằm xác định tác nhân gây bệnh “đen thân” đã gây thiệt hại rất lớn cho

nghề nuôi cá sặc rằn (Trichogaster pectoralis) thâm canh ở tỉnh Đồng Tháp.

Đề tài phân lập được 75 chủng vi khuẩn trên cá sặc rằn có dấu hiệu đen thân mắt cá mờ đục, xuất huyết ở các góc vây ở 23 hộ nuôi khác nhau Kết quả kiểm tra đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, kít API 20Strep xác định vi

khuẩn thuộc giống Streptococcus agalactiae Trên da và mang cá cũng tìm thấy sự hiện diện Trichodina ký sinh với cường độ nhiễm 2 trùng/lame và tỉ lệ

nhiễm 6% rất thấp, không ảnh hưởng đến sức khỏe của cá Qua kiểm tra tính

nhạy, kháng kháng sinh cho kết quả S agalactiae chỉ kháng với kháng sinh

gentamycin trong tổng số 10 loại kháng sinh được sử dụng trong đề tài

Streptococcus sp2 và Streptococcus sp3 được sử dụng để gây cảm nhiễm trên

cá sặc rằn giống khỏe (khối lượng 8 ± 1g) bằng cách tiêm 4 nồng độ 104

, 105,

106 và 107 CFU/mL Giá trị LD50 sau 7 ngày cảm nhiễm trên chủng SRĐT41 là 2,15x105 CFU/mL và SRĐT43 là 3,59x103 CFU/mL Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh đen thân trên cá sặc rằn thuộc nhóm Streptococcus

agalactiae

Từ khóa: cá sặc rằn (Trichogaster pectoralis), Streptococcus agalactiae,

LD 50, bệnh ”đen thân”

1 GIỚI THIỆU

Cá sặc rằn (Trichogaster pectoralis, Regan 1910) là một đối tượng thủy sản

nước ngọt truyền thống mang lại hiệu quả kinh tế cao của vùng Đồng bằng sông Cửu Long Đây là loài cá có khả năng khôi phục quần đàn nhanh, sức sinh sản cao Cá sặc rằn tăng trưởng chậm hơn so với các loài cá khác, nhưng với đặc điểm là loài cá dễ nuôi, cá có thể sống trong môi trường nước bẩn, do

có đặc tính ăn mùn bã hữu cơ, phiêu sinh cỡ nhỏ nên cá có thể nuôi được ở các loại hình như thâm canh, bán thâm canh và quảng canh Do chịu được hàm lượng oxy thấp nên có thể nuôi cá ở mật độ cao, thịt cá thơm ngon Hiện nay, khô cá sặc rằn được xem là đặc sản có tiềm năng phát triển mang lại lợi nhuận cao cho người nuôi

Tuy nhiên, do mức độ thâm canh hóa ngày càng cao dẫn tới tình hình dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều và khó kiểm soát, gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi cá đồng nói chung và nghề nuôi cá sặc rằn nói riêng, ảnh hưởng lớn đến hiệu quả kinh tế Trong khi đó, việc nghiên cứu các mầm bệnh truyền

nhiễm đã được thực hiện trên nhiều đối tượng như: cá rô đồng (Anabas

testudineus) (Nguyễn Văn Mận, 2011), cá lóc (Channa striata) (Võ Yến Nhi,

2011), cá tra (Pangasius hypophthalmus) (Phan Thị Kim Vàng, 2012),

nhưng chưa có nghiên cứu nào được thực hiện trên cá sặc rằn Hầu hết các bệnh xảy ra trên cá đồng nói chung cũng như cá sặc rằn nói riêng chủ yếu là các bệnh do vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virus Trong đó, bệnh “đen thân” trên cá sặc rằn với tỉ lệ chết cao đã gây thiệt hại rất lớn cho người nuôi Xuất

phát từ thực tế nêu trên đề tài “Nghiên cứu bệnh đen thân trên cá sặc rằn

(Trichogaster pectoralis) nuôi thâm canh ở tỉnh Đồng Tháp” thực hiện

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1 Phương pháp thu mẫu cá

Mẫu cá sặc rằn được thu từ 23 ao nuôi thâm canh có dấu hiệu đen thân

ở huyện Tháp Mười, tỉnh Đồng Tháp, mỗi ao thu 5 – 10 con cá bệnh và 2 con

cá khỏe Mẫu được thu trong khoảng thời gian từ tháng 8 đến tháng 10 năm

2014 Mẫu được phân lập tại hộ nuôi và được phân tích tại phòng thí nghiệm

Bộ môn Bệnh học Thủy sản - Khoa thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ

2 2 Phương pháp giải phẫu và kiểm tra ký sinh trùng (KST)

