Nghiên cứu thành phần flavonoit glycosit của cây ba bét lùn (mallotus nanus)

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOIT GLYCOSIT CỦA CÂY BA BÉT LÙN (MALLOTUS NANUS) Nguyễn Thị Mai 1 Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Nguyễn Hữu Khôi, Nguyễn Xuân Cƣờng, Nguyễn Hải Đăng, Nguyễn Phƣơng Thảo, Nguyễn Hoài Nam 2 Lã Đình Mỡi, Ninh Khắc Bản 3 Nguyễn Nghĩa Thìn 4 I. MỞ ĐẦU Chi ba bét (Mallotus) là một chi khá lớn, gồm khoảng 150 loài, phân bố tại các khu vực từ Ấn Độ, Sri Lanka đến Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam và khắp vùng Malesian. Về phía Nam, chúng phân bố tới miền Đông Fiji, miền Bắc và Đông Australia. Lên phía Bắc, có thể bắt gặp khá nhiều loài phân bố tại Trung Quốc, Triều Tiên và Nhật Bản. Rất nhiều loài Mallotus đã được sử dụng làm thuốc để chữa nhiều loại bệnh khác nhau như: bục núi cao M. japonicus được sử dụng trong y học dân tộc Trung Quốc để chữa bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng và điều hòa các chức phận của bộ máy tiêu hóa nói chung; ở nước ta loài bai bái M. contubernalis làm thuốc chữa các bệnh thấp khớp, u phong, mụn nhọt, ngứa; loài bục trườn M. repandus được sử dụng tại Thái Lan để chữa bệnh viêm dạ dày, viêm đau gan, viêm đau khớp và chữa rắn độc cắn [1,2]. Cây ba bét lùn (Mallotus nanus) là cây bụi hay gỗ nhỏ, cao 3-7 m; lá hình trái xoan rộng, hình khiên, hay hình trứng bầu; đầu có mũi nhọn hoặc thuôn nhọn; 7 gân chính dạng chân vịt, không lông. Cụm hoa cái dài 10-12 cm, hoa có 4-5 lá đài; bầu có gai nạc và lông hình sao. Quả nang, nhỏ, vỏ quả có mụn tròn và rải rác có lông. Cây ưa sáng, mọc trong rừng thường xanh, trên đất sa phiến thạch, ở độ cao 100-500 m. Ở nước ta, loài này phân bố chủ yếu ở Kon tum, Gia Lai, Dắk Lắk [2,3]. Hiện nay, chưa có công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài này được công bố ở trong nước cũng như trên thế giới. Trong công trình này, chúng tôi công bố sự phân lập và xác định của 5 hợp chất flavonoit glycosit, rhoifolin (1), juglanin (2), kaempferin (3), quercitrin (4) và myricitrin (5), từ lá loài M. nanus. II. THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Mẫu thực vật Mẫu lá cây ba bét lùn Mallotus nanus Airy - Shaw (Euphorbiaceae) được thu hái tại Kontum, Việt Nam vào tháng 5 năm 2006. Tên khoa học được GS Nguyễn Nghĩa Thìn, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội giám định. Mẫu tiêu bản số MA23 được lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2. Phân lập các chất 1 Đại học Giao thông vận tải Hà Nội 2 Viện Hóa học các HCTN, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 3 Viện Sinh thá i và Tà i nguyên sinh vậ t, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 4 Đạ i họ c KHTN, Đại học Quc gia Hà Nội Lá cây M. nanus (1,8 kg) được chiết ba lần với MeOH bằng máy siêu âm Ultrasonic 2010 ở nhiệt độ 40-50 o C (3  60 phút). Dịch chiết sau đó được cô đặc bằng máy cất quay với áp suất giảm thu được 150 g cặn chiết MeOH. Cặn này được hòa vào nước và phân lớp lần lượt với hexan và EtOAc thu được các dịch cô hexan (35 g) và EtOAc (65 g). Phần dịch nước sau chiết được sắc ký qua cột DIANION sử dụng hệ dung môi gradient MeOH-H 2 O (từ 0:100 đến 100:0) thu được các dịch cô ký hiệu là W1 (15g), W2 (19 g) và W3 (11 g). Cặn chiết EtOAc được tiến hành