Sự khác biệt protein microsome ở bệnh nhân ung thư gan

SỰ KHÁC BIỆT PROTEIN MICROSOME Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN Mai Thị Hồng 1 Trịnh Hồng Thái 2 Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) là bệnh ác tính phổ biến nhất trên thế giới và ước tính gây ra khoảng một nửa triệu người chết hàng năm. Do tỷ lệ tử vong cao, việc chẩn đoán sớm ung thư gan gặp rất nhiều khó khăn do: (1)ung thư gan khó phát hiện chỉ khi khối u đã lớn hoặc di căn, (2)trong phép chẩn đoán kiểm tra huyết thanh thì alpha fetoprotein (AFP) có độ nhạy không cao đặc biệt với các khối u kích thước nhỏ, và (3) là kiểm tra với AFP rất dễ nhầm khi bệnh nhân nhiễm virus viêm gan C trong khi không hề bị ung thư gan. Công nghệ cao proteomic với mục tiêu duy nhất có thể cung cấp đầy đủ về sinh học phân tử mới trong phát triển bệnh và tiên lượng HCC. Kết hợp giữa khối phổ (MS), 2-DE có thể là một phương pháp tốt để phân tách và sau đó xác định các protein quan tâm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân tích proteomic trong các bệnh nhân HCC. Kết quả của protein microsome cho thấy đã có 27 spot của protein có biểu hiện khác giữa khối u và mô gan bình thường, trong đó 23 protein đã được nhận dạng có 16 protein và 7 protein giả thuyết. Các protein được xác định bao gồm: các protein tham gia cấu trúc tế bào, phản ứng miễn dịch và bảo vệ cơ thể, chu trình tế bào, và phiên mã, dịch mã, sau phiên mã. Đặc biệt, một số protein ti thể đáng chú ý là: HSP70, MVP, Zinc finger và Beta-actin 1. Đặt vấn đề Ung thư gan (HCC) là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến nhất trên thế giới. Bệnh này khó chẩn đoán, tiên lượng rất xấu, tỷ lệ tử vong cao và tử vong trong thời gian ngắn kể từ khi phát hiện. Trong năm 2008 ước tính có 12 triệu trường hợp được chẩn đoán mắc ung thư, 7 triệu người chết và khoảng 25 triệu người đang sống chung với ung thư trên thế giới. Tại hoa kì, năm 2009 ước tính có 22.620 trường hợp được chuẩn đoán mắc ung thư, 18.160 người chết [8]. Nguyên nhân chính là do virut viêm gan B và C, vì thế hiệu quả điều trị viêm gan B, C chủ yếu là ngăn ngừa ung thư gan. Nhìn chung sự sống còn của bệnh nhân ung thư gan rất là thấp với tỉ lệ 1 năm và 3 năm lần lượt là 36% và 17%. Do đó việc phát hiện sớm ung thư gan có vai trò quan trọng trong việc điều trị và giảm tỉ lệ tử vong do loại ung thư này [1]. Hiện nay, chỉ có một vài chỉ thị sinh học đối với HCC sử dụng cho lâm sàng: alphafetoprotein (AFP), des-γ-cacboxy prothrombin bất thường, các phần L3 (AFP-L3), isozyme của photphatase với HCC (biến thể ALP), và isozyme của γ-glutamyl transpeptidase 1 ThS, Trường ĐHSP Hà Nội 2 2 Trường Đại học KHTN, ĐHQG Hà Nội với HCC (γ-GTP) [3]. Tuy vậy, AFP trong máu không đặc trưng cho ung thư gan vì có thể nó cũng tăng ở những người bị viêm gan. Hơn nữa, độ nhạy của phương pháp AFP cũng không cao, có khoảng 20% bệnh nhân bị ung thư gan mà hàm lượng AFP trong máu vẫn bình thường (đặc biệt ở những bệnh nhân có khối u nhỏ hơn 3cm) [1]. Các nghiên cứu gần đây đã xác định rằng, chuyển đổi yếu tố tăng trưởng (TGF)-β1, HS-GGT, và yếu tố tăng trưởng giống insulin tự do (IGF)-II có thể là dấu hiệu cụ thể hơn so với mức tổng AFP cho chẩn đoán ban đầu của HCC . Tuy nhiên, vẫn còn có một nhu cầu cấp thiết để tìm chỉ thị phân tử để chẩn đoán HCC. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2-DE (điện di 2 chiều) và MALDI-TOF MS để xác định chênh lệch thể hiện cấu hình protein trong mô gan HCC trong nước để cung cấp một cơ sở trong việc tìm kiếm các điểm đánh dấu khả năng chẩn đoán HCC. 2. Nội dung 2.1. Đối tượng và phương pháp Đối tượng Mẫu nghiên cứu là mô gan tại vị trí khối u của bệnh nhân ung thư tế bào gan. Mẫu đối chứng là mô gan lành cách 5cm trên lá gan đó tại vị trí không có khối u. Mô gan sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa giải phẫu bệnh, Bệnh viện Việt Đức cung cấp. Mẫu mô được cho vào ống eppendorf vận chuyển về trong nitơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu 80 0 C Phương pháp Chuẩn bị mẫu cho 2DE: 0,3g mẫu gan được cắt nhỏ bằng kéo, sau đó được nghiền bằng chày sứ cho đến khi nhuyễn thì cho 1,5ml đệm phosphate 0,05M, pH7,4.Dịch này được ly tâm 1000g trong 10 phút ở 40C thu dịch nổi. Dịch nổi được đem ly tâm 14.000g trong 15 phút ở 4 0 C thu lấy cặn. Cặn này chứa chủ yếu là các bào quan ty thể. Sau đó cặn này được hòa tan bằng 150µl đệm Rehydration có chứa 7M Ure, 2M Thioure, 30mM Tris, 4% CHAPS, và 65mM DTT. Phần dịch nổi còn lại được đem đi siêu ly tâm 105.000g trong 70 phút ở 4 0 C thu lấy phần cặn. Trong cặn này chứa phần lớn là microsome, cặn này cũng được hòa tan bằng 150µl đệm Rehydration có chứa 7M Ure, 2M Thioure, 30mM Tris, 4% CHAPS, và 65Mm DTT. Cả hai mẫu trên sau khi hòa tan trong đệm được điện di biến tính một chiều để kiểm tra protein trước khi tiến hành 2DE. Điện di 2D: Sử dụng sợi gel IPG strip pH 4-7 dài 17cm (Biorad – Mỹ) thiết bị điện di đẳng điện Protean IEF cell (Biorad – Mỹ) với tổng Vhr là 40.000. Tiếp theo bước điện di đẳng điện là bước điện di chiều hai được tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS (SDS-PAGE). Hiển thị kết quả bằng nhuộm Coomassie G-250 qua đêm theo phương pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988). Phân tích hình ảnh điện di 2D: Bản gel điện di hai chiều được quét vào máy tính có phần mềm phân tích chuyên dụng Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản ). Sau đó hình ảnh bản gel được phân tích bằng phần mềm này. Trước tiên, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản gel và đánh số thứ tự cho các spot. Dựa vào cường độ khối trung bình của mỗi spot trên bản gel, vị trí và thể tích của spot được xác định và có thể chỉ ra điểm khác biệt giữa bản gel mẫu bệnh so với bản gel mẫu đối chứng.Dựa vào kết quả này, chúng tôi xác định được các spot protein cần để phân tích tiếp theo. Cắt và thủy phân spot: Các spot protein được quan tâm trên bản gel điện di hai chiều được cắt ra khỏi bản gel, tẩy màu và thủy phân thành các peptide để chuẩn bị cho phân tích khối phổ. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein: Mẫu peptide được phân tích đồng thời với các mẫu chuẩn là hỗn hợp hai peptide Angiotensin II (Mw 1046.54 Da) và Insulin oxidized B (Mw 3494.65 Da).Tiến hành phân tích khối phổ MALDI-TOF để xác định khối lượng các peptide của mỗi protein. Protein được nhận dạng bằng phương pháp PMF (Peptide Mass Fingerprint) sử dụng phần mềm Mascot. 