Nghiên cứu được thực hiện theo Edward (2010), cá được kiểm tra ký sinh trùng ở da, vây, mang và quan sát dưới kính hiển vi (10-40X) Mức độ nhiễm

ký sinh trùng được xác định bằng hai đại lượng tỉ lệ nhiễm (TLN) và cường độ nhiễm (CĐN)

TLN (%) = (Số mẫu nhiễm KST / Tổng số mẫu kiểm tra) x 100

CĐN = Số ký sinh trùng/ lame

2 3 Phân lập và định danh vi khuẩn

Mẫu cá bệnh được phân lập vi sinh ở gan, thận, tỳ tạng, não và máu trên môi trường tuyệt trùng Trypticase soy agar (TSA), được ủ ở 28oC, sau 24 – 36 giờ quan sát và ghi nhận kết quả, những khuẩn lạc rời và chiếm đa số được tách ròng Sau khi khuẩn lạc thuần, tiến hành định danh thông qua xác định các đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn

Định danh vi khuẩn dựa vào các chỉ tiêu về hình thái, sinh lý, sinh hóa theo cẩm nang của Cowan and Steels (Barrow and Feltham, 1993) và Buller (2004) đồng thời sử dụng bộ kít API 20Strep (BioMerieux, Pháp) với các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

2 4 Phương pháp lập kháng sinh đồ

Phương pháp làm kháng sinh đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2012, trên môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA, Meck, Darmstadt, Germany) với 10 loại kháng sinh sau: amoxicillin (AMC/10µg), florfenicol (FFC/30µg), doxycycline (DO/30µg), gentamycin (CN/10µg), erythromycin (E/30µg), clarithromycin (CLR/15µg), rifampicin (RD/30µg), novobiocin (NV/5µg), cephalexin (CL/30µg) và trimethoprim/sulfamethoxazol (SXT/25µg), (Oxoid, UK) Đường kính vòng vô khuẩn (mm) được xác định theo tiêu chuẩn của CLSI (2012) để xác định tính kháng nhạy của vi khuẩn đối với các loại kháng sinh

2 5 Thí nghiệm cảm nhiễm xác định LD 50 (Lethal Dose) vi khuẩn gây bệnh

Nguồn cá thí nghiệm

Cá sặc rằn có khối lượng 8 ± 1 g/con được mua tại trại giống Anh Dũng (Đầu Sấu, TP Cần Thơ) Cá được dưỡng trong bể composite có thể tích khoảng 500

L để quen với điều kiện thí nghiệm trong 5 ngày Cho cá ăn bằng thức ăn viên theo nhu cầu của cá

Nguồn vi khuẩn gây cảm nhiễm

Hai chủng SRĐT41 và SRĐT43 phân lập từ cá sặc rằn bệnh “đen thân” tại 2

ao khác nhau Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong môi trường BHI-B (Brain-Heart infusion broth) trên máy lắc ở 28oC trong 24 – 48 giờ, tiến hành ly tâm ở

4oC 13 000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó rửa lại với dung dịch nước muối sinh lý (0,85% NaCl), ly tâm lặp lại 2 lần Mật độ vi khuẩn được xác định bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 620 nm với OD=1 ± 0,02 tương đương mật độ vi khuẩn 108

CFU/mL Dung dịch vi khuẩn được pha loãng 10 lần theo nguyên tắc 1 mL dung dịch vi khuẩn + 9 mL nước muối sinh lý Ứng với 4 nồng độ cuối cùng (104

CFU/mL, 105 CFU/mL, 106 CFU/mL và 107 CFU/mL) dùng pipet hút 100 µL cho lên đĩa TSA và dùng tăm bông trải đều

vi khuẩn trên đĩa TSA, đếm khuẩn lạc sau 24- 48 giờ ở 280

C Mật độ vi khuẩn gây cảm nhiễm trong nghiên cứu này đượctrình bày ở Bảng 1

CFU/mL = Mật độ vi khuẩn trung bình x Độ pha loãng x 10

Bảng 1: Mật độ vi khuẩn sử dụng cho thí nghiệm cảm nhiễm

Bố trí thí nghiệm

Cá thí nghiệm được tiêm vào xoang bụng liều 0,1 mL/con với mật độ vi khuẩn ở Bảng 1 Riêng nghiệm thức đối chứng được tiêm nước muối sinh lý tiệt trùng (0,85% NaCl) cũng với liều này Tất cả các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 lần lặp lại Số lượng, thời điểm cá chết và các dấu hiệu lâm sàng được ghi nhận trong quá trình thí nghiệm Cá lờ đờ hay vừa mới chết được phân lập vi khuẩn ở gan, thận, tỳ tạng, não và máu trên môi trường TSA Giá trị LD50 được xác định theo phương pháp của Reed và Muench (1938) Số liệu cảm nhiễm được phân tích bằng chương trình Excel 2007

