đặc điểm mô cơ và gan tụy tôm thẻ chân trắng (penaeus vannamei) dưới tác động của vibrio alginolyticus và dầu spo

Trong nghiên cứu này, những biến đổi ở mức độ vi thể của 2 cơ quan cơ và gan tụy tôm thẻ chân trắng nhiễm khuẩn Vibrio alginolyticus được ghi nhận như sau:... Biến đổi mô cơ ở thí nghiệ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

TRƯƠNG THỊ KIM ANH

ĐẶC ĐIỂM MÔ CƠ VÀ GAN TỤY TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA Vibrio alginolyticus VÀ DẦU SPO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

TRƯƠNG THỊ KIM ANH

ĐẶC ĐIỂM MÔ CƠ VÀ GAN TỤY TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA Vibrio alginolyticus VÀ DẦU SPO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS TRẦN THỊ TUYẾT HOA ThS ĐẶNG THỤY MAI THY

2014

ĐẶC ĐIỂM MÔ CƠ VÀ GAN TỤY TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA Vibrio alginolyticus VÀ DẦU SPO

Trương Thị Kim Anh1, Đặng Thụy Mai Thy, Trần Thị Tuyết Hoa*

1Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

E-mail: anh103244@student.ctu.edu.vn

ABSTRACT

Vibrio alginoloticus strain was used for challenge experiment in shrimp which were collected from indoor and outdoor experiments at the injection doses of 10 7 CFU/ml Experimental shrimp were fed the food supplemented SPO oil with the rate of 0%, 0,1%, 0,2%, 0,4% for 30 days A study was carried out to determine the

histopathology of white leg shrimp (Penaeus vannamei) influenced by SPO oil and

Vibrio alginolyticus Histological studies in the hepatopancreas and muscle of infected shrimp showed: bacterial invasion; cell necrosis in muscle and hepatopancreas Besides, infiltration of haemotycytes around hepatopancreatic tubules; retraction of hepatopancreatic tubules; reduction of R and F cells; sloughing cells into the hepatopancreatic tubule lumens were also recorded

Keywords: Vibrio alginolyticus, histopathology, Penaeus vannamei

Title: Histopathology of white leg shrimp (Penaeus vannamei) influenced with SPO oil and Vibrio alginolyticus

TÓM TẮT

Chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus được sử dụng để gây cảm nhiễm cho tôm thu từ

2 thí nghiệm nuôi ở điều kiện trong nhà và ngoài trời với mật độ 10 7 CFU/ml Tôm thí nghiệm được cho ăn thức ăn bổ sung dầu SPO tỉ lệ 0%, 0,1%, 0,2%, 0,4% trong vòng 30 ngày Nghiên cứu được tiến hành để xác định đặc điểm mô học của tôm thẻ chân trắng dưới tác động của dầu SPO và Vibrio alginolyticus Nghiên cứu mô học

cơ quan gan tụy và cơ của tôm cảm nhiễm cho thấy: sự xâm nhập của vi khuẩn; hoại

tử tế bào cơ và gan tụy Bên cạnh đó, hiện tượng tế bào máu tập trung xung quanh ống gan tụy, teo tế bào gan tụy, giảm tế bào R và F, đồng thời tế bào gan tụy bị bong tróc rơi vào lòng ống cũng được ghi nhận

Từ khóa: Vibrio alginolyticus, mô bệnh học, tôm thẻ chân trắng

1 Giới thiệu

Ngành thủy sản Việt Nam trong hơn 10 năm qua đã có bước phát triển vượt bậc, trở thành một trong những nước có tốc độ phát triển thủy sản nhanh nhất thế giới Hiện nay nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường, nhà nước ta đã chú trọng đầu tư để đẩy mạnh quy mô nuôi trồng thủy sản với các đối tượng nuôi có giá trị, góp phần giải quyết việc làm, nâng cao thu nhập cho người nông dân Cùng với cá tra

(Pangasius hypophthalmus) và tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ chân trắng

