Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhạn dạng một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo (Dendrobium) bản địa của Việt Nam

Với một số lượng lớn các loài của chi lan Hoàng Thảo có giá trị như vậy, cho đến nay vẫn chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu đánh giá, tư liệu hoá ở mức độ phân tử về đa dạng di

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

TRẦN DUY DƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN

VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO

(DENDROBIUM) BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

TRẦN DUY DƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN

VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO

(DENDROBIUM)BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành : Di truyền và Chọn giống cây trồng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Trần Duy Dương

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban Giám đốc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, các thầy cô giáo và Khoa sau đại học

đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Phó Giáo sư, Tiến

sĩ Lã Tuấn Nghĩa và Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Thủy, những người thầy tâm huyết đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi

và định hướng cho tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Tiến sĩ Khuất Hữu Trung, Tiến sĩ Trần Hoàng Dũng, Kỹ sư Nguyễn Trường Khoa, các bạn bè đồng nghiệp Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông Nghiệp đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi tiến hành nghiên cứu cũng như chia sẻ những kinh nghiệm

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ABI Applied Biosystems Incorporated

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

atpβ gene ATP synthase beta-subunit gene

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CTAB Cetyltrimethyl ammoium bromide

EDTA Ethylenediamine tetraacetate

ISSRs Inter-simple sequence repeats

EDTA Ethylenediamine tetraacetate

ITS Internal transcribed spacer

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

NCBI National Center for Biotechnology Information ndhF NADH dehydrogenase subunit F

PCR Polymerase Chain Reaction

QTLs Quantitative trait locus

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

rbcL Ribulose-bisphosphate carboxylase

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA Ribonucleic acid

RNAse Ribounuclease

SCARs Sequence - Characterized Amplified Region

sect Section

SSR Simple Sequence Repeates

3.4 Đặc điểm hình thái hoa của 32 mẫu giống hoa lan

Hoàng Thảo trong nghiên cứu……… 70 3.5 Thống kê số băng ADN được nhân lên ở các mẫu giố

ứuvới 20 mồi RAPD 94 3.6 Tổng hợp kết quả phân tích số liệu với 20 mồi RAPD 99 3.7 Độ dài trình tự ITS của 32 mẫu giống hoa hoa lan Hoàng

Thảo

111

3.8 Độ dài trình tự của vùng ITS mẫu giống D1 và hai mẫu

giống D fimbriatum của thế giới 113 3.9 Độ dài trình tự vùng ITS của mẫu giống D2 và D18 và

hai mẫu giống D findlayanum của thế giới 115 3.10 Độ dài trình tự vùng ITS của mẫu giống D4 và hai mẫu

giống D anosmumcủa thế giới 116 3.11 Độ dài trình tự vùng ITS của mẫu giống D10 và hai mẫu

giống D hancockiicủa thế giới 117

3.12 Độ dài trình tự vùng ITS của mẫu giống D7, D8 và hai

mẫu giống D chysanthumcủa thế giới 119 3.13 Độ dài trình tự vùng ITS của mẫu giống D9, D29 và hai

mẫu giống D primulinum của thế giới 120 3.14 Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo được nhận dạng

dựa trình tự vùng ITS……… 133

giống hoa lan Hoàng Thảo dựa trên chỉ thị hình thái 87 3.7 Ảnh điện di ADN tổng số của 32 mẫu giống hoa lan

Hoàng Thảo với mồi OPN16 97 3.11 Ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 32 mẫu giống hoa lan

Hoàng Thảo với mồi OPN11 97 3.12 Ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 32 mẫu giống hoa

lan Hoàng Thảo với mồi OPN9……… 98 3.13 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền

dựa trên chỉ thị phân tử RAPD

102

3.14 Các mẫu giống lan Hoàng Thảo D4 (Phi Điệp tím), D5

(Trầm tím), D6 (Trầm trắng) 104 3.15 Hoa của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Kiều tím

(D12), Kiều vàng (D13)và Kiều trắng (D14) 105 3.16 Hai mẫu giống hoa hoa lan Hoàng Thảo D24 (HT Vảy rồng lá

nhỏ), D25 (HT Vảy rồng lá trung) 106 3.17 Ảnh điện di đoạn ITS của quả 32 mẫu giống hoa hoa lan

Hoàng Thảo được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi ITS1 và

ITS4

110

3.18 Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự

vùng ITS của mẫu giống D1 và hai mẫu giống D

fimbriatum |JN388588.1| và |HQ114229.1|

114

3.19 Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự

vùng ITS của mẫu giống D2, D18 và hai mẫu giống D

findlayanum |KF143462.1|,|HQ114257.1|

115

3.20 Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự

vùng ITS của mẫu giống D4 với hai mẫu giống D

anosmum |EU477499.1

117

3.21 Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự

vùng ITS của mẫu giống D10 với hai mẫu giống D hancockii

|AB593575.1| và |HQ114259.1| 118 3.22 Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự

vùng ITS của mẫu giống D7, D8 với hai mẫu giống

D.chysanthum |JN388584.1|, |FJ384738.1| 120 3.23 Kết quả phân tích sắp cột thẳng hàng (alignments) trình tự

vùng ITS của mẫu giống D9, D29 với hai mẫu giống D

primulinum |AB593521.1|,|AB593641.1|

121

3.24 So sánh trình tự của mẫu giống D25 (HT Vảy rồng lá trung)

trên ngân hàng gen Blast

123

3.25 Sơ đồ cây phát sinh loài dựa trên trình tự vùng ITS 125

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iii

Danh mục bảng biểu v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Sơ lược về chi lan Hoàng Thảo 5

1.1.1 Hệ thống phân loại 5

1.1.2 Đặc điểm hình thái 6

1.1.3 Phân bố vùng sinh thái 9

1.2 Giá trị sử dụng của hoa lan Hoàng Thảo 11

1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng ở thực vật 12

1.3.1 Khái niệm về đa dạng di truyền 12

1.3.2 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền 13

1.3.3 Các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng ở thực vật 13

1.4 Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam 23

1.4.1 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng hoa lan trên thế giới 23

1.4.2 Tình hình nghiên cứu hoa lan ở Việt Nam 34

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Vật liệu nghiên cứu 39

2.2 Nội dung nghiên cứu 39

2.2.1 Nội dung 1: Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen hoa lan

Hoàng Thảo bản địa Việt Nam 39

2.2.2 Nội dung 2: Giải trình tự vùng ITS của gen ribosom nhân để nhận dạng chính xác một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa trong tập đoàn nghiên cứu 39

2.3 Phương pháp nghiên cứu 39

2 3.1 Phương đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái 39

2.3.2 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền mở mức phân tử bằng chỉ thị RAPD 40

2.3.3 Giải trình tự vùng ITS của gen ribosom nhân 44

2.4 Phần mềm xử lý số liệu 47

2 5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 48

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 49

49

3.1.1 Kết quả đánh giá đa dạng si truyền bằng chỉ thị hình thái 52

3.1.2 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền ở mức phân tử 91

3.1.3 Kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di truyền các giống hoa lan Hoàng Thảo 107

3.2 Kết quả nhận dạng các mẫu giống hoa lan Hoàng thảo dựa vào trình tự vùng ITS 109

3.2.1 Kết quả khuếch đại vùng ITS bằng PCR 109

3.2.2 Kết quả phân tích trình tự các mẫu giống hoa lan Hoàng thảo dựa trên trình tự ITS 110

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 136

TÀI LIỆU THAM KHẢO 138

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Họ lan, hay họ phong lan, (Orchidaceae) là họ thực vật có hoa, thuộc

bộ lan (Orchidaceae), lớp thực vật một lá mầm (Monocotydonea) Đây là một

trong những họ lớn nhất của thực vật bao gồm 800 chi khác nhau, chúng được phân bố ở trên toàn thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực (Trần Hợp, 1989; Huang và Chen, 2010)

Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) có số lượng lớn, đa dạng về hình

dáng, màu sắc và kích thước với hơn 1148 loài khác nhau, đứng thứ 2 trong

họ hoa lan, sau chi lan Lọng (Bulbophyllum) (Leitch và cs., 2009) Vùng

Đông Nam Á có thể coi là quê hương của chi lan Hoàng Thảo với hàng trăm loài, riêng ở Việt Nam đã có hơn 100 loài (Trần Hợp, 1998; Nguyễn Xuân Linh, 2002; Averyanov, 2004; Dương Đức Huyến, 2007), chúng được phân

bố rộng rãi trên khắp các vùng miền trong cả nước

Với một số lượng lớn các loài của chi lan Hoàng Thảo có giá trị như vậy, cho đến nay vẫn chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu đánh giá,

tư liệu hoá ở mức độ phân tử về đa dạng di truyền tập đoàn hoa lan Hoàng Thảo Việt Nam một cách sâu rộng, bài bản và có hệ thống Do đó, việc đặt tên cho từng giống vẫn rất lộn xộn từ những tên giống được dịch sang từ tiếng Anh và tiếng Latin, có rất nhiều tên giống trùng nhau Bên cạnh đó, việc di chuyển các giống lan Hoàng Thảo giữa các vùng, các nước khác nhau đã gây

ra sự nhầm lẫn và hiểu sai về xuất xứ, nguồn gốc bản địa và mối quan hệ di truyền giữa các giống với nhau Điều đó gây ra không ít khó khăn trong việc bảo tồn, khai thác có hiệu quả kể cả thương mại các giống hoa trên thị trường trong nước và quốc tế

Trong công tác bảo tồn và sử dụng bền vững tài nguyên di truyền thực vật, việc đánh giá quỹ gen là công đoạn vô cùng quan trọng không chỉ phục

vụ cho việc xác định các giống/loài khác nhau mà còn nhằm tìm hiểu mối quan hệ về di truyền giữa các giống/loài để bảo tồn đa dạng nguồn gen Sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp và kỹ thuật trong lĩnh vực sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu và nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu bảo tồn đa dạng sinh học Ưu thế của các kỹ thuật phân tử là có khả năng xác định được sự đa dạng ở mức độ gen, tạo cơ sở để đánh giá về giá trị bảo tồn của loài và quần thể Những thông tin từ việc đánh giá sẽ được

sử dụng hiệu quả trong các chương trình chọn tạo giống và làm cơ sở để thực hiện quyền sở hữu trí tuệ và các hợp đồng thương mại về sản phẩm đặc sản Chính vì vậy, việc tạo lập cơ sở dữ liệu ADN (DNA fingerprinting) của các giống/loài, đăng kí ở ngân hàng gen thế giới, khẳng định chủ quyền quốc gia

về tài nguyên di truyền thực vật của nước ta cũng như việc xác định bản quyền đối với giống cây trồng và thực hiện quyền sở hữu trí tuệ về tên các giống cây trồng quý, đặc hữu của Việt Nam nói chung và lan Hoàng Thảo nói riêng đang là vấn đề rất quan trọng, cấp bách, mang tính khoa học và thực tiễn cao, không chỉ phục vụ cho lợi ích trước mắt mà còn định hướng mục tiêu lâu dài trong công tác bảo tồn khai thác hiệu qủa nguồn gen phục vụ thương mại

chúng tôi nh đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng một số nguồn gen lan Hoàng Thảo (Dendrobium) bản địa của Việt Nam”

2 Mục tiêu của luận án

- Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ di truyền của các giống/loài hoa lan Hoàng Thảo bản địa phục vụ cho công tác phân loại, chọn và lai tạo giống mới

- Sử dụng chỉ thị ITS để để nhận dạng một số nguồn gen lan Hoàng Thảo bản địa quý của Việt Nam phục vụ cho công tác bảo tồn, làm cơ sở dữ liệu cho xây dựng ADN mã vạch

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

4.1 Đối tƣợng nghiên cứu

- Là các mẫu giống giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa được phân bố ở các vùng miền Việt Nam

4.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Thí nghiệm được triển khai tại: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp- Phạm Văn Đồng -Từ Liêm, Hà Nội

- Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2010 đến năm 2014

5 Những đóng góp của luận án

Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách bài bản có hệ thống

về đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái kết hợp với chỉ thị phân

tử, nhận dạng các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa quý hiếm của Việt Nam dựa vào trình tự vùng ITS Kết quả của luận án có ý nghĩa trong việc phân loại, phục vụ cho việc bảo tồn, ,

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về chi lan Hoàng Thảo

1.1.1 Hệ thống phân loại

Trong hệ thống phân loại thực vật, chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) thuộc họ lan hay họ phong lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Liliopsida), ngành thực vật hạt kín

Angiospermanophyta), phân giới thực vật bậc cao (Cosmobionia), giới thực

vật (Plantae) (Trần Hợp, 1998; Hoàng Thị Bé, 2004; Leitch và cs., 2009;

Evans và cs., 2012)

Tên gọi Dendrobium

đã được nhà thực vật người Thụy Điển Swartz đưa ra lần đầu tiên vào năm

1799 trong “Nova Acta Regiae Societatis Scientiarum Upsaliensis 6” Từ đó đến nay hầu hết các nhà nghiên cứu hoa lan đều dùng tên gọi này (Dương Đức Huyến, 2007)

Tuy nhiên, từ trước đó Loureiro đã công bố hai loài có tên gọi là

Ceraia simplicissima và Callista amabilis trong “Flora Cochinchinensis”

(1970) mà các nhà nghiên cứu sau này xếp vào chi Dendrobium Tên gọi

Ceraia và Callista ít được quan tâm nên sau này nó trở thành tên đồng nghĩa

của Dendrobium (Dressler, 1993)

Đại đa số các nhà phân loại như Lindley (1830), Reichenbach (1861), Bentham và Hooker (1883), Pfitzer (1890), Holttum (1953), Seidenfaden

(1985) đều chia Dendrobium thành các nhóm khác nhau (section) Song cũng

có vài tác giả chọn cách phân chia chi Dendrobium thành các phân chi

(subgennus) như Kraenzlin (1910) (Dressler, 1993; Leitch và cs., 2009)

Nghiên cứu phân loại chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) ở Việt Nam

thường dựa trên hệ thống của Seidenfaden (1985) Hệ thống này rõ ràng, không phức tạp, có độ tin cậy cao và phù hợp với các đại diện của chi lan Hoàng Thảo

ở Việt Nam (Trần Hợp, 1998; Dương Đức Huyến, 2007)

1.1.2 Đặc điểm hình thái

1.1.2.1 Thân

Các đại diện của chi lan Hoàng Thảo rất dễ nhận biết ở ngoài thiên nhiên Đó là các cây thân thảo, mọc nhóm, , phân đốt, sống phụ sinh trên các cây gỗ hoặc ít gặp các loài sống bám trên đá, trong rừng ẩm Tuy nhiên phân biệt các taxon trong chi gặp nhiều khó khăn bởi tính

đa dạng của chúng thể hiện ở cơ quan sinh dưỡng cũng như cơ quan sinh sản

Thân của các đại diện chi lan Hoàng Thảo đều phân đốt, hình trụ, hình con suốt, hình chùy, hình trứng, có chiều dài thay đổi từ 3cm đến 120cm hoặc đôi khi hơn, kích thước phổ biến là 20-50 cm (Trần Hợp, 1998)

