Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất rutin từ hoa hòe ( sophora japonica l fabaceae )

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG ĐÌNH HỢP NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CHIÊT XUẤT RUTIN TỪ HOA HOÈ {Sophora japónica L. - Pabaceaè) (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHOÁ 1997-2002) Người hướng dẫn : PGS. TS.TừM inh Koóng KS. Nguyễn Việt Hương Nơi thực hiện : BM. Công nghiệp Dược. Trung tâm GMP. Thời gian thực hiện: 2/2002- 5/2002 Hà Nội, 5/2002 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện công trình tốt nghiệp này, em đã nhận được sự giúp đỡ của nhiều thầy cồ giáo, đặc biệt là: Thầy giáo PGS TS.TừM ỉnh Koóng Cô giáo KS. Nguyễn Việt Hương những người đã trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành công trình này. Với lòng biết ơn chân thành, em xin cảm ofn các thầy cô Đồng thời, em xin cảm ơn bộ môn Công nghiệp dược, phòng thí nghiệm GMP đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành công trình này, cảm ơn các thầy cô, các bộ môn đã giúp đỡ em trong quá trình học tập và rèn luyện tại trường. Hà Nội 5/2002 s v Hoàng Đình Hợp MỤC LỤC. ĐẶT VẤN ĐỂ 1 Phần I: TỔNG QUAN 2 1. Nguồn nguyên liệu để chiết rutin 2 2. Cây hoè 3 2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố 3 2.2. Thành phần hoá học 3 2.3. ứ ig dụng 4 3. Rutin 5 3.1. Công thức hoá học và tính chất 5 3.2. Định tính, định lượng 6 3.3. Tác dụng dược lý 8 3.4. ứ ig dụng 8 4. Chiết xuất rutin 9 4.1 .Phương pháp chiết bằng nước 9 /Ị^/^ 4.2.Phương pháp chiết bằng cồn 10 Phần II: [th ự c n g h iệ m v à k ế t q u ả 12 1. Nguyên vật liệu 12 1.1 Ng jyên liệu 12 1.2 Dung môi hoá chất 12 1.3 Thiết bị dụng c ụ 12 2. Phương pháp thực nghiệm 13 2.1. Định lượng rutin trong hoa hoè 13 2.2. Phương pháp chiết bằng nước ở 100°c 13 2.3. Phương pháp chiết bằng nước ở 120°c 16 2.4. Phương pháp chiết bằng cồn 60° 17 2.5 . Phương pháp chiết bằng dung dịch kiềm loãng ^ 18 2.6. Phương pháp xử lý số liệu 19 3. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 19 3.1.Định lượng rutin trong hoa hoè 19 3.2 .Phương pháp chiết bằng nước ở 100°c 20 3.3 .Phương pháp chiết bằng nước ở 120°c 21 3.4.Phương pháp chiết bằng cồn 60° 22 3.5.Phương pháp chiết bằng dung dịch kiềm loãng 23 4. Bàn luận 27 Phần III: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 30 LKết luận 30 2.Đề xuất 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 CÁC CHỮVIẾT TẮT DC: Dịch chiết DD: Dung dịch DĐVN: Dược điển Việt Nam DĐ: Dược điển DL: Dịch lọc PP: Phương pháp PPCX: Phương pháp chiết xuất ĐẶT VÂN ĐỂ • Rutin là một chất có tác dụng làm giảm tính thấm của mao mạch, tăng sức bền của thành mạch, trong y học được ứng dụng để phòng và điều trị nhiều chứng bệnh liên quan đến tổn thương thành mạch như trĩ, chảy máu đáy mắt , các chứng bệnh có thể dẫn đến tai