(Penaeus vannamei ) hiện nay được xem là đối tượng xuất khẩu được chú trọng của

ngành nuôi trồng thủy sản nước ta Trong năm 2012, xuất khẩu ngành hàng này đạt 6,09 tỉ USD chiếm tỷ trọng 5,3% trong tổng kim ngạch xuất khẩu tất cả các mặt hàng của cả nước Tôm thẻ chân trắng có nguồn gốc từ Nam Mỹ, hiện đang được nuôi rộng rải ở nhiều nước trên thế giới Ở Việt Nam, tôm thẻ chân trắng được đưa vào nuôi thử nghiệm vào năm 2001 Năm 2002, diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng của cả nước là 1.710 ha đến năm 2013 tăng lên tới 66.000 ha

Cùng với sự gia tăng về diện tích và sản lượng, ngành nuôi tôm thẻ chân trắng ở nước ta đang phải đối mặt với nhiều thách thức như kỹ thuật nuôi còn hạn chế, dịch bệnh, môi trường nuôi ô nhiễm, Đặc biệt là vấn đề dịch bệnh gây thiệt hại to lớn cho người nuôi tôm Đứng trước tình hình đó, song song với việc phòng và trị bệnh

do vi khuẩn, virus gây ra trên tôm nuôi nhiều nhà sản xuất đã nghiên cứu ra một số chất kích thích miễn dịch nhằm cải thiện tỉ lệ sống của tôm khi bị nhiễm khuẩn Dầu SPO là một loại dầu tăng cường hệ thống miễn dịch đang được nghiên cứu và thử nghiệm Một trong những bước của quá trình thử nghiệm, nghiên cứu về “ Đặc điểm

mô cơ và gan tụy tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) dưới tác động của của Vibrio alginolyticus và dầu SPO ” cần được thực hiện

2 Vật liệu và phương pháp

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Tôm thẻ chân trắng có kích cỡ khoảng 3-5g/con được thu từ 2 thí nghiệm nuôi ở điều kiện trong nhà và ngoài trời sau khi cho ăn dầu SPO với tỉ lệ lần lượt là 0%, 0,1%, 0,2%, 0,4% dầu trong 30 ngày

Chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus từ bộ sưu tập của Khoa Thủy sản trường Đại

học Cần Thơ

Dầu SPO là loại dầu đang được nghiên cứu về khả năng tăng hệ thống miễn dịch của công ty Pharmaq

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm cảm nhiễm chủng Vibrio alginolyticus

Sau 30 ngày cho ăn dầu SPO, tôm được cảm nhiễm với vi khuẩn Vibrio alginolyticus bằng phương pháp tiêm vào cơ với mật độ vi khuẩn Vibrio alginolyticus 107 CFU/ml Nghiên cứu bao gồm 2 thí nghiệm chính được trình bày chi tiết ở Bảng Mỗi thí nghiệm bao gồm 5 nghiệm thức, trong đó nghiệm thức 1 (0% dầu SPO), nghiệm thức

2 (0,1% dầu SPO), nghiệm thức 3 (0,2% dầu SPO), nghiệm thức 4 (0,4% dầu SPO)

và nghiệm thức 5 (nghiệm thức đối chứng không cho ăn dầu SPO và được tiêm nước muối sinh lý) Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 lần lặp lại Mật độ bố trí thí nghiệm là 10 con/bể Tôm thí nghiệm được tiêm ở đốt bụng thứ 4 (30 µl/con), thời gian thí nghiệm trong 7 ngày kể từ ngày tiêm Trong quá trình thí nghiệm cho tôm ăn thức ăn công nghiệp theo nhu cầu với điều kiện chăm sóc và quản lý tôm trong các

bể là như nhau và không thay nước Các dấu hiệu hoạt động của tôm và tỉ lệ chết được ghi nhận trong lại thời gian 7 ngày thí nghiệm

Bảng Thí nghiệm cảm nhiễm chủng Vibrio alginolyticus với tôm cho ăn dầu SPO

trong 30 ngày và nuôi trong nhà và ngoài trời

Tiêm chủng vi khuẩn

Vibrio alginolyticus (30

µl/con)