Lát cắt ngang thân có thể hình tròn, , đôi khi hình 4 cạnh nhưng gọi chung kích thước ngang này là chiều dày, thay đổi từ 0,3cm đến 1,5cm nhưng đa số hay gặp là khoảng 0, 5-1cm

Thân có thể mảnh, đôi khi dẹp bên hoặc là dày mập lên Phần dày mập lên của thân gồm một vài lóng ở sát gốc hoặc sát ở đỉnh Đôi khi phần dày lên

có hình con suốt có 4 gờ sắc Ở cá biệt vài loài chỉ có các mấu dày lên, còn

lóng thì hầu như không làm thân có dạng tràng hạt (D pendulum) hoặc sự dày lên là dần dần độc lập ở mỗi lóng làm thành dạng đùi gà nối tiếp (D nobile,

D wardianum) Phần tận cùng là gốc, nơi xuất phát của rễ, thường là nhỏ

mảnh nhưng cũng không ít trường hợp phình to ra (Hoàng Thị Bé, 2004; Dương Đức Huyến, 2007)

1.1.2.2 Lá

Lá mọc thành hai dãy so le nhau, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm thân, ít khi không có bẹ Lá phân bố suốt dọc thân nhưng ở nhiều đại diện lá tập trung 2-5 chiếc ở đỉnh thân, cũng có khi phần đỉnh thân chỉ có hoa mà

không có lá (D.acinaciforme, D.dalatense loài

rước khi hoa nở Số lượng lá thay đổi từ rất nhiều đến khi chỉ còn 3-5, hiếm khi 2 hoặc 1

Lá thường cứng, dạng da, bóng, ít khi nạc và mềm, bề mặt thường nhẵn, đôi khi bề mặt bẹ và lá (thường là khi lá còn non) có phủ lông cứng ngắn màu đen sớm rụng Lá nguyên, mép nhẵn, màu xanh có các gân hình cung Lá thường hình mác, bầu dục, đôi khi hình kiếm, hình thuôn hoặc ít khi

lá hình thoi dài Đỉnh lá nhọn hoặc tù, rất nhiều trường hợp lá xẻ 2 thùy nhọn,

tù hoặc là tròn lệch nhau Chiều dài của lá thay đổi từ 1-19cm và chiều rộng lá

từ 0,3-3,5 cm Lá hình trụ thường có bề dày (đường kính) từ 0,2-0,4cm (Trần Hợp, 1998; Averyanov, 2004)

1.1.2.3 Hoa

Hoa thường là nhiều hoa, đôi khi ít hoa hoặc hoa đơn độc Nhóm hoa dài thường rủ thõng xuống, nhiều loài có nhóm hoa đẹp có giá trị làm cảnh (Trần Hợp, 1998)

Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ Hoa đa

số các loài có hương thơm Bao hoa chia hai vòng, vòng ngoài gồm 1 lá đài giữa và 2 lá đài bên, vòng trong gồm có 2 cánh hoa và 1 cánh môi

* Cằm

2 lá đài bên dính nhau và dính với chân cột, có các hình bán cầu, hình túi đến hình cựa, hình trụ cong ít nhiều

* Cánh môi

So với lá đài, cánh hoa ít nhiều có kích thước và màu sắc khác biệt Tuy nhiên, ngay trong các cánh hoa thì cánh môi khác nhiều so với các thành phần còn lại của bao hoa cả về màu sắc, kích thước lẫn hoa văn Hoa văn đa dạng trên cánh môi (đốm, vạch, diềm tua, u lồi, đường sống, lông phủ) chiếm vị trí

khá quan trọng trong phân loại Nhiều đại diện có gốc cánh môi dính với chân cột tạo thành cựa

* Cột hoa (trụ nhị-nhụy)

Cột hoa hay còn gọi là trụ nhị-nhụy, có khi còn được gọi là trụ, thường thấp, mặt trước hơi lõm lòng máng; đỉnh cột lõm để chứa khối phấn, hai mép đỉnh cột có 2 răng cột, phủ lên đỉnh cột là nắp bao phấn (thường gọi đơn giản

là nắp)

Ở gốc cột có mỏ, thường là một phần phụ, dạng màng nhô ra nhằm ngăn cách bao phấn với nhụy (hốc đặt phấn) Chỗ thấp nhất phía dưới cột là chân cột, thường hình tam giác thuôn và có tuyến mật Bao phấn hình mũ, bề mặt thường nhẵn hoặc có nhú mịn, đôi khi có lông bao phủ Khối phấn hình chùy, không có chuôi, số lượng là 4, xếp thành 2 cặp Bầu hạ, thường nhỏ và thon dần xuống cuống hoa, ranh giới giữa bầu và cuống hoa không rõ rệt, bầu

3 ô, rất nhiều noãn

1.1.2.4 Quả

Quả nang thường là hình chùy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh Khi quả già, gặp trời ẩm sợi này sẽ hút nước và trương lên, phá vỡ vỏ quả giải phóng hạt ra ngoài Hạt rất nhỏ, hầu như không trọng lượng, bao quanh hạt là lớp màng, dạng mắt võng, trong suốt, chứa đầy không khí, dễ dàng bay cùng hạt trong không khí nhờ gió

So với những chi gần cận là Flickingeria, Epigenium, Eria thì

Dendrobium có những đặc điểm phân biệt căn bản sau đây:

- Các đại diện của chi Dendrobium luôn mọc nhóm và có thân phân đốt

chứ không mọc đơn độc trên thân rễ và chỉ có 1 lóng như các đại diện của

Flickingeria

- Dendrobium luôn có số lượng khối phấn là 4 chứ không phải là 2 như

ở chi Epigenium hoặc 8 như ở Eria

- Chi Dendrobium không có lông mềm mịn trên lá hay các bộ phận của hoa như chi Eria

1.1.2.5 Rễ

Rễ của các đại diện chi lan Hoàng Thảo là rễ khí sinh, thường mảnh, hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể hoặc buông thõng xuống Độ dày của rễ từ 0,1-0,3cm Rễ thường mọc ra từ

phần gốc của thân hoặc đôi khi có thể ở mấu thân một vài loài (D

Bilobulatum; D parcum…(Trần Hợp, 1998; Dương Đức Huyến, 2007)

1.1.3 Phân bố vùng sinh thái

Chi Hoàng Thảo trên thế giới phân bố chủ yếu ở lục địa Đông Nam Á

và các đảo thuộc Philippin, Malaixia, Inđônêxia, Đông Bắc Ôxtrâylia

T : Hoàng Thảo (D lindleyi), Hoàng

Thảo (D Superbum Rchb.f), Hoàng Thảo (D fimbriatum Hook),

Hoàng Thảo (D tortile Ldl), Hoàng Thảo Tam Đảo (D daoense)

Đ : Hoàng Thảo (D aduncum Wall),

Hoàng Thảo (D nobile Ldl), Hoàng Thảo (D hancockii), Hoàng

Thảo Thái Bình (D moschatum)

: Hoàng Thảo (D tortile Ldl), Hoàng Thảo (D fimbriatum), Hoàng Thảo (D hercoglossum Rchb.f),

Hoàng Thảo (D podagraria Hook.f), Hoàng Thảo (D

terminale Par et Rchb.f)

: Hoàng Thảo (D oxyanthum

Gagn), Hoàng Thảo (D tenellum Lindl)