2.2. Kết quả và bàn luận Protein trong dịch chiết micrốme mô gan bình thường và mô gan ung thư của bệnh nhân ung thư gan cùng được phân tách bằng điện di 2D. Kết quả điện di cho thấy các protein đã được phân tách thành từng điểm (spot), hiện lên rõ ràng, riêng rẽ và phân bố trải khắp bản gel (Hình 1 và 2). Những điểm protein khác biệt, kể cả những protein biểu hiện tăng hay giảm trong mô gan ung thư đều là những đặc trưng về bệnh và có thể là những protein chỉ thị ung thư. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nhận dạng được 23 spot protein tương ứng với 16 protein đã được định danh và 7 protein giả thiết ở bản gel protein microsome. Các protein đã được định danh được mô tả sơ lược trong bảng 1. Hình 1. Điện di hai chiều mẫu protein microsome tách từ mô gan A : mẫu mô bình thường; B : mẫu mô ung thư. Chiều 1: sợi IPG strip pH 4-7 dài 17cm; Chiều 2: gel polyacrylamide 10% có SDS (SDS-PAGE) Hình 2. Hình ảnh một số spot protein microsome biểu hiện khác biệt giữa hai bản gel điện di 2-D A : bản gel mô đối chứng; B : bản gel mô ung thư Bảng 1. Danh sách các protein được xác định bằng phân tích khối phổ từ bản gel microsome tách từ mô gan ung thư so sánh với mô gan bình thường Spot Yếu tố nhận dạng NCBI Tên protein KLPT (Dalton) pI % phù hợp Score Biểu hiện S7 MVP Major vault protein (MVP) 99.135 5.34 18 74 + S9 CABO26 83 TCR BETA PRECURSOR 16.787 5.78 54 73 + S17 NUMA1 Nuclear mitotic apparatus protein 1 239.217 5.63 12 72 + S18 Gi 11960792 8 mitochondrial ribosome 20.810 6.7 54 90 + S31 ZN806 Zinc finger protein 806 69.447 6.87 21 67 ↑ S33 LACTB Serine beta- lactamase-like protein LACTB,mitochondr ial 61.119 8.71 20 65 + S40 AAF6603 3 Immunoglobulin heavy chain variable region 9.223 9.26 50 84 ↑ S49 AJHUQ glutamate-ammonia ligase 42.128 6.61 17 70 + S54 Q53HF2 Heat shock 70kDa protein 8 isoform 2 variant 53.466 5.62 25 88 ↑ + 93 94 95 96 105 106 107 S56 MYT1L Myelin transcription factor 1-like protein 133.016 4.87 15 107 ↑ S104 gi559597 38 nasal embryonic LHRH factor 16.372 5.59 26 60 + S116 O78181 Minor histocompatibility antigen HA-1 2.711 5.59 95 65 + S117 TDRD72 Tudor domain- containing protein 7 125.072 6.84 12 71 + S130 ATCHB Beta-actin 42.058 5.29 36 85 ↑ S170 TXIP1 Translin-associated factor X-interacting protein 1 77.015 4.99 16 72 + S184 PSD7 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7 37.061 6.29 21 68 + Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm; +, protein chỉ có ở mô ung thư. Dựa vào kết quả nhận dạng protein, chúng tôi thấy có nhiều loại protein biểu hiện khác nhau giữa mô gan bình thường và mô gan ung thư. Các protein đã được nhận dạng trong microsome bao gồm các protein tham gia vào các quá trình trao đổi chất, điều hòa phiên mã, miễn dịch và protein cấu trúc tế bào. Đặc biệt là các protein: HSP70, MVP, Zinc finger và Beta-actin đều có biểu hiện tăng ở mô ung thư. HSP70 là một protein sốc nhiệt, chúng xuất hiện hiện khi một tế bào phải trải qua những dạng stress của môi trường như nóng, lạnh hay thiếu oxy.Trong nghiên cứu về tác dụng của HSP trong vaccine phòng chống ung thư, Srivastava (2005) đã chỉ ra rằng: HSP luôn liên kết với một hoặc một số peptide khác trong hoạt động của mình và HSP chỉ có tác dụng