biến mạch máu như vữa xơ động mạch, rối loạn tuần hoàn, giòn mao mạch Đặc biệt, hiện nay tỉ lệ người có nguy cơ mắc và mắc các bệnh này ngày càng gia tăng. Ngoài ứng dụng trong y học rutin còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như bao màu, nhuộm thực phẩm— Do đó nhu cầu sử dụng rutin trên thế giới ngày càng tăng. ? ỡ'nước ta, hoa hoè là dược liệu có hàm lượng rutin cao hơn nhiều so với các dược liệu cho rutin khác như mạch ba góc, bạch đàn cho rutin kể cả hoè ở một số nước khác trên thế giới như hoè ở Hungary ( khoảng 12%). Mặt khác, điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng ở nước ta rất thuận lợi cho cây hoè phát triển, thu hái và chế biến dược liệu. Hoè là cây dễ trồng, giống nhân khá nhanh, kỹ thuật trồng đơn giản, đầu tư vốn không nhiều, 3 đến 4 năm đã có thể thu hoạch, thu hái đơn giản nên cây hoè mọc hoang và được trồng rất nhiều trên khắp cả nước. Đây là nguồn nguyên liệu lớn và vô cùng quý giá để chiết rutin mà thiên nhiên ưu đãi chúng ta. Để khai thác có hiệu quả nguồn nguyên liệu này cần nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất rutin từ hoa hoè như thế nào cho có hiệu quả kinh tế, tính khả thi và độ an toàn cao. Với mong muốn được góp một phần nhỏ vào việc nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất rutin, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất rutin từ hoa hoè- Sophora japónica L Fabaceae.” Phần I TỔNG QUAN 1. Nguồn nguyên liệu để chiết rutin Người ta đã tìm thấy rutin có ở 62 họ thực vật với khoảng 150 loài trong đó có 70 loài thuộc 28 họ thực vật chứa rutin dưới dạng vết[17]. ^' Trong cây rutin phân bố chủ yếu ờ một số bộ phận nhất định như ở hoa (Hoè), lá (Bạch đàn cho rutin , Mạch ba góc) Tuy rutin có ở khá nhiều cây nhưng chỉ có một số cây chứa rutin với hàm lượng cao có khả năng dùng làm nguyên liệu để chiết rutin là: - Ruta graveolens L. có khoảng 2%. - Fagopyrum esculentum Moench. có khoảng 4% - Fagopyrum tataricum L. có khoảng 6 % - Eucalyptus macrorrhyncha F.Muell. có khoảng 8 % - Sophora japónica L. có khoảng 18% Các nguồn nguyên liệu chính để sản xuất rutin trên thế giới hiện nay là: - Sophora japónica L,: Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Pháp. - Eucalyptus macrorrhyncha F.Muell: Anh, Mỹ, úc. - Fagopyrum esculentum Moench và Fagopynim tatarỉcum L : Pháp, Mỹ, Việt Nam. [16] 3> & nước ta, hoa hoè có hàm lượng rutin rất cao (25- 35%). So với một số dược liệu khác như fnạch ba^ócr(2- 3%), bạch đàn cho rutin (10%) thì hoa hoè có hàm lượng lớn hơn nhiều [8 ]. Mặt khác, cây hoè mọc hoang và được trồng khắp nơi ở nước ta. Vì vậy, nguồn nguyên liệu chính để chiết xuất rutin ở nước ta hiện nay là hoa hoè [16]. 