10 7 CFU/ml

10 7 CFU/ml

10 7 CFU/ml

10 7 CFU/ml

NaCl 0,85%

Hàm lượng dầu SPO trong

Thu và xử lý mẫu

Mẫu tôm được thu là những con vừa mới chết hoặc rất yếu, lờ đờ tại các thời điểm

ngày 0, ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 4, ngày 5 và ngày 7 (ngày kết thúc thí nghiệm) Phương pháp phân tích mô học

Mẫu tôm được cố định trong dung dịch Davidson trong 24 giờ sau đó chuyển sang cồn 700 Qui trình phân tích mô học bao gồm các bước: Mẫu được làm mất nước rồi đúc khối với parafin, tiếp theo là cắt lát mẫu (độ dày 4-8 µm) Mẫu được nhuộm với các thuốc nhuộm Hematoxylin, Eosin Sau khi nhuộm mẫu được gắn lên tiêu bản và đọc kết quả bằng kính hiển vi quang học (Lightner, 1996)

3 Kết quả và thảo luận

Các loài động vật thủy sản nuôi nước lợ và mặn đều có thể bị nhiễm và chịu tác hại

của bệnh vi khuẩn Vibriosis Trong nhóm Vibrio spp gây bệnh ở động vật thủy sản thường gặp một số loài điển hình như: Vibrio alginolyticus, V harveyi, V vulnificus, V parahaemolyticus, V pelagius, V anguilarum Trong nghiên cứu này,

những biến đổi ở mức độ vi thể của 2 cơ quan cơ và gan tụy tôm thẻ chân trắng

nhiễm khuẩn Vibrio alginolyticus được ghi nhận như sau:

3.1 Biến đổi cấu trúc mô học ở cơ

Mô cơ là loại mô được liên kết chặt chẽ, có chức năng là vận động và bảo vệ cơ quan

bên trong (Lightner et al., 1996) Trên tiêu bản mô tôm đối chứng của các nghiệm

thức trong nhà và ngoài trời, mô cơ không có sự biến đổi với sự phân bố đều của các sợi cơ (Hình 1) Như vậy dầu SPO không gây tác động đến cơ tôm thẻ chân trắng ăn

thức ăn bổ sung dầu SPO

Hình 1: Mô cơ tôm đối chứng (H&E, 40X và 20X) mô cơ của tôm đối chứng với

sự phân bố đều của các sợi cơ lần lượt ở 2 điều kiện trong nhà (A) và ngoài trời (B) Biến đổi mô cơ ở thí nghiệm tôm nuôi trong nhà:

Khi quan sát những tiêu bản mô của tôm chết hoặc rất yếu do nhiễm khuẩn thì thấy:

ở NT1 các sợi cơ có hiện tượng bị tách rời và đứt liên kiết giữa các bó cơ thành từng miếng mỏng NT2 liên kết giữa tế bào cơ bị lỏng ra, kèm theo đó là sự tập trung của

tế bào máu, ngoài ra còn bắt gặp các mảnh cơ bị bong tróc và tập trung lại thành đám (Hình 2C và 2D) NT3 và NT4 nghiệm thức tôm được cho ăn thức ăn có bổ sung dầu SPO tỉ lệ 0,2% và 0,4% ghi nhận mô cơ không có sự biến đổi, điều này chứng tỏ ở liều lượng này vi khuẩn đã không gây tác động đến cơ tôm trong quá trình cảm nhiễm

Biến đổi mô cơ ở thí nghiệm tôm nuôi ngoài trời:

Trên NT1 NT2 và NT4 các sợi cơ cũng có hiện tượng bị tách rời và đứt liên kiết giữa các bó cơ Hình (3A và 3C và 3D), ở những tiêu bản bị nhiễm nặng hơn của NT1 còn

thấy hiện tượng cơ bị hoại tử (Hình 3B) Kết quả nghiên cứu của Zhou và ctv (2012) trên tôm thẻ nhiễm Vibrio cơ tôm cũng có dấu hiệu hoại tử NT3 cũng giống như

điều kiện trong nhà mô cơ không xảy ra biến đổi (Hình 3D)