chống lại ung thư khi chúng liên kết với các peptide. Tóm lại, các protein sốc nhiệt đã được khẳng định như là một chỉ thị ung thư và có thể trở thành yếu tố trong chế tạo vaccine phòng ngừa ung thư [9]. Hsp70 ức chế apoptosis bằng cách điều chỉnh sự thoái giảm protein và trình diện kháng nguyên. Hsp70 ức chế apoptosis theo cách can thiệp vào sự hình thành apoptosome bằng cách gắn vào Apaf, do đó ngăn cản sự hoạt hóa của caspase-9 và caspase- 3. Nó cũng ức chế apoptosis bằng cách tương tác trực tiếp với ASK-1 hoặc JNK. Hsp70 có thể hỗ trợ trong quá trình làm thoái giảm protein đã bị ubiquin bằng cách chuyển chúng cho proteasome. Hsp70 cũng liên kết với các peptide còn lại từ các protein bị thoái giảm và giúp trình diện peptide lên bề mặt tế bào với phức hệ lớp I (MHC I). Phức hợp peptide-Hsp70, cũng được trình diện lên bề mặt tế bào nhờ phức hệ lớp II (MHC II) [7]. Họ protein Zinc finger là những protein tham gia vào việc điều hòa phiên mã. Zinc finger protein gắn với ADN tại vị trí liên kết với các yếu tố phiên mã, các protein điều hòa, do đó protein này biểu hiện tăng sẽ ngăn cản hoạt động phiên mã trong tế bào ung thư [6]. Beta-actin là những protein tham gia cấu trúc tế bào, có tính bảo thủ cao, nó liên quan đến các dạng vận động tế bào khác nhau và biểu hiện ở tất cả các tế bào nhân chuẩn. Sự polymer hóa actin hình cầu (G-actin) dẫn tới hình thành một cấu trúc sợi (F-actin) trong cấu trúc xoắn kép. Mỗi actin có thể gắn với 4 phân tử khác. Thiếu hụt actin gây rối loạn vận động liên quan đến thần kinh từ đó dẫn đến rối loạn trương cơ thể hiện ở sự kéo dài co cơ trơn là nguyên nhân của tư thế cũng như vận động bất bình thường. Trong nghiên cứu của chúng tôi, beta-actin biểu hiện tăng rõ rệt trên bản gel mô ung thư, đây có thể là kết quả của việc tế bào gan ung thư tăng sinh nhanh chóng kéo theo các thành phần tham gia cấu tạo tế bào cũng tăng [5]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng nhận thấy có sự biểu hiện của Major vault protein trên mô ung thư. Major vault protein là một protein màng được mã hóa bởi gene MVP. Vaults là một cấu trúc gồm nhiều tiểu đơn vị, có vai trò tham gia kênh vận chuyển các chất giữa nhân và tế bào chất. Protein này gián tiếp tham gia kháng lại thuốc có thể thông các quá trình vận chuyển. Nó được phân bố rộng rãi trong các mô bình thường, và biểu hiện quá mức trong các tế bào ung thư đa kháng thuốc. Sự biểu hiện quá mức của protein này là một chỉ thị đầy tiềm năng trong việc khám và điều trị bệnh [2]. 3. Kết luận Phân tích protein microsome đã xác định được 27 spot protein biểu hiện khác biệt giữa 2 bản gel và đã nhận dạng được 23 protein, trong đó có 16 protein đã được định danh và 7 protein giả thiết. Các protein đã được nhận dạng trong microsome bao gồm các protein tham gia vào các quá trình trao đổi chất, điều hòa phiên mã, miễn dịch và protein cấu trúc tế bào. Đặc biệt là các protein: HSP70, MVP, Zinc finger và Beta-actin đều có biểu hiện tăng ở mô ung thư. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Deng-Fu Yao, Z.Z.D.A.M.Y., “Specific molecular marker in hepatocellular carcinoma”, Science, 6(3), PP. 241-247, 2007. 