2. Cây hoè: Sophora japónica L. , họ Đậu -Fabaceae 2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố. Hoè là loại cây gỗ, to, cao có thể tới 15m, thân thẳng có chỏm lá tròn. Cành cong queo. Lá kép lông chim lẻ, có 9-13 lá chét hình trứng, đỉnh nhọn, nguyên dài khoảng 3cm, rộng 1,5 - 2,5 cm. Cụm hoa hình chuỳ ở đầu cành, hoa dài 4- 8 mm rộng 2- 3mm, phần đài chiếm 2/3 toàn bộ chiều dài, đài hình chuông, tràng hình bướm màu trắng ngà phía dưới có cuống ngắn. Khi khô hoa trở nên vàng, vị hơi đắng. Quả loại đậu không mở, dày và thắt nhỏ lại ở giữa các hạt [4,8]. Phân bố nhiều ở vùng Đông Nam Á*: Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên. Vùng Trung Capea dơ, Bán đảo Crưm [16]. ở một số nước Châu Âu cây hoè được trồng làm cảnh [8 ]. ở nước ta, cây hoè được trồng và mọc hoang ở khắp nơi, đặc biệt được trồng nhiều ở Thái Bình, Nam Định, Hà Nam, Ninh Bình, Nghệ An [8 ]. Qua thực tế trồng trọt và thu hoạch sản phẩm, người ta thấy có hai loại cây hoè khác nhau là hoè tẻ và hoè nếp. Hoè tẻ là cây có ít cành, hoa thưa và nở không đều, cụm hoa ở ngọn cành và kẽ lá. Hoè nếp là cây nhiều cành, mang nhiều hoa và nở đều [6 ]. Hoè nếp cho năng suất nụ hoa cao gấp ba lần hoètẻ[16]. 2.2. Thành phần hoá học. Thành phần hoá học chủ yếu của cây hoè là các flavonoid, ngoài ra còn một số hợp chất khác: - Lá chứa 6 ,6 % flavonoid toàn phần trong đó có 4,7% là rutin. - Vỏ quả chứa 10,5% flavonoid toàn phần trong đó 4,3% là rutin, ngoài ra còn có sophoricosid, sophora biosid và một số flavonoid khác. Trong quả xanh có 8 flavonoid, ngoài rutin còn có kemppherol- 3- sophorosid , henistein. - Các bộ phận khác như gỗ, thân, hạt đều có những flavonoid khác nhau đã được phân lập và đã biết cấu trúc hoá học nhưng không có ý nghĩa thực t ế . - Hoa hoè có 14 Aavonoid được phát hiện [19], ngoài rutin còn có quercetin, betulin triterpenoid nhóm lupan, sophoradiol là dẫn chất của nhóm olean[8 ]. Tuỳ từng điều kiện cụ thể về khí hậu, thổ nhưỡng, trồng trọt, cách thu hái và thời gian thu hái mà hàm lượng rutin trong hoa là khác nhau. Thông thường thu hái vào lúc nụ hoè còn non thì hàm lượng rutin đạt cao nhất[5]. Nụ hoè ở nước ta chứa khoảng 25- 35% rutin [16]. DĐVN II quy định hàm lượng rutin đã được sấy khô trước 60°c trong 6giờ không được thấp hơn 2 0 %[2 ]. 2.3. ứng dụng, Người ta thường sử dụng nụ hoè và hoa hoè vói tên gọi hoè mễ và hoè hoa trong nhiều lĩnh vực : trong đời sống hàng ngày dùng hãm để uống, trong y học dùng làm thuốc , trong công nghiệp chiết xuất dùng để chiết xuất rutin DĐVN qui định dược liệu không chứa quá 10% hoa đã nở. Trong y học, ngoài sử dụng hoa hoè người iịa còn dùng các bộ phận khác của cây như quả với tên gọi hoè giác, nhưng ít hơn Theo quan điểm của y học cổ truyền, vị hoè hoa thuộc nhóm chỉ huyết. - Tính vị: vị đắng, tính bình. - Quy kinh: can và đại tràng. - Công năng - chủ trị: + Lương huyết chỉ huyết: dùng trong trường hợp huyết nhiệt gây chảy máu như chảy máu cam, lỵ, trĩ, băng kinh, băng huyết, đại