phân tách trên sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi gradient CHCl 3 -MeOH (từ 10:1 đến 1:1) thu được các phân đoạn E1 (26,5 g), E2 (13,4 g) và E3 (24,0 g). Phân đoạn E1 được sắc ký trên cột pha đảo YMC RP-18 sử dụng hệ dung môi MeOH-H 2 O 4:1 thu được hợp chất 2 (20,5 mg) dưới dạng bột màu vàng. Phân đoạn E2 được chạy qua cột sắc ký YMC RP-18 hệ dung môi rửa giải MeOH-H 2 O (5:2) thu được các hợp chất 3 (15 mg) và 4 (18 mg) dưới dạng bột vàng vô định hình. Phân đoạn E3 được tiến hành sắc ký trên cột silica gel hệ dung môi CHCl 3 -MeOH-H 2 O (3:1:0,1) tinh chế được các hợp chất 1 (9 mg) và 5 (20 mg). Hình 1. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 1-5 Rhoifolin (1): Bột màu vàng, mp. 245 o C, [] D -110 (c, 0.21, MeOH); 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d 6 ) xem Bảng 1. Juglanin (2): Bột màu vàng, mp. 235-237 o C, [] D +52 (H 2 O); 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD) xem Bảng 1. Kaempferin (3): Bột màu vàng, mp. 172-174 o C; 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD)  ppm : 6,20 (1H, br s, H-6), 6,38 (1H, br s, H-8), 7,76, (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2' và H-6'), 6,94 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3' và H- O OOH O OH O O O HO HO H 3 C HO HO OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1" 2" 3" 4" 5" 6" 1"' 2"' 3"' 4"' 5"'6"' HO O OOH HO OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' OR 1 R 3 R 2 1 2. R 1 =  -L-arabifuranoside, R 2 = R 3 = H 3. R 1 =  -L-rhamnopyranoside, R 2 = R 3 = H 4. R 1 =  -L-rhamnopyranoside, R 2 = OH, R 3 = H 5. R 1 =  -L-rhamnopyranoside, R 2 = R 3 = OH 5'), 5,39 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1''), 4,24 (1H, dd, J = 1,5, 3,0 Hz, H-2''), 3,73 (1H, dd, J = 3,0, 9,0 Hz, H- 3''), 3,35 (1H, m, H-4''), 3,33 (1H, m, H-5'') và 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-6''); 13 C-NMR (125MHz, CD 3 OD)  ppm :158,6 (C-2), 136,1 (C-3), 179,5 (C-4), 161,5 (C-5), 100,1 (C-6), 166,6 (C-7), 94,9 (C-8), 159,1 (C-9), 105,7 (C-10), 122,7 (C-1'), 131,9 (C-2' và C-6'), 116,5 (C-3' và C-5'), 163,1 (C-4'), 103,5 (C- 1''), 73,2 (C-2''), 72,1 (C-3''), 72,0 (C-4''), 71,9 (C-5'') và 17,6 (C-6''). Quercitrin (4): Bột màu vàng, mp. 182-185 o C, [] D -158 (c, 0.61 in MeOH); 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD)  ppm : 6,25 (1H, d, J = 2,0, H-6), 6,42 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,35, (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H- 2'), 6,96 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-3'), 7,39 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6'), 5,40 (1H, d, J = 1,5Hz, H-1''), 4,26 (1H, dd, J = 1,5, 3,0 Hz, H-2''), 3,78 (1H, dd, J = 3,0, 9,0 Hz, H-3''), 3,45 (1H, m, H-4''), 3,34 (1H, m, H-5'') và 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-6''). Myricitrin (5): Bột màu vàng, mp. 194-197 o C, [] D 138.6 (c, 0.5 in MeOH), UV ở max : 257, 354 (MeOH); 1 H-NMR (500MHz, CD 3 OD)  ppm : 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,33 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,97 (2H, br s, H-2' và H-6'), 5,33 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1''), 4,24 (1H, dd, J = 1,5, 3,0 Hz, H-2''), 3,73 (1H, dd, J = 3,0, 9,0 Hz, H-3''), 3,35 (1H, m, H-4''), 3,33 (1H, m, H-5'') và 0,94 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6''); 13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD)  ppm : 159,2 (C-2), 136,2 (C-3), 179,5 (C-4), 163,1 (C-5), 100,5 (C-6), 167,9 (C-7), 95,2 (C-8), 158,2 (C-9), 105,3 (C-10), 121,9 (C-1'), 109,6 (C-2' và C-6'), 146,9 (C-3' và C- 5'), 138,0 (C-4'), 103,6 (C-1''), 73,4 (C-2''), 72,1 (C-3''), 72,0 (C-4''), 71,9 (C-5'') và 17,7 (C-6''). 