LD50 = LogLD50= LogA +

d t

d

%

%

%

% 50





x Log10

LogA: nồng độ nhỏ và cận 50%

Log10: độ pha loãng

%d: số cá chết nhỏ và cận 50%

%t: số cá chết lớn và cận 50%

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3 1 Thông tin mẫu thu

Đề tài phân lập được 75 chủng vi khuẩn từ 123 mẫu cá, được trình bày chi tiết trong Bảng 2

Bảng 2: Số chủng vi khuẩn phân lập đƣợc ở ba đợt thu

3.2 Dấu hiệu bệnh lý

Bệnh đen thân trên cá sặc rằn có thể xuất hiện ở tất cả các giai đoạn của cá Cá bệnh thường có dấu hiệu: cá bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước, trên thân có màu đen bất thường (Hình 1B), mắt cá mờ đục, xuất huyết ở các góc vây (Hình 1A), đặc biệt xuất huyết nặng ở góc vây ngực Cá bệnh nặng thường có biểu hiện bơi xoay vòng trên mặt nước, tuột nhớt một mảng lớn trên thân Bên cạnh quan sát dấu hiệu bệnh lý, quan sát ký sinh trùng cho thấy có sự hiện diện của nhóm

Trichodina ký sinh trên cá với TLN là 6% và CĐN 2 trùng/lame rất thấp không

gây ảnh hưởng đến cá

Các dấu hiệu nêu trên giống với kết quả đã được ghi nhận trên cá rô phi

(Sheehan, 2009) nhiễm S agalactiae Một số dấu hiệu bệnh tương tự cũng được ghi nhận trên cá điêu hồng (Oreochromis sp.) nhiễm vi khuẩn S agalactiae (Quan Ngô Huy Tân, 2010), trên cá lóc (Channa striata) nhiễm vi khuẩn

Streptococcus (Nguyễn Thị Yến Nhi, 2014), cá điêu hồng (Oreochromis sp.)

bệnh xuất huyết do S agalactiae (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nghuễn Thanh

Phương, 2012)

B

A

A

A

Hình 1: Cá sặc rằn bệnh đen thân (A) Vây bị xuất huy t; (B) Cơ thể cá có màu đen bất

thường

3 3 Phân lập và định danh vi khuẩn

Đề tài phân lập được 75 chủng vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng, não và máu cá sặc rằn bệnh đen thân đa số cho khuẩn lạc có kích thước khoảng 1 mm, màu trắng đục, không dung huyết với môi trường thạch máu Vi khuẩn phân lập là các tế bào vi khuẩn Gram (+), dạng chùm trên môi trường thạch và dạng chuỗi hoặc đơn cầu trên môi trường lỏng Qua kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa (Bảng 3) vi khuẩn cho âm tính với Oxidase, Catalase và O/F, không phát triển

ở nồng độ NaCl = 6,5% Kết quả hoàn toàn phù hợp với các mô tả của Buller

(2004) trên S agalactiae Mặt khác, kết quả định danh bằng bộ kít API

20Strep cho thấy đặc điểm sinh hóa, sinh lý của chủng vi khuẩn định danh

giống với S agalactiae của Buller (2004) trừ chỉ tiêu Glycogen là âm tính so

với kết quả của Buller (2004) là dương tính Bảng 3

Bảng 3: Đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Streptococcus agalactiae phân lập

agalactiae

(Buller, 2004)

S agalactiae (SRĐT41)

(Phân lập)

Amidon (AMD) - -

Hình 2: A: Khuẩn lạc Streptococcus sp2 trên môi trường thạch TSA; B: Vi khuẩn

Streptococcus sp2 Gram dương hình cầu dạng chuỗi

Kết quả trên giống với kết quả nghiên cứu vi khuẩn S agalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá rô đồng của Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2012)

Streptococcus spp thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+), dạng chuỗi là một trong

những tác nhân gây nên dấu hiệu đen thân trên nhiều loài cá nước ngọt, lợ và

mặn (Inglis et al., 1993; Yanong and Francis-Floyd, 2002) Nhóm vi khuẩn

này đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi cá rô phi (Oreochromis sp.) ở

nhiều quốc gia trên thế giới với tỉ lệ tử vong cao trên 50% trong vòng 3-7 ngày

(Yanong and Francis-Floyd, 2002) Bên cạnh đó, Từ Thanh Dung và ctv (2013) đã xác định S iniae là tác nhân gây bệnh “đen thân” trên cá rô đồng (Anabas tesudineus) cá bệnh có biểu hiện cơ thể có màu đen bất thường, bơi lờ