: Hoàng Thảo Tua (D hadveyanum Reichb.f), Hoàng

Thảo (D hadveyanum Reichb.f), Hoàng Thảo (D

formosum Roxb), Hoàng Thảo (D fimbriatum Hook), Hoàng Thảo

(D pierardii), Hoàng Thảo (D gratiosissimum Reichb.f),

Hoàng Thảo (D kentrophyllum Hook.f), Hoàng Thảo Môi tơ (D

delacourii Guill), Hoàng Thảo Vani (D aduncum), Hoàng Thảo Đại bạch hạc (D christyanum)

: Hoàng Thảo (D anceps Sw), Hoàng

Thảo (D cretaceum Lindl), Hoàng Thảo (D

caryaecolum Guill), Hoàng Thảo (D cathcartii Hook.f)

: Hoàng Thảo (D.acinaciforme

Roxb)

: Hoàng Thảo (D lindleyi), Hoàng

Thảo m (D anseps), Hoàng Thảo (D capillpes), Hoàng Thảo

(D chrysanthum), Hoàng Thảo (D moschatum), Hoàng

Thảo (D nobile), Hoàng Thảo (D anosmum), Hoàng

Thảo (D tortile), Hoàng Thảo (D thyrsiflorum),

Hoàng Thảo (D farmeri), Hoàng Thảo (D

amabile), Hoàng Thảo (D haveyanum), Hoàng Thảo (D chrysotoxum), Hoàng Thảo (D draconis Rchb.f), Hoàng Thảo Long tu (D primulinum), Hoàng Thảo (D

gratiosissimum), Hoàng Thảo (D pierardii), Hoàng Thảo

(D flavum), Hoàng Thảo (D pucherrima), Hoàng Thảo Hoàng

lạp (D chrysotoxum) (Trần Hợp, 1998; Averyanov, 2004) Các đại diện của

chi Hoàng Thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên đá, thường ở nơi ẩm, mọc ở độ cao 500-1500m so với mực nước biển, nhưng có khi gặp chúng mọc ở độ cao từ 200m - 2000m (Trần Hợp, 1998; Trần Duy Quý, 2005; Averyanov, 2004; Leitch và cs., 2009)

1.2 Giá trị sử dụng của hoa lan Hoàng Thảo

Lan

quý , Phương Dung (Averyanov, 2004) Ngoài ý nghĩa làm cảnh, một số loài Hoàng Thảo cũng là một vị thuốc dân tộc

cổ truyền Các loài D nobile, D gratiosissimum, D crumenatum được dùng

để chữa sốt nóng, khô cổ, bứt rứt, kém ăn, giảm thị lực Các vị thuốc từ Hoàng Thảo có tên Shih-Hu hay Shihu có vị ngọt, tính hàn có tác dụng bồi bổ c

., 2004; Zhang và cs., 2005; Domyati và cs., 2011; Cai và cs., 2012; Feng và cs., 2013)

Lan H (D primulinum Lindl)

Hoàng Thảo Phương dung, Hoàng Thảo ,

Hoàng Thảo vảy rắn (D hancoki) c

,

(Domyati và cs., 2011; Cai và cs., 2012; Feng và cs., 2013)

Đ

Nước ta là nước có điều kiện thuận lợi cho các loài lan sinh trưởng và phát triển, cho nên hoa lan đã được nhân dân ta thuần hoá và trồng từ lâu đời Càng ngày các loài lan càng trở nên phong phú và đa dạng nhờ được bổ sung các giống lan mới do lai tạo và nhập nội Đối với người Việt Nam, hoa lan là hình ảnh gần gũi và thân thiết vì nó là loài hoa vừa đẹp vừa dễ trồng Trồng lan không những là thú vui tiêu khiển bổ ích giúp con người hoà hợp với thiên nhiên mà còn là nghề đưa lại nguồn thu nhập kinh tế khá cao Nó phù hợp với tình hình kinh tế của nước ta hiện nay, tạo điều kiện để mở rộng các mặt hàng xuất khẩu và giải quyết công ăn việc làm cho mọi người ở mọi lứa tuổi Ngoài ra trồng lan tốn ít đất, không phải sử dụng đất của nông nghiệp Trồng lan còn tạo vùng cây xanh cho gia đình, làm không khí thêm trong lành, góp phần tích cực bảo vệ môi trường, nhất là ở thành phố Trồng lan còn nâng cao cuộc sống tinh thần của chúng ta, giúp ta biết hưởng thụ và cảm nhận cái đẹp, biết yêu và bảo vệ thiên nhiên (Nguyễn Văn Kết và cs , 2005; Trần Duy Quý, 2005)

1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng ở thực vật

1.3.1 Khái niệm về đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là tất cả các gen di truyền khác nhau của tất cả các

cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa các loài khác nhau

Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể

trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể

Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di

truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền

1.3.2 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã

tự nhiên và rất quan trọng đối với con người Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì khả năng sinh sản, khả năng đề kháng của các loại dịch bệnh và khả năng thích nghi với những thay đổi của môi trường sống Sự đa dạng di truyền ở cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ cho lợi ích của con người

1.3.3 Các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng ở thực vật

1.3.3.1 Phương pháp dựa vào chỉ thị hình thái

Phương pháp đánh giá đa dạng ở mức hình thái là phương pháp truyền thống, bao gồm việc miêu tả những đặc điểm, cấu tạo hình thái bên ngoài Đối với thực vật, phương pháp đánh giá đa dạng hình thái cụ thể là:

- Đặc điểm của thân: cấu tạo, hình dáng, kích thước (chiều dài, chiều rộng và đường kính)

- Đặc điểm của lá: màu sắc, số lượng của lá trung bình của một cây, chiều dài và chiều rộng của lá, hình dáng của lá, cấu tạo lá

- Đặc điểm của hoa: màu sắc, số lượng hoa trên bông, số lượng bông trên thân, cách sắp xếp của cánh hoa, kích thước, mùi hương của hoa, thời gian ra hoa, thời gian hoa tồn tại

Các đặc điểm hình thái trong phân loại sinh vật được sử dụng từ rất sớm Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là: “Hai đơn vị phân loại (taxon) càng

có nhiều đặc điểm chung, càng giống nhau thì quan hệ giữa 2 taxon càng gần gũi với nhau Bất cứ sự khác nhau nào giữa 2 cá thể đều được nghiên cứu, nhưng không phải bất cứ đặc điểm nào cũng có thể dùng làm đặc điểm phân loại” Những đặc điểm phân loại ổn định, biến đổi chậm, liên quan đến những cấu trúc ít biến đổi của cơ thể sinh vật có tác dụng phân biệt và xác định các taxon bậc cao, những biến đổi nhanh hoặc liên quan đến cơ chế cách

li sinh sản có tác dụng xác định các taxon bậc thấp Người ta thường kết hợp nhiều đặc điểm để làm tăng giá trị tin cậy của kết quả so sánh (Bateman, 2001; Pellegrino và cs., 2005)

Mặc dù phương pháp sử dụng các chỉ tiêu hình thái có ưu điểm là tiện lợi, nhanh chóng, kinh tế, có thể so sánh các đặc điểm giữa các loài hoá thạch với các loài đang sống để tìm kiếm mối quan hệ họ hàng giữa chúng Nhưng việc lựa chọn và cân nhắc giá trị sử dụng của các đặc điểm phân loại là một trong những khâu khó nhất, không chỉ đòi hỏi kiến thức

mà còn đòi hỏi kinh nghiệm và sự khéo léo của các nhà phân loại học Bên cạnh đó, phương pháp này nhiều khi không chính xác vì có hiện tượng đồng quy tính trạng và không phân biệt được các loài đồng hình (Krishnan và cs., 2011)