3. Hóa chất thiết bị Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H 2 SO 4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu. Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Được đo trên máy Bruker DRX500 của Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ khi lượng (ESI-MS): Được đo trên máy LC-MSD Agilent 1200 Series (USA) của Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng bột màu vàng. Vệt chất của 1 trên sắ c ký TLC khi phun thuốc thử H 2 SO 4 10% rồ i hơ nóng từ từ xuấ t hiệ n màu vàng c ho phép dự đoán đây là một hợp chất flavonoit. Công thức phân tử được xác định là C 27 H 30 O 14 bằng các số liệu phổ khối ESI-MS (m/z 579 [M+H] + , 601 [M+Na] + và 577 [M-H] - ) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Phổ 1 H-NMR của 1 xuất hiện cặp tín hiệu chập của bốn proton vòng thơm thế para tại  6,93 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 7,93 (2H, d, J = 8,5 Hz), hai tín hiệu của hai proton thuộc vòng thơm bị thế bốn vị trí tại  6,79 (d, J = 2,0 Hz) và 6,38 (d, J = 2,0 Hz), và một tín hiệu vạch đơn của một proton olefin tại  6,87. Các dữ kiện trên gợi ý cho sự có mặt của một hợp chất flavonoit có cấu trúc khung dạng apigenin. Ngoài ra, trên phổ này cũng quan sát thấy các tín hiệu proton của 2 gốc đường với các tín hiệu đặc trưng của hai proton anome tại  5,22 (1H, d, J = 7,5 Hz) và 5,14 (1H, d, J = 1,0 Hz). Giá trị hằng số tương tác của các proton anome gợi ý cho sự có mặt của hai liên kết đường cấu hình  và  . Ngoài ra, sự xuất hiện tín hiệu của một nhóm metyl bậc hai tại  1,20 (1H, d, J = 6,5 Hz) gợi ý cho sự có mặt của đơn vị đường rhamnose. Hình 2. Các tƣơng tác HMBC chí nh của hợp chất 1 Trên phổ 13 C-NMR và các phổ DEPT của 1 xuất hiện các tín hiệu của 27 cacbon, trong đó bốn nhóm metin của vòng thơm bị thế para tại  116,0 và 128,6, một nhóm keton tại  181,9 và ba nhóm metin còn lại tại  94,5, 99,3 và 103,1. Thêm vào đó, các tín hiệu cacbon của hai gốc đường tại  97,8 (C- 1''), 77,0 (C-2''), 76,3 (C-3''), 70,5 (C-4''), 77,2 (C-5''), and 60,5 (C-6'')/100,5 (C-1'''), 69,6 (C-2'''), 70,4 (C- 3'''), 71,8 (C-4'''), 68,3 (C-5'''), và 18,0 (C-6''') khẳng định lần lượt cho một gốc đường  -D-glucopyranose và một gốc đường  -L-rhamnose [4]. Để xác định vị trí liên kết của các nhóm đường trên khung 1, chúng tôi tiến hành đo phổ HSQC và HMBC. Tương tác quan sát được trên phổ HMBC giữa proton anome của đường glucose H-1'' ( H 5,22) và C-7 ( C 162,5), giữa proton anome của đường rhamnose H-3''' ( H 5,14) và C-2'' ( C 77,0) của đường glucose chứng tỏ gốc đường glucose liên kết với khung flavon của vị trí C-7 và gốc đường rhamnose gắn vào C-2'' của đường glucose. Ngoài ra, một số tương tác xa H -C khác cũng quan sát thấy trên phổ này và được thể hiện ở Hình 2. Từ tất cả các phân tích nêu trên, cùng với sự phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ 13 C-NMR của 1 với các số liệu đã được công bố (Bảng 1), cho phép xác định cấu trúc hóa học của 1 là apigenin 7-O-  -L-rhamnopyranosyl-(12)-  -D-glucopyranoside hay còn được gọi là rhoifolin [4], hợp chất này đã được phân lập từ loài Gnocaryum calleryanum, tuy nhiên, đây là lần đầu tiên nó được phân lập từ các loài thuộc chi Mallotus. Bảng 1. Số liệu phổ NMR của 1 và 2 C δ C # 1 2 δ C a,b δ H a,c dạng pic (J = Hz) δ C a,b δ H a,c dạng pic (J = Hz) HMBC (H  C) O OOH O OH O O O HO HO H 3 C HO HO OH HO Aglycon 2 164,2 164,3 - 159,4 - 3 103,1 103,1 6,87, s 134,9 - 4 181,8 181,9 - 179,9 - 5 161,1 161,1 - 163,1 - 6 99,6 99,3 6,38, d (2,0) 99,9 6,22, d (2,0) 5, 7, 8, 10 7 162,6 162,5 - 166,0 - 8 94,7 94,5 6,79, d (2,0) 94,8 6,41, d (2,0) 6, 7, 9, 10 9 157,9 157,0 - 158,5 - 10 105,6 105,4 - 105,7 - 1 121,1 120,9 - 122,8 - 2 128,5 128,6 7,93, d (8,5) 131,7 7,98, d (8,0) 2, 3, 4 3 115,9 116,0 6,93, d (8,5) 116,5 6,93, d (8,0) 2, 4 4 161,4 161,4 - 161,5 - 5 115,9 116,0 6,93, d (8,5) 116,5 6,93, d (8,0) 2, 4, 6 6 128,5 128,6 7,93, d (8,5) 131,7 7,98, d (8,0) 4, 5 7-Glc 3-Ara(f) 1 98,6 97,8 5,22, d (7,5) 109,6 5,51, d (1.0) 3, 3, 4 2 77,1 77,0 3,50* 83,3 4,34, dd (1,0, 3,0) 3, 4 3 77,0 76,3 3,51* 78,7 3,92, dd (3,0, 9,0) 2, 5 4 70,6 70,5 3,35* 88,0 3,83, dd (5,0, 9,0) 3 5 77,4 77,2 3,48* 62,5 3,50, m 3, 4 6 61,0 60,5 3,48*/3,71* 2-Rha 1 100,5 100,5 5,14, d (1,0) 2 70,2 69,6 3,20* 3 70,6 70,4 3,72* 4 72,3 71,8 3,21* 5 68,6 68,3 3,71* 6 18,1 18,0 1,20, d (6,5) a đo trong DMSO-d 6 , b 125 MHz, c 500 MHz,*tín hiệu bị chồng lấp, #  C của rhoifolin [4] Phổ 1 H-NMR của 2 xuất hiện các tín hiệu của hai proton của vòng thơm bị thế 4 vị trí tại  6,22 (d, J = 2,0 Hz) và 6,41 (d, J = 2,0 Hz). Ngoài ra, bốn proton của một vòng thơm tương tác hệ AA'BB' được khẳng định bởi các tín hiệu cộng hưởng tại  7,98 (2H, d, J = 8,0 Hz) và 6,93 (2H, d, J = 8,0 Hz). Các dữ kiện trên cho phép dự đoán 2 là một hợp chất flavonoit có cấu trúc khung dạng kaempferol. Sự xuất hiện của một đơn vị đường được xác định bởi các tín hiệu cộng hưởng tại  5,51 (1H, d, J =1,0 Hz), 4,34 (1H, dd, J =1,0, 3,0 Hz), 3,92 (1H, dd, J = 3,0, 9,0 Hz), 3,83 (1H, dd, J = 5,0, 9,0 Hz) và 3,50 (2H, m). Phổ 13 C-NMR và các phổ DEPT của 2 cũng xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho một hợp chất flavonoit khung kaempferol bị thế một gốc đường ở C-3 với sự có mặt của hai cacbon metin thuộc vòng thơm bị thế bốn vị trí tại  99,9 và 94,8, và bốn cacbon metin củ a vòng thơm bị thế para với sự xuất hiện của cặp pic chập tại  131,7 và 116,5. Ngoài ra trên phổ còn xuất hiện tín hiệu của một nhóm keton tại  179,9. Phân tích các tín hiệu trên phổ 13 C-NMR của 2 cho thấy phân tử đường gắn với khung kaempferol tại C-3 là một đường 5 cacbon. Ngoài ra, tương tác giữa proton anome của phân tử đường tại  H 5,51 với C-3 ( C 134,9) xác định vị trí liên kết của gốc đường tại cacbon này. Phân tích độ dịch chuyển hoá học và các tương tác trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân và so sánh với các tài liệu thu được, cấu trúc của gốc đường được xác định là arabinofuranoside [5]. Từ các phân tích nêu trên, cùng với kết quả phổ ESI-MS tại m/z 419 [M+H] + , 441 [M+Na] + và 417 [M-H] - tương ứng với công thức phân tử C 20 H 18 O 10 cho phép nhận dạng cấu trúc hóa học