tiện ra máu + Thanh nhiệt bình can: dùng trong trường hợp can hoả thượng viêm gây đau mắt đỏ, đau đầu + Thanh phế chống viêm: dùng trong bệnh viêm thanh đới nói không ra tiếng + Hạ huyết áp: dùng hoè sao vàng trong bệnh cao huyết áp, trị co thắt động mạch vành 3. Rutin. Rutin là một flavonoid thuộc nhóm flavon được phân lập đầu tiên vào năm 1842 từ cây Cửu lý hương {Ruta graveolen) bởi Veyss [8 ]. Đến năm 1904 Schnidt mới xác định rõ công thức hoá học của rutin [7]. Đến năm 1962, rutin đã được tổng hợp toàn phần [24]. 3.1. Công thức hoá học và tính chất. Rutin (3,3',4',5,7 pentahydroxy flavone -3-Rutinosid) [8 ]. __ .0 H C12H21O9 OH ô Khi thuỷ phân tạo thành quercetin, glucose và rhamnose Quercetin (3,3',4',5,7 pentahydroxy flavone) [8]. OH OH OH Ô - Rutin là bột kết tinh màu vàng hay hơi vàng ánh xanh, không mùi. Để ngoài ánh sáng có thể có màu hơi sẫm lại. Tinh thể ngậm 3 phân tử nước [...]... tliứ i (Li =l- 5) Hình 1: Biểu đồ so sánh tỷ l giữa l ợng rutin thô của mỗi l n chiết với tổng l ợng rutin chiết được ở đây: LI - l n chiết thứ nhất, L2 - l n chiết thứ hai L3 - l n chiết thứ ba, L4 - l n chiết thứ bốn L5 - l n chiết thứ năm Nhận x é t: Từ kết quả trên chúng tôi thấy chiết theo phương pháp này l ợng rutin thu được từ l n chiết khoảng 6 %, 1 và 2 đạt khoảng 90%, rutin thu được từ l n... l ợng rutin thô của mỗi l n chiết so với tổng khối l ợng rutin thô/ STT L n 1(% ) L n 2(% ) L n 3(% ) L n 4(% ) L n 5(% ) 1 56,64 34,12 5,59 3,09 0,75 2 59,92 31,84 5,13 2,51 0,62 3 53,99 35,37 6,63 2,91 1,34 4 56,84 34,93 4,95 2,3 1,09 5 56,41 33,00 6,24 2,87 0,64 TB 56,76 ±2,62 33,85 ±1,78 5,71 ±0,89 2,75 ±0,37 0,88 + 0,39 Kết quả ở bảng 11 được biểu diễn bằng biểu đồ dưới đây Sì' l LI L2 L3 LA L5 L u cliiết... sau a Xử l nsuyên liêu: thực hiện như 2.2.2.a» b Chiết xuất: thực hiện như 2.5.2.b nhưng dịch chiết của mỗi l n được kết tinh riêng Tỷ l khối l ợng rutin thô của mỗi l n chiết so với tổng khối l ợng rutin thô được tính theo công thức : rri: i= l -i : l n chiết thứ i (i = 1^ 5) - rrii: khối l ợng rutin thô của dịch chiết l n thứi 5 - ^ m j : Tổng khối l ợng rutin thô thu được từ 5 l n chiết i =l Thí nghiệm... được từ l n chiết 3 đạt l n chiết 4 đạt khoảng 3%, l n chiết 5 khoảng 1% tổng khối l ợng rutin chiết được Vậy theo chúng tôi nếu chiết bằng phương pháp này thì nên chiết 3 l n Trong đó chỉ đem xử l l y rutin ở dịch chiết 1 và 2, dịch chiết 3 l m dung môi để chiết l n 1 và 2 của mẻ khác 4 Bàn luận: Qua các thí nghiệm chiết xuất rutin từ hoa hoè bằng 4 phương pháp: - Chiết bằng nước ở 100”C - Chiết bằng... Định l ợng rutin trong hoa hoè: thực hiện như mục 2 1 , thí nghiệm được l m 3 l n , kết quả được ghi ở bảng 1 Bảng 1: Hàm l ợng rutin trong hoa hoè STT n iD L ( g ) mtủa (g) Hàm l ợng rutin (% ) 1 2 0,2892 29,19 2 2 0,3125 31,54 3 2 0,3086 31,15 TB 2 0,3034 30,63 Kêt