Từ kết quả trên ta nhận thấy nhiều biến đổi mô học ở thí nghiệm trong nhà điều xảy

ra ở thí nghiệm ngoài trời Bên cạnh đó, cũng có khác biệt xảy ra ở NT1 và NT4 ở nghiệm thức trong ngoài nhà bị hoại tử và hóa lỏng bó cơ nhưng không xảy ra ở nghiệm thức trong nhà

Hình 2: Tiêu bản mô cơ tôm nhiễm khuẩn ở nghiệm thức trong nhà (H&E, 40X

và 20X) A và B: liên kết giữa các bó cơ trở nên lỏng lẻo, bó cơ bị đứt các liên kết (mũi tên); C: liên kết bó cơ bị lỏng và sự tập trung của tế bào máu (mũi tên); D: mảnh cơ bị bong tróc và tập trung lại (vòng tròn); E và F: mô cơ nghiệm thức 3 và

nghiệm thức 4 không có biến đổi cấu trúc

E

C

F

D

Hình 3: Mô cơ tôm nhiễm khuẩn ở nghiệm thức ngoài trời (H&E, 40X và 20X)

A và C: đứt liên kết giữa các bó cơ (mũi tên); B: cơ bị hoại tử (mũi tên); D: Bó cơ bị hóa lỏng; E: mô cơ nghiệm thức 3 không có biến đổi cấu trúc

3.2 Biến đổi mô học ở khối gan tụy

Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2008) ghi nhận gan tụy, cơ quan lympho và mang là 3

cơ quan thường thấy xuất hiện những tổn thương do vi khuẩn gây nên trong đó mang

là cơ quan bị tổn thương ít nhất còn gan tụy là cơ quan bị tổn thương nhiều nhất Gan tụy tôm là dạng gồm nhiều ống gan tụy kết hợp lại với nhau (Bell and Lightner,

1988; Caceci et al., 1988; Lightner et at., 1996; Bhavan and Geraldine, 2000) Với 4

loại tế bào chính: tế bào E (tế bào phôi); tế bào B (tế bào dự trữ); tế bào R là tế bào chất đặc trưng chứa nhiều không bào nhỏ và giọt lipid; tế bào F (tế bào xơ) thì ưa

kiềm (Jui-Pin Wu et al., 2008)

C

B

A

E

D

Ảnh hưởng của vi khuẩn nói chung và của Vibrio lên ống gan tụy nói riêng đã được nghiên cứu trên nhiều loài thủy sản khác nhau Robertson et al., 1998 trong nghiên cứu cảm nhiễm Vibrio harveyi ở ấu trùng tôm thẻ chân trắng đã tìm thấy sự hiện diện của Vibrio harveyi trên tất cả khối gan tụy của ấu trùng nhiễm bệnh, điều này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đó của Chen (1989) có đến 84,6% vi khuẩn Vibrio tồn

tại trong khối gan tụy của tôm Kết quả từ những biến đổi mô học cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu này

Biến đổi mô gan tụy ở thí nghiệm tôm nuôi trong nhà:

Nghiệm thức đối chứng có cấu trúc mô bình thường với ống gan tụy cấu trúc hình sao và sự có mặt đầy đủ của các loại tế bào (Hình 4A) NT1 sau khi tiêm vi khuẩn, so sánh kết quả mô bệnh học giữa đối chứng và tôm chết do nhiễm khuẩn ta thấy gan tụy ở những con tôm chết có hiện tượng mất cấu trúc, tế bào F, E và R bị biến mất hoàn toàn, giảm tế bào B kèm theo đó là ống gan tụy bị teo (Hình 4B) Ở NT2 quan sát tiêu bản mô tôm nhiễm khuẩn bắt gặp tế bào bị bong tróc ra và rơi vào lòng ống, một số tế bào máu tập trung xung quanh ống gan tụy, ngoài ra còn có sự xuất hiện dày đặc của tế bào E (Hình 4C và 4D), đây có thể là do sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi có tác động xâm nhập từ bên ngoài, điều này cũng trùng hợp với kết luận của