2. Mazzanti R., L. Gramantieri, and L. Bolondi, “Hepatocellular carcinoma: Epidemiology and clinical aspects”, Molec Asp Med, 29(1–2), PP. 130–143, 2008. 3. Rowan. S., Ludwig.R. L. , Haupt.Y. , Bates.S. , Lux.X. , Oren.M, “Specific loss of apoptotic but not cell cycle arrest function in human tumour derived p53 mutant”, EMBO J, 15, PP. 827-838, 1996. 4. Vũ Minh Thiết, Nguyễn Nam Long, Đặng Thành Nam, Ngiên cứu hệ proteomic huyết thanh người bằng kết nối sắc ký lỏng Nano đa chiều và hệ khối phổ liên tục, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc 2004, [16] NCCB định hướng Y-Dược học, Học viện Quân Y, H., tr. 470-474, 2004. 5. http://.cancer.org/docroot/CRI/CRI _2_1x.asp?dt=25Cancer.org2 6. http://www.uniprot.org/uniprot/?query 7. http://www.bioscience.org/2005/v10/af/1736/figure s.htm 8. http://www.medicinenet.com/script/main/art?articlekey=104954 9. http://en.wikipedia.org/wiki/Heat_shock_protein#Cancer_vaccine _adjuvant DIFFERENTIALLY EXPRESSIONED PROTEINS OF MICROSOME FROM LIVER TISSUE OF HUMAN HEPATOCELLULAR CARCINOMA Mai Thi Hong, Trinh Hong Thai Abstract Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common malignancy in the world and is estimated to cause approximately half a million deaths annually. Because of its high fatality rates, the incidence and mortality rates are almost equal. Early diagnosis of HCC is difficult, in part because (i) HCCs are typically asymptomatic until the tumor is large or infiltrating, (ii) the standard serum screening test, alpha fetoprotein (AFP) has poor sensitivity for the detection of small tumors, and (iii) the AFP is often elevated in patients with chronic hepatitis C virus infection in the absence of HCC. High-throughput, proteomic techniques targeting unique biological molecules may provide novel insights into HCC pathogenesis and prognosis. The traditional technique used to discover new cancer-associated proteins is the two dimensional gel electrophoresis (2-DE). In combination with mass spectrometry (MS), 2- DE can be a powerful method for separation and subsequent identification of proteins of interest. In the present study, we analyzed the proteomic profiles in HCC patients. The results of microsome proteins showed that there were 27 spots of protein that differentially expressed between the tumor and normal liver tissues, in which 23 spots have been identified 16 proteins and seven hypothetical proteins. The proteins were identified including: Proteins involving in cell structure, immune response and body protection, cell cycle and transcription, translation, post-transcription. Especially, some notable mitochondrial proteins were: HSP70, MVP, Zinc finger và Beta-actin. . SỰ KHÁC BIỆT PROTEIN MICROSOME Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN Mai Thị Hồng 1 Trịnh Hồng Thái 2 Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) là bệnh ác tính phổ biến nhất trên. chết [8]. Nguyên nhân chính là do virut viêm gan B và C, vì thế hiệu quả điều trị viêm gan B, C chủ yếu là ngăn ngừa ung thư gan. Nhìn chung sự sống còn của bệnh nhân ung thư gan rất là thấp. và 2). Những điểm protein khác biệt, kể cả những protein biểu hiện tăng hay giảm trong mô gan ung thư đều là những đặc trưng về bệnh và có thể là những protein chỉ thị ung thư. Trong nghiên