đờ trên mặt ao Với kết quả này có thể xác định vi khuẩn phân lập được từ cá

sặc rằn bệnh đen thân ở Đồng Tháp thuộc S agalactiae

Hình 3: K t quả định danh bằng kít API 20Strep sau 24 giờ

3 5 K t quả thí nghiệm cảm nhiễm LD 50

Hai chủng vi khuẩn S agalactiae (SRĐT41 và SRĐT43) sử dụng gây cảm

nhiễm được thu từ mẫu cá sặc rằn bị bệnh đen thân ở hai địa điểm khác nhau,

có biểu hiện bệnh lý cũng khác nhau Kết quả cảm nhiễm trên cá sặc rằn cho dấu hiệu lâm sàng giống với cá sặc rằn bệnh “đen thân” ngoài ao nuôi Cá chết đầu tiên ở mật độ từ 105 – 107 CFU/mL sau 2 ngày cảm nhiễm Cá chết ở tất

B

A

A

A

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Thời gian cá chết (Ngày)

10^4 10^5 10^6 10^7

SRĐT41

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Thời gian cá chết (Ngày)

ĐC 10^4 10^5 10^6 10^7

cả các nghiệm thức ngoại trừ nghiệm thức đối chứng tiêm nước muối sinh lý (0,85% NaCl) Sau 7 ngày gây cảm nhiễm, cá ở các nghiệm thức chết với tỉ lệ

từ 5-75% Sau 14 ngày cảm nhiễm, tỉ lệ cá chết trên 2 chủng vi khuẩn cảm nhiễm ở mật độ 106 CFU/mL lần lược là 65% và 75% Tái phân lập vi khuẩn

từ cá thí nghiệm cảm nhiễm cho kết quả giống với kết quả vi khuẩn gây bệnh

“đen thân” ngoài tự nhiên Giá trị LD50 trên 2 chủng vi khuẩn cảm nhiễm được xác định SRĐT41 là 2,15x105 CFU/mL và SRĐT43 là 3,59x103 CFU/mL sau 7 ngày

Hình 4: Đồ thị tỉ lệ ch t trong thí nghiệm xác định LD 50 trên chủng S agalactiae

Trong một nghiên cứu của Quan Ngô Huy Tân (2010) khi gây cảm nhiễm vi

khuẩn S agalactiae trên cá điêu hồng bằng phương pháp tiêm, cho kết quả

LD50 = 4,89 x 104 CFU/mL, tỉ lệ chết cao nhất 106 (100%), thấp nhất 101

(20%) sau 14 ngày Nguyễn Khương Duy (2011), cảm nhiễm Streptococcus

cũng bằng phương pháp tiêm, xác định LD50 trên cá rô đồng bị bệnh đen thân sau 7 ngày (R17) là 8,71 x 104 CFU/mL và (R47) là 7,8 x 104 CFU/mL Từ kết quả cảm nhiễm của các nghiên cứu trước và kết quả cảm nhiễm trong nghiên

cứu này cho thấy S agalactiae có độc lực trên cá sặc rằn thấp hơn so với các loài cá đồng cùng nhiễm Streptococcus

3 4 K t quả kháng sinh đồ

Nghiên cứu đã tiến hành xác định độ kháng, nhạy của ba chủng vi khuẩn phân lập được từ cá sặc rằn bệnh đen thân với 10 loại kháng sinh (Bảng 4) Cho kết

quả S agalactiae nhạy với amoxicillin, rifampicin, clarithromycin,

erythromycin, doxycycline, cephalexin, trimethoprim/sulfamethoxazol (nhạy thấp với SRĐT23) và novobiocin (nhạy thấp với SRĐT41) tạo đường kính vòng vô trùng lớn và vi khuẩn kháng hoàn toàn với gentamycin

Bảng 4: K t quả độ kháng, nhạy kháng sinh trên 3 chủng vi khuẩn S agalactiae

Ghi chú: S: Nhạy; R: Kháng; I: Trung bình nhạy

Amoxicillin và cephalexin thuộc nhóm beta – lactam có khả năng làm bất hoạt enzyme transpeptidase chất xúc tác của giai đoạn cuối trong quá trình tổng

hợp peptidoglycan của vi khuẩn Một nghiên cứu của Park et al, (2009) trích bởi Phạm Văn Thanh Thoáng (2011) S iniae gây bệnh trên cá bơn Nhật Bản

cho kết quả nhạy với nhóm beta – lactam Clarithromycin cùng nhóm với erythromycin nhạy với cả 3 chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này, cùng với trimethoprim/sulfamethoxazol chỉ có hiệu lực thấp với chủng SRĐT23, kết

quả này phù hợp với nghiên cứu của Suanyuk et al, (2005) khi kiểm tra độ kháng, nhạy kháng sinh trên chủng S agalactiae phân lập từ cá rô phi (Oreochromis sp.) tại tỉnh Surat Thani, Thái Lan Các chủng S iniae nhạy hầu