1.3.3.2 Phương pháp dựa vào các chỉ thị hóa sinh

Các isozyme được định nghĩa như các dạng khác nhau của một enzyme (protein) có chức năng giống hay gần gũi nhau có ở cùng một cá thể (Salazar, 2003) Trong quá trình tiến hoá, các gen có thể bị đột biến và hình thành các alen khác nhau Mỗi khu vực địa phương tạo nên các quần thể cùng loại được tiến hoá, chọn lọc theo các alen khác nhau Việc phân tích isozyme cho ta

những alen đồng trội và là phương pháp tương đối rẻ, dễ tiến hành hơn các phương pháp phân tích ADN Tuy nhiên, với số lượng ít ỏi các isozyme và chúng chỉ thể hiện ở một giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể và là sản phẩm của gen nên chưa phản ánh thật chính xác bản chất di truyền của các cá thể Do vậy, việc sử dụng chỉ thị isozyme còn có những hạn chế nhất định

1 3 3 3 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào các chỉ thị phân tử ADN

Để đánh giá bản chất di truyền của các cá thể dựa vào hệ gen của chúng, các chỉ thị ADN đã được ứng dụng cho nhiều mục đích khác nhau của các đối tượng khác nhau như: xây dựng thư viện bộ gen, xác định cây phát sinh chủng loại, đánh giá đa dạng di truyền, xác định quan hệ họ hàng Ở thực vật, có nhiều loại chỉ thị phân tử đã được ứng dụng trong các nghiên cứu Các chỉ thị ADN phổ biến trong nghiên cứu sinh học phân tử ở thực vật là: Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP); Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD); Microsatellite hay Simple Sequence Repeates (SSR); Inter-Simple Sequence Repeats (ISSRs) (Lau và cs., 2001; Qian và cs., 2008; Yao và cs., 2009; Wang và cs., 2009; Singh và cs., 2012; Shangguo và cs., 2013; Swati

Das và cs., 2014)

* Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Chỉ thị RFLP được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen, ví dụ như đảo đoạn, thêm đoạn, mất đoạn hoặc sự mất đi hay thêm vào của một hay nhiều nucleotit khác nhau tuỳ thuộc vào đặc điểm riêng

biệt của mỗi giống, loài, thậm chí mỗi cá thể Mỗi một loài sinh vật có một bộ ADN genome đặc hiệu trong cấu trúc Vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, người ta có thể nhận biết được những đoạn ADN có chiều dài khác nhau bằng kĩ thuật lai ADN với những mẫu giống dò (probe) Đó là nguyên lý kĩ thuật đa hình chiều dài các mảnh phân cắt giới hạn RFLP Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội, nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một locut gen Do vậy, có thể phân biệt được các cá thể đồng hợp (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp (Aa) Đây là đặc điểm ưu việt của chỉ thị RFLP Hạn chế của phương pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, đòi hỏi nhiều trang thiết bị phòng thí nghiệm Thêm nữa, phương pháp này sử dụng một lượng lớn ADN mà số lượng đa hình thu được rất ít ỏi, thậm chí ở một số loài khó nhận được đa hình (Besnard và Bervillé, 2002)

Ở thực vật, chỉ thị RFLP lần đầu tiên được áp dụng trong nghiên cứu gen chịu trách nhiệm tổng hợp RNA ribosome trong vùng cấu trúc nhân của lúa mì Từ đó, việc lập bản đồ di truyền sử dụng chỉ thị RFLP đã được ứng dụng đối với nhiều loại cây trồng khác nhau bao gồm cà chua, ngô, khoai tây Chỉ thị RFLP còn được sử dụng trong lập bản đồ QTLs cho tính trạng chất lượng và năng suất lúa, các gen kháng đạo ôn, gen kháng rầy nâu (Huang

và cs., 1997; Shu và cs., 2008; Singh và cs., 2007; Huang và cs., 2013)

* Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Loại chỉ thị AFLP được sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu lập bản đồ gen và xác định chỉ thị phân tử liên kết gen Kĩ thuật tạo ra các loại chỉ thị này được gọi là nhân bội chọn lọc những mảnh cắt giới hạn Phương pháp linh hoạt này có thể phát hiện được sự có mặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN nào Nguyên lý của kĩ thuật AFLP dựa trên cơ sở nhân bội có chọn lọc những mảnh cắt giới hạn từ ADN hệ gen Kĩ thuật AFLP có

thể tạo ra số lượng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với các kĩ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi Lượng ADN tổng số sử dụng cho kĩ thuật này lại rất ít Đây

là một phương pháp có hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng di truyền Chỉ AFLP được áp dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở nhiều loại cây khác

nhau như: Arabidopsis thaliana; mía, carot, lúa, lúa mì, khoai tây, cây

Jatropha (Breyne, và cs., 1999; Briard và cs., 2000; Besse và cs., 2002;

Tatikonda và cs., 2009; Wang và cs., 2011) Tuy nhiên, mặt hạn chế của AFLP là chỉ thị di truyền trội, không có khả năng phân biệt giữa thể đồng hợp

và dị hợp, giá thành cho nghiên cứu tương đối cao (Vos và cs., 1995; Ibrahim

và cs., 2010)

* Chỉ thị SSR (Microsatellite hay Simple Sequence Repeates)

Chỉ thị SSR hay chỉ thị vi vệ tinh, là những đoạn ADN lặp lại một cách

có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 1 đến 6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn (Queller và cs., 1993) Hiện tượng các SSR trong cơ thể sinh vật nhân là khá phổ biến ở động vật và thực vật Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng các Nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn (Cato và cs., 1996) SSR đã được nghiên cứu lần đầu tiên trên người, và cho đến nay nó được tìm thấy trong các hệ gen của một số cơ thể Eukaryot khác như các gia cầm, động vật có vú, cá và trên vài loài cây một lá mầm và hai lá mầm (Morgante và Olivieri, 1993) Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội

từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại Giá trị của SSR là ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR Những chuỗi đa hình đơn giản này đã được ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tượng động vật và thực vật Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được xác định trên các cây rừng nhiệt đới, cây bắp

cải, lúa mì, và 34 giống cây trồng khác (Fossati và cs., 2001) Ở người, SSR được gọi là thế hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử Những kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra rằng ở thực vật, SSR mang trình tự lặp lại (AT)n nhiều hơn so với

ở động vật, trong khi ở những loài động vật thì lại giàu SSR kiểu (GT)n hơn

(Varela và Amos, 2010) Những nghiên cứu trên lúa, ngô, Arabidopsis, hoa,

nấm bệnh cũng cho kết quả tương tự Nghiên cứu sàng lọc (screening) thư viện genome lúa cho thấy có khoảng 5700-10000 vi vệ tinh ở lúa (Holton và cs., 2002; Gao và cs., 2004; Prabakaran và cs., 2010; Singh và cs., 2013; Peyachoknagul và cs., 2014)

* Chỉ thị ISSRs (Inter-simple sequence repeats)

ISSR là kỹ thuật dựa trên PCR, nhân bản các đoạn ADN nằm giữa hai vùng lặp SSR hướng ngược chiều nhau sử dụng một loại mồi duy nhất (dài khoảng 15-25 nucleotide) có trình tự lặp giống như SSR Các mồi ISSR có thể được bổ sung thêm từ một đến bốn nucleotide “neo” ở đầu 3‟ hoặc đầu 5‟ nhằm tăng độ đặc hiệu của phản ứng nhân gen Hầu hết chỉ thị ISSR là chỉ thị trội và có tính ổn định cao hơn chỉ thị RAPD Dựa trên các motif lặp và số nucleotide làm “neo” để thiết kế mồi ISSR thì số lượng chỉ thị ISSR gần như

là không giới hạn (Leroy và cs., 2000; Tusa và cs., 2002) Chỉ thị ISSR có tính đa hình cao và rất hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xây dựng cây phát sinh chủng loài (Shangguo và cs., 2013; Swati Das và cs., 2014)

* Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Loại chỉ thị này được sinh ra bởi phản ứng PCR, do sự nhân bội những đoạn ADN hệ gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random primer) dài khoảng 9 - 10 nucleotit dưới nhiệt độ bắt cặp thấp (khoảng 370C) (Williams và cs., 1990) Sản phẩm của phản ứng được phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và quan sát dưới đèn cực tím Sản phẩm PCR khi dùng với mồi ngẫu nhiên thường đa dạng, có chiều dài từ

100 - 500 nucleotit và khi điện di gel agarose được phân tách thành các phân đoạn khác nhau Nếu các mẫu giống nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu được gồm các đoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc Khi bộ gen của các mẫu giống nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR nhân được các đoạn khác biệt nhau (Hunt và cs., 1992; Lerceteau và cs., 1997)

Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã thiết lập đựơc phần mềm máy tính để

tự động vẽ lên biểu đồ quan hệ hay độ tương đồng di truyền của các đối tượng nghiên cứu sau khi nhập dữ liệu về các phân đoạn được nhân bản của các cá thể NTSYSPC là tên một chương trình thuộc kiểu trên có thể tạo các biểu đồ hình cây Biểu đồ thu được sẽ thể hiện mức độ gần nhau của các cá thể cho phép đánh giá được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể được nghiên cứu Công trình này cho phép giảm bớt thời gian tính toán và có độ chính xác cao nên nó là một phần mềm hiệu quả trong việc phân tích kĩ thuật RAPD Chỉ thị

Đó là hạn chế của chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ ở những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại RAPD là kĩ thuật phân loại phân tử dễ sử dụng, được ứng dụng trong xác định tính đa dạng sinh học và quan hệ họ hàng của các giống thực vật, động vật khác nhau trong các loài

Lợi thế của loại chỉ thị này là không cần biết thông tin về trình tự Chỉ thị RAPD còn có một hạn chế nữa là độ nhạy của RAPD bị phụ thuộc vào điều kiện của phản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại được, đặc biệt là ở những đối tượng có bộ gen lớn như lúa mì Để khắc phục hạn chế này, người

ta đã nhân dòng những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi

thiết kế những đoạn mồi dài khoảng 20bp từ cả hai đầu và gọi là chỉ thị SCARs (Sequence - Characterized Amplified Region) Do đó, trong phân tích

di truyền, để đảm bảo kết quả có độ chính xác cao, người ta thường sử dụng kết hợp kĩ thuật RAPD với các kĩ thuật phân tử khác (Hansen và cs., 1998; Hopkins và Hilton, 2001; Li và cs., 2007; Xue và cs., 2010; Chattopadhyay

và cs., 2012)

1.3.3.4 Các phương pháp nghiên cứu về phân loại thực vật dựa trên trình

tự gen

Có rất nhiều gen cpDNA tham gia trong phân tích phân loại thực vật

như: như các vùng exon của các gen rbcL, atpB, ndhF và matK; vùng intron của các gen trnL và trnL-F, trải rộng từ bộ cho đến mức dưới loài Vùng 16S phù hợp ở mức bộ, trong khi rbcL, atpβ và ndhF phù hợp từ mức bộ đến mức loài Vùng intron trnL, spacer trnL-trnF và matK có thể áp dụng trong một

biên độ rộng từ bộ cho tới dưới loài Trước đây chúng thường được sử dụng

từ mức họ cho tới mức loài, hiện nay chúng thường được sử dụng từ mức họ

cho đến phụ loài Vùng atpβ-rbcL có thể được sử dụng từ mức chi đến mức

dưới loài, nhưng chúng cũng thường được sử dụng từ mức chi đến mức phụ loài (Hilu và Liang, 1997; Khew và Chia; 2011; Sharma và cs., 2012; Li và cs., 2014; Natascha và cs., 2014)

* Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là một đoạn RNA không có

chức năng, nằm giữa các RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã

Cấu trúc vùng ITS gồm ITS1- 5.8S- ITS2 Trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy Một lợi thế của vùng ITS là

nó bao gồm 2 locus riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locus 5.8S Vùng 5.8S khá bảo ôn, trên thực tế có đủ tín hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức bộ và ngành Do đó các locus 5.8S có thể phục vụ như là một điểm

neo liên kết quan trọng để so sánh trình tự trong cả phát sinh loài và nhận

diện Tiện ích của vùng bảo tồn như 5.8S tạo thuận lợi cho việc so sánh cơ sở

dữ liệu, đặc biệt là khi so sánh một chuỗi không tương đồng với thư viện trình

tự (Richardson và cs., 2001; Sharma và cs, 2012)

* Vùng Gen rbcL (ribulose-bisphosphate carboxylase) được sử dụng

nhiều để dựng cây phát sinh loài Tuy nhiên, đối với mối quan hệ di truyền ở mức dưới loài thì sự phân tích trên gen này gặp nhiều hạn chế Vì vậy, việc

cần phải tìm một vùng ADN khác tiến hóa nhanh hơn gen rbcL để xây dựng cây phát sinh loài ở mức dưới loài và gen matK là một gen đầy hứa hẹn cho

mục tiêu này (Kress và Erickson, 2007)

* Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên

trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen trnK mã hóa

cho tRNALys (UUU) của lục lạp Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 codon nằm

trong intron của gen trnK và dường như chưa rõ chức năng Các nghiên cứu

sử dụng trình tự gen matK để xây dựng cây phát sinh loài như cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp và do vậy gen

matK trở thành gen chỉ thị quan trọng để giúp phân loại thực vật (Asahina và

cs., 2010; Sharma và cs., 2012)

* Kỹ thuật xây dựng mã vạch bằng phương pháp giải trình tự

Dù chỉ mới được nghiên cứu từ thập niên 70 của thế kỉ XX, giải trình tự (Sequencing - Kỹ thuật xác định một phần hay toàn bộ trình tự Nucleic acid của phân tử ADN) đã có những ứng dụng rộng rãi, đặc biệt trong dự đoán chức năng gen, các nghiên cứu nhân dòng phân tử hay các mối liên hệ tiến hoá, đa dạng sinh học cho công nghệ sinh học phân tử và công nghệ sinh học nói chung

Xác định trình tự một đoạn ADN không chỉ là một bước quan trọng trong chiến lược giải mã toàn bộ gen mà còn được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu khác Trong lĩnh vực nhận dạng phân tử, nghiên cứu phát sinh loài

thì chỉ cần phân tích xác định trình tự một vài gen chỉ thị giữa các loài cần khảo sát mà không cần thiết phải xác định trình tự toàn bộ bộ gen Từ hai phương pháp giải trình tự chính là phương pháp hoá học của Maxam-Gilbert

và enzyme học của Sanger (1977), các kỹ thuật giải trình tự dần được cải tiến cho đến ngày nay Mặc dù có nhiều sự khác biệt giữa các phương pháp, nhưng cơ bản vẫn là thực hiện các phản ứng (dùng tác nhân hoá học hay enzyme xúc tác) tạo ra tập hợp các đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau mà nucleotide tận cùng các đoạn này có thể xác định được, sau đó phân tách các đoạn oligonucleotide bằng điện di trên gel polyacrylamide (PAGE) hay điện di mao quản (capillary electrophoresis) và xác định trình tự dựa trên tín hiệu huỳnh quang hay đánh dấu phóng xạ (Lee và cs., 2009)

