Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhạn dạng một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo (Dendrobium) bản địa của Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY DƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM) BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY DƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM)BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành : Di truyền Chọn giống trồng Mã số : 62.62.01.11 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Lã Tuấn Nghĩa 2. TS. Nguyễn Thị Thanh Thuỷ HÀ NỘI - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thực hiện. Các số liệu, kết luận án trung thực chưa công bố công trình khác. Tác giả Trần Duy Dương i LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, thầy cô giáo Khoa sau đại học tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình học tập. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới Phó Giáo sư, Tiến sĩ Lã Tuấn Nghĩa Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Thủy, người thầy tâm huyết tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi định hướng cho trình thực luận án. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Tiến sĩ Khuất Hữu Trung, Tiến sĩ Trần Hoàng Dũng, Kỹ sư Nguyễn Trường Khoa, bạn bè đồng nghiệp Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông Nghiệp tạo điều kiện giúp đỡ tiến hành nghiên cứu chia sẻ kinh nghiệm để hoàn thành luận án. Cuối cùng, xin gửi lòng ân tình tới gia đình nguồn động viên truyền nhiệt huyết để hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày… tháng… năm 2015 Nghiên cứu sinh Trần Duy Dƣơng ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ABI Applied Biosystems Incorporated AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism atpβ gene ATP synthase beta-subunit gene BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair C Cymbidium cpDNA Chloroplast DNA CTAB Cetyltrimethyl ammoium bromide D Dendrobium DNA Deoxyribonucleic acid DNAse Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribounucleotide triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediamine tetraacetate EtBr Ethidium bromide HT Hoàng Thảo ISSRs Inter-simple sequence repeats EDTA Ethylenediamine tetraacetate ITS Internal transcribed spacer IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry ML Maximum Likehood matK Maturase K ln likelihood mtDNA Mitochondrial DNA iii NCBI National Center for Biotechnology Information ndhF NADH dehydrogenase subunit F nDNA Nuclear DNA ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction QTLs Quantitative trait locus RAPD Random Amplified Polymorphic DNA rbcL Ribulose-bisphosphate carboxylase rDNA Ribosomal DNA rDNA Ribosomal DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribonucleic acid RNAse Ribounuclease SCARs Sequence - Characterized Amplified Region sect Section SSR Simple Sequence Repeates Taq Thermus aquaticus TBE Tris/Borate/EDTA Tm Melting Temperature U Unit UV Ultraviolet V Voltex ΣDNA DNA tổng số iv DANH MỤC BẢNG BIỂU TT bảng 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 3.1 Tên bảng Số trang Tên trình tự mồi RAPD nghiên cứu… Thành phần thể tích chất phản ứng PCR… Chu trình phản ứng PCR………………………… Mồi sử dụng phản ứng khuếch đại vùng ITS Cách thành phần có phản ứng khuếch đại vùng ITS…………………………………………………… Chu kì nhiệt khuếch đại vùng ITS…………………… 42 42 43 44 Nam sử dụng nghiên cứu……………… . 50 44 45 3.2 …………………………………………. 53 ………………………………… . 61 Đặc điểm hình thái hoa 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo nghiên cứu………………………… 70 3.3 3.4 3.5 Thống kê số băng ADN nhân lên mẫu giố ứuvới 20 mồi RAPD 94 3.6 Tổng hợp kết phân tích số liệu với 20 mồi RAPD 99 3.7 Độ dài trình tự ITS 32 mẫu giống hoa hoa lan Hoàng 111 Thảo 3.8 Độ dài trình tự vùng ITS mẫu giống D1 hai mẫu giống D. fimbriatum giới 3.9 3.10 Độ dài trình tự vùng ITS mẫu giống D2 D18 hai mẫu giống D. findlayanum giới . Độ dài trình tự vùng ITS mẫu giống D4 hai mẫu giống D. anosmumcủa giới . 3.11 113 115 116 Độ dài trình tự vùng ITS mẫu giống D10 hai mẫu giống D. hancockiicủa giới v 117 3.12 Độ dài trình tự vùng ITS mẫu giống D7, D8 hai mẫu giống D. chysanthumcủa giới . 3.13 Độ dài trình tự vùng ITS mẫu giống D9, D29 hai mẫu giống D. primulinum giới . 3.14 119 Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo nhận dạng dựa trình tự vùng ITS……………………………… . vi 120 133 DANH MỤC CÁC HÌNH TT hình 2.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 Tên hình Cấu trúc phân bố vùng mồi ITS1 ITS4……………… Các mẫu giống Hoa lan Hoàng Thảo trồng chăm sóc nhà vườn, 422 đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội……………………………………… . Hình dạng thân mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo… Hình dạng mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo… Một số kiểu hoa mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Hình dạng cánh môi mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Sơ đồ hình mối quan hệ di truyền 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo dựa thị hình thái Ảnh điện di ADN tổng số 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo………………………………………… . . 20 . Ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo với mồi OPN16 Ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo với mồi OPN11 . Ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo với mồi OPN9………………………… Sơ đồ hình mối quan hệ di truyền dựa thị phân tử RAPD . Các mẫu giống lan Hoàng Thảo D4 (Phi Điệp tím), D5 (Trầm tím), D6 (Trầm trắng) . Hoa mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo Kiều tím vii Số trang 44 52 59 67 68 69 87 92 95 96 97 97 98 102 104 3.16 3.17 3.18 3.19 3.20 3.21 3.22 3.23 3.24 3.25 (D12), Kiều vàng (D13)và Kiều trắng (D14) Hai mẫu giống hoa hoa lan Hoàng Thảo D24 (HT Vảy rồng nhỏ), D25 (HT Vảy rồng trung) . Ảnh điện di đoạn ITS 32 mẫu giống hoa hoa lan Hoàng Thảo khuếch đại PCR với cặp mồi ITS1 ITS4 Kết phân tích cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS mẫu giống D1 hai mẫu giống D. fimbriatum |JN388588.1| |HQ114229.1| Kết phân tích cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS mẫu giống D2, D18 hai mẫu giống D. findlayanum |KF143462.1|,|HQ114257.1| Kết phân tích cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS mẫu giống D4 với hai mẫu giống D. anosmum |EU477499.1 . Kết phân tích cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS mẫu giống D10 với hai mẫu giống D. hancockii |AB593575.1| |HQ114259.1| Kết phân tích cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS mẫu giống D7, D8 với hai mẫu giống D.chysanthum |JN388584.1|, |FJ384738.1| Kết phân tích cột thẳng hàng (alignments) trình tự vùng ITS mẫu giống D9, D29 với hai mẫu giống D. primulinum |AB593521.1|,|AB593641.1| So sánh trình tự mẫu giống D25 (HT Vảy rồng trung) ngân hàng gen Blast Sơ đồ phát sinh loài dựa trình tự vùng ITS . viii 105 106 110 114 115 117 118 120 121 123 125 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SẮP CỘT THẲNG HÀNG (ALIGNMENTS) TRÌNH TỰ VÙNG ITS CỦA 32 MẪU LAN HOÀNG THẢO [...]... qủa nguồn gen phục vụ thương mại hóa và phát triển cho đất nước chúng tôi cơ sở , nh đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng một số nguồn gen lan Hoàng Thảo (Dendrobium) bản địa của Việt Nam 2 Mục tiêu của luận án - Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ di truyền của các giống/loài hoa lan Hoàng Thảo bản. .. định chỉ thị nhận dạng ở thực vật 12 1.3.1 Khái niệm về đa dạng di truyền 12 1.3.2 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền .13 1.3.3 Các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng ở thực vật 13 1.4 Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam 23 1.4.1 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng hoa lan. .. nghiên cứu hoa lan ở Việt Nam .34 CHƢƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Vật liệu nghiên cứu 39 2.2 Nội dung nghiên cứu 39 ix 2.2.1 Nội dung 1: Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa Việt Nam 39 2.2.2 Nội dung 2: Giải trình tự vùng ITS của gen ribosom nhân để nhận dạng chính xác một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa. .. góp phần thu thập và lưu giữ các nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa của Việt Nam; - góp phần bảo tồn và sử dụng hợp lí nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo quý hiếm của Việt Nam bảo tồn, Phong l 4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1 Đối tƣợng nghiên cứu - Là các mẫu giống giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa được phân bố ở các vùng miền Việt Nam 4.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Thí nghiệm được... Kết và cs , 2005; Trần Duy Quý, 2005) 1.3 Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng ở thực vật 1.3.1 Khái niệm về đa dạng di truyền Đa dạng di truyền là tất cả các gen di truyền khác nhau của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa các loài khác nhau 12 Đa dạng di truyền là sự đa dạng. .. tồn, chọn và lai tạo giống mới (Lau và cs., 2001; Qian và cs., 2008; Yao và cs., 2009; Wang và cs., 2009; Singh và cs., 2012) 1.4.1 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng hoa lan trên thế giới 1.4.1.1 Nghiên cứu dựa vào chỉ thị hình thái Các nghiên cứu về hình thái học tập trung vào các nghiên cứu về thân, lá, hoa, rễ… các loài thuộc họ phong lan Các đối tượng nghiên cứu được... Kĩ thuật Di truyền, thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp- Phạm Văn Đồng -Từ Liêm, Hà Nội - Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2010 đến năm 2014 5 Những đóng góp của luận án Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách bài bản có hệ thống 3 về đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử, nhận dạng các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa quý hiếm của Việt Nam dựa vào trình... Lindl), Hoàng Thảo caryaecolum Guill), Hoàng Thảo (D (D cathcartii Hook.f) : Hoàng Thảo (D.acinaciforme Roxb) : Hoàng Thảo Thảo m (D lindleyi), Hoàng (D anseps), Hoàng Thảo (D capillpes), Hoàng Thảo (D chrysanthum), Hoàng Thảo (D moschatum), Hoàng Thảo (D nobile), Hoàng Thảo Thảo (D anosmum), Hoàng (D tortile), Hoàng Thảo Hoàng Thảo (D thyrsiflorum), (D farmeri), Hoàng Thảo amabile), Hoàng Thảo (D... QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .49 49 3.1.1 Kết quả đánh giá đa dạng si truyền bằng chỉ thị hình thái .52 3.1.2 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền ở mức phân tử 91 3.1.3 Kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di truyền các giống hoa lan Hoàng Thảo 107 3.2 Kết quả nhận dạng các mẫu giống hoa lan Hoàng thảo dựa vào trình tự vùng ITS 109 3.2.1 Kết quả khuếch... Thảo bản địa phục vụ cho công tác phân loại, chọn và lai tạo giống mới - Sử dụng chỉ thị ITS để để nhận dạng một số nguồn gen lan Hoàng Thảo bản địa quý của Việt Nam phục vụ cho công tác bảo tồn, làm cơ sở dữ liệu cho xây dựng ADN mã vạch 2 3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học - Cung cấp dữ liệu khoa học về đa dạng di truyền ở mức hình thái và mức phân tử của các mẫu . DUY DƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM)BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành : Di truyền và Chọn giống. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY DƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG. qủa nguồn gen phục vụ thương mại hóa và phát triển cho đất nước. cơ sở , chúng tôi nh đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng một số nguồn gen lan Hoàng