quả : hàm l ợng rutin trong hoa hoè khoảng 30,63%, vậy dược liệu đạt tiêu chuẩn DĐVNI tập I (yêu cầu > 20 %) 3.2 Phương pháp chiết xuất rutin. .. DD FeCl35 % cho màu xanh l c [8 ] - Sắc ký: thường dùng 2 loại sắc ký l p mỏng và sắc ký giấy [26] + Sắc ký l p mỏng: Bản mỏng: Chất hấp thụ sillicagel G Dung môi thường dùng: Benzen- AtOAc (3 : 1) CHCI3- M eOH(15 :l) Benzen- Aceton (9 : 1) Toluen- Aceton (1 9: 1) CHCI3- CH3COOH (9 : 1) MeOH 80% (VA ^) + Sắc ký giấy Giấy sắc ký: What man số 1, số 3 Dung môi thường dùng: TB A: n- BuOH- CH3COOH- H2O (3 :1: 1) BAW:... l nsuyên liêu: thực hiện như 2.2.2 ab Chiết xuất' , nguyên liệu sau khi được xử l , cho vào bình chiết nguội thêm vào lOOOml DD Na2CƠ3 1% Ngâm trong 8 giờ, thỉnh thoảng khuấy mạnh, sau đó rút l y dịch chiết L m như thế 4 l n (l n thứ 4 l y khoảng lOOml dịch chiết đem acid hóa đến pH = 2,5- 3 thì thấy tủa còn rất ít) Gộp dịch chiết l i, đem acid hoá bằng DD acid HCl 10% đến pH = 2,5- 3 Để rutin kết... CH3COOH- H2O (4 :1: 5) Forestal: CH COOH- HCl- H2O (3 0:3:1 0) 3 Benzen- CH COOH- HjO (1 25:72: 3) 3 CH3CI3- CH3COOH- H2O (1 3:6: 1) Phenol-H 2O (3 : 1) Hiện màu bằng đèn tử ngoại (UV) ở bước sóng 366nm hoặc bằng hơi amoniac soi đèn tử ngoại (UV) 3.2.2 Định l ợng: Để xác định hàm l ợng trong chế phẩm hoặc trong dược liệu người ta có thể dùng các phương pháp sau: - Phương pháp cân: [2] + Nguyên tắc: chiết xuất rutin. .. liêu đã đươc xử Cồn 60 l Bã dược liệu ^ L c 1r Dịch chiết Cồn thu hồi ^ Cất thu hồi cồn Đ ẽ kết tinh L c H2O, 100"C Tạp không tan trong nước ^ l c Đ ể kết tinh L c Sấy khô 2.4.2 Cách tiến hành: a ỵử l nsuyên liêu: l y nguyên liệu, xay thô b Chiết xuất Cân lOOg nguyên liệu đã qua xử l , cho vào bình chiết, thêm 600ml cồn 60°, đun sôi cách thuỷ có sinh hàn hồi l u trong 20 phút rồi l y dịch chiết L m... hàm l ợng rutin trung bình đạt 95,13%, hàm l ợng quercetin trung bình l 1,39% Vậy rutin đã tinh chế đạt tiêu chuẩn DĐVNII tập 3 3.5 Phưotig pháp chiết bằng dung dịch kiềm loãng 3.5.1 Tiến hành: như mục 2.5.2, thí nghiệm được l m 5 l n , sau khi tiến hành giai đoạn chiết xuất và tinh chế kết quả được ghi ở bảng 8 Bảng 8: Hiệu suất chiết xuất và hiệu suất tinh chế STT mDL(g) mx(g) ^cx ( ^ ) mTc(g) TỊjị -(% ) . CH3COOH- H2O (3 :1: 1). BAW: n- BuOH- CH3COOH- H2O (4 :1: 5). Forestal: CH3 COOH- HCl- H2O (3 0:3:1 0). Benzen- CH3 COOH- HjO (1 25:72: 3) CH3CI 3- CH3COOH- H2O (1 3:6: 1). Phenol-H2O (3 : 1). Hiện màu bằng. (3 : 1) CHCI 3- MeOH(15 :l) Benzen- Aceton (9 : 1) Toluen- Aceton (1 9: 1) CHCI 3- CH3COOH (9 : 1) MeOH 80% (VA ^). + Sắc ký giấy. Giấy sắc ký: What man số 1, số 3. Dung môi thường dùng: TB A: n- BuOH- CH3COOH- H2O. thuật chiết xuất rutin, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất rutin từ hoa ho - Sophora japónica L Fabaceae. ” Phần I TỔNG QUAN 1. Nguồn nguyên liệu để chiết rutin Người