Phương pháp đang được sử dụng phổ biến nhất hiện nay trong việc giải trình tự hiện nay đó là phương pháp giải trình tự bằng máy tự động Cơ sở của những phương pháp này vẫn sử dụng các dideoxynucleotide, việc đánh dấu phóng xạ được thay bằng đánh dấu huỳnh quang trên các ddNTP hay mồi (primer), và kết quả được đọc thông qua một hệ thống máy tính Khác với các phương pháp khác khi mà kết quả được đọc sau khi tiến hành xong điện di, phương pháp sử dụng máy tự động có một thiết bị thu nhận tín hiệu được đặt

ở vị trí gần cuối bản điện di và tín hiệu huỳnh quang sẽ được thu nhận ngay khi phân tử ADN di chuyển qua vị trí đó Trong hệ thống giải trình tự tự động

bằng ABI (Applied Biosystems Incorporated) mỗi loại ddNTP được đánh dấu

với một loại thuốc nhuộm khác nhau (dye-labeled terminator), do đó chỉ cần

chuẩn bị một hỗn hợp phản ứng, hay nhuộm mồi (dye-labeled primer)

Trình tự sau khi được xác định bằng hệ thống máy tự động (như ABI) chưa thể sử dụng ngay cho việc phân tích Việc đọc base tự động do các máy thực hiện (automated base-calling) có một tỷ lệ sai sót nhất định tuỳ theo phương pháp và loại máy sử dụng Sự sai sót này xảy ra bởi cường độ tín hiệu huỳnh quang thu được không phải lúc nào cũng rõ ràng Khoảng cách không

đồng đều giữa các mũi tín hiệu cũng như sự chồng lắp các tín hiệu dẫn đến việc máy tính nhận và hiển thị sai kết quả Hiện tượng này xảy ra do nhiều nguyên nhân như bản chất của trình tự khảo sát, sự nhiễm các mẫu giống ADN khi thực hiện, thao tác và loại phương pháp giải trình tự sử dụng

Mặc dù những cải tiến về mặt kỹ thuật và thuật toán nhằm cải thiện độ chính xác trong việc đọc trình tự tự động của máy đang được nghiên cứu tích cực, tuy nhiên tỷ lệ sai sót vẫn có thể xảy ra và khó có thể đọc chính xác tuyệt đối bằng phương pháp tự động Khi một base bị đọc sai có thể dẫn đến nhiều sai lầm nghiêm trọng trong việc phân tích sau này Do vậy, những biện pháp hiệu chỉnh lại trình tự cần được chính con người trực tiếp thực hiện nhằm khắc phục tối đa việc xác định sai trình tự (Margulies và cs., 2005; Schadt và cs., 2010)

1.4 Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam

Cây hoa lan được biết đến đầu tiên ở Phương Đông là loài Kiến lan Theo tác giả Bretchacidor thì từ đời vua Thần Nông 2800 trước công nguyên,

ở Trung Quốc loài lan này đã được dùng làm thuốc chữa bệnh Sau đó, cùng với vẻ đẹp và hương thơm của nó kết hợp với công dụng chữa bệnh nên loài hoa này đã có mặt ở châu Âu Tại đây, người ta đã tiến hành nhiều nghiên cứu khá công phu và tỉ mỉ về hoa lan (Molvray và cs., 2000)

Các thế kỷ XVI - XVII, những người châu Âu đặc biệt là người Anh đã

đi khắp thế giới nghiên cứu, sưu tập cây cỏ Trong thời kỳ này, nhiều loài lan nhiệt đới đã đưa về nước Anh Năm 1794 ở Anh, người ta đã biết được 15 loài lan nhiệt đới Đầu thế kỷ XX, kỹ thuật gieo trồng hoa lan từ hạt bằng nhiều nấm cộng sinh có từ cây lan mẹ bắt đầu một giai đoạn mới đối với nghề nuôi trồng lan Đặc biệt là đưa kỹ thuật lai tạo áp dụng vào giống lan, tạo ra những cây lan lai có vẻ đẹp về màu sắc và hình dạng duyên dáng hơn hẳn cây

bố mẹ Năm 1856, nhà làm vườn người Anh Fohn Domini đã lai tạo thành

công loài hoa lan Calanthe dominii bằng cách lai C masutra và C furcata

Năm 1960, lần đầu tiên Morel đã thực hiện thành công nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô trên đối tượng lan Kiếm thuộc nhóm lan đa thân (Dressler, 1981) Ngày nay, các loài lan đã xếp thành hệ thống phân loại chung gọi là Orchidaceace, lan rừng đã xác định được 750 chi và hơn 25.000 loài tự nhiên và có hơn 30.000 loài lan lai (Dressler, 1993)

Trước đây, các nghiên cứu về hình thái học chủ yếu tập trung vào các nghiên cứu nhằm thống kê toàn bộ họ của phong lan như công trình nghiên cứu của Dressler, 1993 Sau này các nghiên cứu tiến hành nghiên cứu về đa dạng di truyền dựa trên sự kết hợp giữa hình thái và chỉ thị phân tử như

RAPD, RFLP, AFLP, SSR , giải trình tự các vùng ITS, matK Đây là một

phương pháp rất phổ biến hệ di truyền của các giống/loài lan phục vụ cho công tác phân loại, bảo tồn, chọn và lai tạo giống

mới (Lau và cs., 2001; Qian và cs., 2008; Yao và cs., 2009; Wang và cs.,

2009; Singh và cs., 2012)

1.4.1 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng hoa lan trên thế giới

1.4.1.1 Nghiên cứu dựa vào chỉ thị hình thái

Các nghiên cứu về hình thái học tập trung vào các nghiên cứu về thân,

lá, hoa, rễ… các loài thuộc họ phong lan Các đối tượng nghiên cứu được lấy làm mẫu giống thường có yêu cầu rất cao về mức độ phân loại như thí nghiệm của Dressler, 1993 Trong thí nghiệm này, tác giả đã có những thống kê về sự phát sinh giống loài bắt nguồn từ nhánh Orchideae - Diseae nhưng không có nghĩa là nó sẽ đại diện cho 4 nhóm là Disa, Satyrium, Platanthera, Dactylor- hiza Mặc dù đãcó rất nhiều nghiên cứu về hình thái học qua hơn 2 thế kỷ qua nhưng chưa có bất kỳ nghiên cứu nào về các loài hoa ở Bắc bán cầu để đối chiếu với các nghiên cứu của Linder và Kurzweil về hình thái học và nguồn gốc phát sinh giống loài của các loài hoa lan ở Nam bán cầu (Douzery và cs., 1999)

Đối với chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium), Bechtel và cộng sự., 1981

đã phân loại 16 loài Dendrobium thành một nhóm với mức độ tương đồng của

nhóm nằm trong khoảng 78-98% và chúng thuộc cùng họ phụ là Orchidioideae

Kamemoto và cs., 1999 cho rằng loài lan D pulchellum được dùng để lai tạo ra loài D Gatton Sunray và được chứng nhận đầu tiên từ Royal

Horticultural Society, Canada Về mặt hình thái, hoa của chúng rất giống nhau, màu sắc và môi hoa cũng đều vàng và có hai đốm nâu đỏ ở họng hoa

Duy chỉ có màu cánh hoa và đài hoa của loài D pulchellum màu hồng kem,

và loài còn mang đặc tính nguyên thủy là hoa nở theo mùa (đầu mùa mưa),

trong khi loài D Gatton sunray có màu cánh hoa và đài hoa màu vàng, hoa

ngoài nở hoa tập trung theo mùa chính thì nó còn có thể nở hoa quanh năm

Do với đặc tính này cùng với đặc điểm dáng thân cây to và hoa rất đẹp, nên

loài D Gatton sunray đang rất được thị trường hoa lan ưa chuộng và giá trị

thương mại cao (Kamemoto và cs., 1999)