Nagesh et al., 1999 NT3 ống gan tụy bị mất cấu trúc hình sao hoàn toàn, không còn

thấy sự hiện diện của 3 loại tế bào là F và R và B Bên cạnh đó là ống gan tụy bị teo nhỏ chỉ còn lại sự hiện diện của tế bào B và R trong ống gan (Hình 4E) Trên NT4 tương tự như trên nghệm thức 2 cũng có hiện tượng tế bào máu tập trung xung quanh ống gan tụy và mất tế bào F, R và B Hình 4F)

Biến đổi mô gan tụy ở thí nghiệm tôm nuôi ngoài trời:

NT1 trên tiêu bản mô nhiễm khuẩn cũng có các hiện tượng ống gan tụy bị mất cấu trúc hình sao, các tế bào E, F và R trong ống bị giảm đến mất chỉ còn hiện diện của tế bào B (Hình 5A) Trên NT2 tế bào E có hiện tượng xuất hiện dày đặc, bên cạnh đó là ống gan tụy bị mất cấu trúc, dẫn đến ống gan tụy bị teo (Hình 5B) Quan sát tiêu bản

mô NT3 ta thấy các ống gan tụy bị teo nhỏ, bên cạnh đó là mất sự hiện diện của tế bào E và F, chỉ còn thấy tế bào B và R NT4 trên mẫu tôm nhiễm khuẩn bắt gặp một

số mẫu có những biến đổi đặc trưng do nhóm Vibrio sp gây ra là hiện tượng gan tụy

bị hoại tử, dẫn đến ống gan tụy bị teo nhỏ lại, một số bị nhiễm nặng ống gan tụy hoàn toàn bi phá hủy, không còn rõ các tế bào trong ống gan (Hình 5D và 5E)

Qua những kết quả phân tích mô học trên tôm nhiễm khuẩn ở 2 thí nghiệm trong nhà

và ngoài trời được ghi nhận NT1 và NT2 của 2 thí nghiệm những biến đổi mô học những biến đổi mô học là giống nhau với các dấu hiệu đặc trưng: teo ống gan, tăng tế bào E và giảm tế bào Tuy nhiên có sự khác biệt trên NT3 và NT4, ở NT3 và NT4 của thí nghiệm trong nhà những biến đổi ở mức độ nhẹ như: các tế bào B, R giảm dần đến mất, tế bào máu tập trung xung quanh ống gan NT3 và NT4 của thí nghiệm

ngoài trời có những biến đổi ở mức độ nặng hơn tế bào hoại tử nặng và mất cấu trúc

tế bào hoàn toàn

Trong quá suốt trình cảm nhiễm tôm ăn khỏe và cho ăn theo nhu cầu của tôm, điều này chứng tỏ những biến đổi trên mô cơ và gan tụy của tôm là do vi khuẩn gây ra không phải do thiếu thức ăn mà bị biến đổi

Mặc dù trong nghiên cứu này không có sự khác biệt nhiều về những biến đổi mô học giữa 2 điều kiện thí nghiệm trong nhà và ngoài trời nhưng nhiệt độ có khả năng làm

chậm hoặc tăng cường độc lực của vi khuẩn Vibrio alginolyticus (Cheng và ctv, 2005), vì vậy trong nghiên cứu cảm nhiễm với Vibrio alginolyticus cần phải chú ý sự

thay đổi của điều kiện môi trường

Hình 4: Mô gan tụy đối chứng và nhiễm khuẩn ở nghiệm thức trong nhà (H&E, 40X và 20X) A: mô khỏe với sự hiện diện của các tế bào và cấu trúc hình sao; B: gan tụy tôm có

hiện tương teo ống và mất tế bào F và R; C: hiện tượng tế bào máu tập trung xung quanh thành ống (mũi tên đen) và sự tăng lên của tế bào E (mũi tên xanh); D: tế bào bị bong tróc ra

và rơi vào lòng ống (mũi tên đen) và ống gan tụy bị teo (mũi tên xanh); E: tất cả các ống gan đều bị mất cấu trúc hình sao chỉ còn lại sự hiện diện của tế bào E; F: tế bào máu tập trung

xung quanh thành ống (mũi tên đen) và mất 3 loại tế bào F, R và B

C

E

D

F