của 2 là kaempferol 3-O--L-arabinofuranoside, hay còn đuợc gọi là juglanin [5]. Các hợp chất còn lại được xác định lần lượt là kaempferin (3) [6], quercitrin (4) [7] và myricitrin (5) [7], bằng cách phân tích chi tiết các số liệu phổ NMR, MS và so sánh chúng với các số liệu tương ứng đã được công bố trong các tài liệu tham khảo. IV. KẾT LUẬN Bằng các phương pháp sắc ký cột kết hợp với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo, 5 hợp chất flavonoit glycosit là rhoifolin (1), juglanin (2), kaempferin (3), quercitrin (4) và myricitrin (5), đã được phân lập từ cặn chiết metanol của lá cây ba bét lùn Mallotus nanus. Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như: phổ khối lượng ESI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR: 1 H, 13 C-NMR và các phổ DEPT 90, DEPT 135) và hai chiều (2D-NMR: HSQC và HMBC). Các hợp chất 1 và 2 lần đầu tiên được phân lập từ loài ba bét lùn Mallotus nanus. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Lã Đình Mỡi, Trần Minh Hợi, Dương Đức Huyến., Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản, Tài nguyên thực vật Việt Nam - Những cây chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học, tập I, NXB Nông nghiệp, 2005, tr 47-57. 2 Nguyen Nghia Thin, Taxonomy of Euphorbiaceae in Vietnam. Vietnam National University Publishers, 2007, pp 179-202. 3 Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Danh lục các loài thực vật Việt Nam, tập II, NXB Nông nghiệp, 2003, tr 626-633. 4 Kaneko, T., Sakamoto, M., Ohtani, K., Ito, A., Kasai, R., Yamasaki, K., Padorina, W., Secoiridoid and flavonoid glycosides from Gonocaryum calleryanum, Phytochemistry, 1995, 39, 115-129. 5 Kim, H.J., Woo, E.R., Park, H., A novel lignan and flavonoids from Polygonum aviculare, J. Nat. Prod.,1994, 57, 581-586. 6 Kaouadji, M., Acylated and non-acylated kaempferol monoglycosides from Plantanus acerifolia Buds, Phytochemistry, 1990, 29, 2295-2297. 7 Xi-Ning, Z., Hideaki, O., Ide, T., Hirata, E., Takushi, A., Takeda, Y., Three flavonol glysosides from leaves of Myrsine segnuinii, Phytochemistry, 1997, 46, 943-946. FLAVONOID GLYCOSIDES FROM THE LEAVES OF MALLOTUS NANUS Nguyen Thi Mai, Chau Van Minh, Phan Van Kiem, Nguyen Huu Khoi, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hai Đang, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Hoai Nam, La Đinh Moi, Ninh Khac Ban, Nguyen Nghia Thin Abstract Chromatographic separations led to the isolation of five flavonoid glycosides, rhoifolin (1), juglanin (2), kaempferin (3), quercitrin (4), and myricitrin (5), from the leaves of Mallotus nanus. Their structures were elucidated by ESI-MS and NMR experiments. This is the first report of 1 and 2 from M. nanus. . NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN FLAVONOIT GLYCOSIT CỦA CÂY BA BÉT LÙN (MALLOTUS NANUS) Nguyễn Thị Mai 1 Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Nguyễn. chữa bệnh viêm dạ dày, viêm đau gan, viêm đau khớp và chữa rắn độc cắn [1,2]. Cây ba bét lùn (Mallotus nanus) là cây bụi hay gỗ nhỏ, cao 3-7 m; lá hình trái xoan rộng, hình khiên, hay hình trứng. đảo, 5 hợp chất flavonoit glycosit là rhoifolin (1), juglanin (2), kaempferin (3), quercitrin (4) và myricitrin (5), đã được phân lập từ cặn chiết metanol của lá cây ba bét lùn Mallotus nanus.