1.4.1.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa vào chỉ thị phân tử

Bên cạnh phương pháp sử dụng các đặc điểm hình thái để phân tích đa dạng di truyền, ngày nay sinh học phân tử đã cung cấp các công cụ hỗ trợ đắc lực là các kĩ thuật phân tử như: RFLP, RAPD, AFLP, SSR… trong đó, kĩ thuật RAPD được sử dụng phổ biến khắp thế giới và ở cả Việt Nam

Các phương pháp phân loại để nhận biết các loài lan trước đây chủ yếu dựa vào các tính trạng hình thái Việc đánh giá các tính trạng này là khó chính xác và không khách quan Vì vậy nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức phân tử

đã được nghiên cứu để bổ sung cho công tác phân loại các loài thực vật này (Yao và cs., 2009; Wang và cs., 2010; Singh và cs., 2012; Li và Zhu, 2013; Surin và cs., 2014)

* Nghiên cứu dựa vào chỉ thị RFLP trên ADN lạp thể

Các nghiên cứu dựa trên các trình tự của gen lục lạp đã giúp chúng ta

hiểu rõ hơn về sự phát sinh hình thái của các loài thuộc Orchidaceae Năm

1999, Chase đã sử dụng chỉ thị RFLP để nghiên cứu trên các ADN lạp thể của trên 9 loài của họ Orchids s.l liên quan đến „Aceras‟ anthropo phorum và

Ana Camptis pyramidalis (nhưng thiếu Neotinea s.l.) Trong nhóm này còn có Dactylorhiza saccifera, ở nhóm khác còn có Serapias vomeracea và Cephalanthera rubra cũng liên quan đến nghiên cứu về RFLP Tuy nhiên, các

nghiên cứu đã chỉ ra rằng Cephalanthera có khoảng cách di truyền khá xa so với Orchids s.l trong thực tế nhóm Serapias có quan hệ gần gũi với Orchids s.l hơn là Dactylorhiza (Chase, 1999)

RFLP là một công cụ hữu ích trong việc đánh giá đa dạng di truyền ở thực vật nói chung và cây hoa lan nói riêng Mới dây nhất, trên cây hoa địa

lan kiếm (Cymbidium), Li và Zhu (2013) đã sử dụng 8 cặp mồi RFLP để đánh

giá đa dạng di truyền của 54 giống địa lan khác nhau được thu thập từ Trung Quốc, Nhật bản và Hàn Quốc Kết quả cho thấy với 6 cặp mồi RFLP được sử dụng thì có 116 cho đa hình 54 mẫu giống hoa hoa địa lan kiếm chia thành 4 nhóm khác nhau gồm các giống của Trung Quốc vào một nhóm, các giống của Nhật Bản và Hàn Quốc vào hai nhóm khác nhau Riêng biệt hai giống Huangchengzhiyue và Xiongnu có nguồn gốc Nhật Bản tách biệt ra và tạo thành một nhóm (Li và Zhu, 2013)

Trên chi hoa lan Hoàng Thảo, mới đây nhất Surin và cs., 2014 đã sử dụng kĩ thuật RFLP để xác định nhận dạng 25 giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa của Thái Lan 23 trong số 25 giống này đã được nhận dạng, chỉ duy nhất

có hai loài là D crumenatum và D formosum không xác định được Tuy

nhiên hai loài này đã được xác định sau khi được cắt đoạn ADN lục lạp bằng cặp mồi psbC-tRNS với enzyme MboI (Surin và cs., 2014)

* Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị SSR

(cam, chanh, , lúa ) Tro

Tuy nhiên, v

Prattana Phuekvilai và cộng sự., 2009

(Vanda miss joachim)

[(CA)15 [(GA)15], [(ACC)10 (CCT)10

2 N

3 nucleotit

(GA)n(GT)n(45,19%), (GA)n(22,59%), (CA)n (CCT)n(9,26%)

khác nhau ở mức độ tương đồng di truyền 33% dựa trên cây phân loại (Prattana Phuekvilai và cs., 2009)

Huang và cs., 2011 đã sử dụng 15 chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền của 44 đ kiếm (Cymbidium

(Huang và cs., 2011)

Đối với chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium), chỉ có một vài nghiên cứu

về sử dụng chỉ thi SSR để đánh giá đa dạng di truyền trong những năm gần đây như các nghiên cứu của Gu và cs., 2007; Fan và cs., 2009; Cai và cs., 2012; Chattopadhyay và cs., 2012; Liu và cs., 2014 Trong các nghiên cứu này, các tác giả đã sử dụng tổng cộng 56 chỉ thị SSR để đánh giá các loài hoa

lan Hoàng Thảo có giá trị làm thuốc như D fimbriatum, D officinale, D

nobile được phân bố ở Trung Quốc, Đài Loan

Mới đây nhất, Liu và cộng sự., 2014 đã thiết kế 53 cặp mồi SSR trong

đó chỉ có 7 cặp mồi SSR cho đa hình trên 15 mẫu giống hoa Dendrobium Dựa trên cây phát sinh loài, 15 mẫu giống Dendrobium chia ra làm hai nhóm

khác nhau Kết quả cũng chỉ ra rằng, 7 cặp mồi SSR cho đa hình là một công

cụ hữu ích để nhận dạng các mẫu giống lan Hoàng Thảo khác trong tương lai (Liu và cs., 2014)

* Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị ISSR

Kĩ thuật ISSR là một phương pháp dựa trên chuỗi phản ứng PCR, mà

nó liên quan đến sự khuếch đại của đoạn ADN hiện diện ở một khoảng cách

có thể khuếch đại ở bên trong giữa hai vùng lặp lại vi vệ tinh giống hệt nhau theo hướng đối diện nhau Đã có rất nhiều nghiên cứu về đa dạng di truyền sử dụng loại chỉ thị này trên thực vật như cây lúa, ngô, lúa mì, cây dứa và đối với

cả hoa lan (Ammiraju và cs., 2001; Swati Das và cs., 2014) Đối với hoa lan Hoàng Thảo, tác giả Wang và cộng sự., 2010 đã sử dụng 17 chỉ thị ISSR để đánh giá đa dạng di truyền của 31 loài hoa lan Hoàng Thảo được thu thập ở Trung Quốc Kết quả cho thấy, trong số tổng 2368 băng được khuếch đại thi

có 278 ISSR locus có độ đa hình là 100% Qua 31 loài lan Hoàng Thảo bản địa, tác giả đã nhận dạng được 9 loài lan có giá trị sử dụng để làm thuốc Qua

đó, tác giả cũng khẳng định rằng việc sử dụng chỉ ISSR rất đáng tin cậy trong việc đánh giá đa dạng di truyền, phân tích kiểu gien ở thực vật Kết quả này cũng được một số tác giả như Shangguo và cs., 2013; Swati Das và cs., 2014 đánh giá cao về độ tin cậy của phương pháp này

* Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị RAPD

Với sự phát triển của các chỉ thị ADN dựa trên kĩ thuật PCR, các nhà nghiên cứu đã có một số lượng lớn các chỉ thị có giá trị cho mục đích nhận biết này Đã có các nghiên cứu sử dụng chỉ thị RAPD để phân tích đa hình ở hoa lan nhưng chủ yếu chỉ tập trung vào một số loại như: lan Kiếm

(Cymbidiums), lan Hài (Paphiopedilum), lan Hồ Điệp (Phalaenopsis), lan Đai