Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất rutin từ hoa hòe ( sophora japonica l fabaceae )

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG ĐÌNH HỢP NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CHIÊT XUẤT RUTIN TỪ HOA H {Sophora japónica L - Pabaceằ) (KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHOÁ 1997-2002) Người hướng dẫn : PGS TS.TừM inh Koóng KS Nguyễn Việt Hương Nơi thực : BM Công nghiệp Dược Trung tâm GMP Thời gian thực hiện: 2/2002- 5/2002 Hà Nội, 5/2002 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực cơng trình tốt nghiệp này, em nhận giúp đỡ nhiều thầy cồ giáo, đặc biệt là: Thầy giáo PGS TS.TừM ỉnh Kng Cơ giáo KS Nguyễn Việt Hương người trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành cơng trình Với lòng biết ơn chân thành, em xin cảm ofn thầy cô Đồng thời, em xin cảm ơn môn Công nghiệp dược, phòng thí nghiệm GMP tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành cơng trình này, cảm ơn thầy cô, môn giúp đỡ em trình học tập rèn luyện trường Hà Nội 5/2002 s v Hồng Đình Hợp MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỂ Phần I: TỔNG QUAN Nguồn nguyên liệu để chiết rutin 2 Cây hoè 2.1 Đặc điểm thực vật phân bố 2.2 Thành phần hoá học 2.3 ứ ig dụng Rutin 3.1 Cơng thức hố học tính chất 3.2 Định tính, định lượng 3.3 Tác dụng dược lý 3.4 ứ ig dụng Chiết xuất rutin 4.1 Phương pháp chiết nước /Ị^/^ 4.2.Phương pháp chiết cồn 10 Phần II: [t h ự c n g h i ệ m v k ế t q u ả 12 Nguyên vật liệ u 12 1.1 Ng jyên liệu 12 1.2 Dung mơi hố ch ất 12 1.3 Thiết bị dụng c ụ 12 Phương pháp thực nghiệm 13 2.1 Định lượng rutin hoa hoè 13 2.2 Phương pháp chiết nước 100°c 13 2.3 Phương pháp chiết nước 120°c 16 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 2.4 Phương pháp chiết cồn 60° 17 2.5 Phương pháp chiết dung dịch kiềm loãng ^ 18 2.6 Phương pháp xử lý số liệu .19 Kết thực nghiệm nhận xét 19 3.1.Định lượng rutin hoa hoè 19 3.2 Phương pháp chiết nước 100°c 20 3.3 Phương pháp chiết nước 120°c 21 3.4.Phương pháp chiết cồn 60° 22 3.5.Phương pháp chiết dung dịch kiềm loãng 23 Bàn luận 27 Phần III: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 30 LKết lu ận 30 2.Đề x u ất 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 CÁC CHỮVIẾT TẮT DC: Dịch chiết DD: Dung dịch DĐVN: Dược điển Việt Nam DĐ: Dược điển DL: Dịch lọc PP: Phương pháp PPCX: Phương pháp chiết xuất Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi ĐẶT VÂN ĐỂ • Rutin chất có tác dụng làm giảm tính thấm mao mạch, tăng sức bền thành mạch, y học ứng dụng để phòng điều trị nhiều chứng bệnh liên quan đến tổn thương thành mạch trĩ, chảy máu đáy mắt , chứng bệnh dẫn đến tai biến mạch máu vữa xơ động mạch, rối loạn tuần hồn, giòn mao mạch Đặc biệt, tỉ lệ người có nguy mắc mắc bệnh ngày gia tăng Ngoài ứng dụng y học rutin ứng dụng nhiều lĩnh vực khác bao màu, nhuộm thực phẩm— Do nhu cầu sử dụng rutin giới ngày tăng ? ỡ'nước ta, hoa hoè dược liệu có hàm lượng rutin cao nhiều so với dược liệu cho rutin khác mạch ba góc, bạch đàn cho rutin kể hoè số nước khác giới hoè Hungary ( khoảng 12%) Mặt khác, điều kiện khí hậu thổ nhưỡng nước ta thuận lợi cho hoè phát triển, thu hái chế biến dược liệu Hoè dễ trồng, giống nhân nhanh, kỹ thuật trồng đơn giản, đầu tư vốn không nhiều, đến năm thu hoạch, thu hái đơn giản nên hoè mọc hoang trồng nhiều khắp nước Đây nguồn nguyên liệu lớn vô quý giá để chiết rutin mà thiên nhiên ưu đãi Để khai thác có hiệu nguồn nguyên liệu cần nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất rutin từ hoa hoè cho có hiệu kinh tế, tính khả thi độ an tồn cao Với mong muốn góp phần nhỏ vào việc nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất rutin, thực đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất rutin từ hoa hoè- Sophora japónica L.-Fabaceae.” Phần I TỔNG QUAN Nguồn nguyên liệu để chiết rutin Người ta tìm thấy rutin có 62 họ thực vật với khoảng 150 lồi có 70 loài thuộc 28 họ thực vật chứa rutin dạng vết[17] ^' Trong rutin phân bố chủ yếu số phận định hoa (Hoè), (Bạch đàn cho rutin , Mạch ba góc) Tuy rutin có nhiều có số chứa rutin với hàm lượng cao có khả dùng làm nguyên liệu để chiết rutin là: - Ruta graveolens L có khoảng 2% - Fagopyrum esculentum Moench có khoảng 4% - Fagopyrum tataricum L có khoảng % - Eucalyptus macrorrhyncha F.Muell có khoảng % - Sophora japónica L có khoảng 18% Các nguồn nguyên liệu để sản xuất rutin giới là: - Sophora japónica L,: Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Pháp - Eucalyptus macrorrhyncha F.Muell: Anh, Mỹ, úc - Fagopyrum esculentum Moench Fagopynim tatarỉcum L : Pháp, Mỹ, Việt Nam [16] 3> &nước ta, hoa hoè có hàm lượng rutin cao (25- 35%) So với số dược liệu khác fnạch ba^ócr(2- 3%), bạch đàn cho rutin (10%) hoa h có hàm lượng lớn nhiều [8 ] Mặt khác, hoè mọc hoang trồng khắp nơi nước ta Vì vậy, nguồn nguyên liệu để chiết xuất rutin nước ta hoa hoè [16] Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Cây hoè: Sophora japónica L , họ Đậu -Fabaceae 2.1 Đặc điểm thực vật phân bố Hoè loại gỗ, to, cao tới 15m, thân thẳng có chỏm tròn Cành cong queo Lá kép lơng chim lẻ, có 9-13 chét hình trứng, đỉnh nhọn, nguyên dài khoảng 3cm, rộng 1,5 - 2,5 cm Cụm hoa hình chuỳ đầu cành, hoa dài 4- mm rộng 2- 3mm, phần đài chiếm 2/3 tồn chiều dài, đài hình chng, tràng hình bướm màu trắng ngà phía có cuống ngắn Khi khơ hoa trở nên vàng, vị đắng Quả loại đậu không mở, dày thắt nhỏ lại hạt [4,8] Phân bố nhiều vùng Đông Nam Á*: Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên Vùng Trung Capea dơ, Bán đảo Crưm [16] số nước Châu Âu hoè trồng làm cảnh [8 ] nước ta, hoè trồng mọc hoang khắp nơi, đặc biệt trồng nhiều Thái Bình, Nam Định, Hà Nam, Ninh Bình, Nghệ An [8 ] Qua thực tế trồng trọt thu hoạch sản phẩm, người ta thấy có hai loại hoè khác hoè tẻ hoè nếp Hoè tẻ có cành, hoa thưa nở khơng đều, cụm hoa cành kẽ Hoè nếp nhiều cành, mang nhiều hoa nở [6 ] Hoè nếp cho suất nụ hoa cao gấp ba lần hoètẻ[16] 2.2 Thành phần hoá học Thành phần hoá học chủ yếu hoè flavonoid, ngồi số hợp chất khác: - Lá chứa ,6 % flavonoid tồn phần có 4,7% rutin - Vỏ chứa 10,5% flavonoid toàn phần 4,3% rutin, ngồi có sophoricosid, sophora biosid số flavonoid khác Trong xanh có flavonoid, ngồi rutin có kemppherol- 3- sophorosid , henistein - Các phận khác gỗ, thân, hạt có flavonoid khác phân lập biết cấu trúc hoá học khơng có ý nghĩa thực t ế - Hoa h có 14 Aavonoid phát [19], ngồi rutin có quercetin, betulin triterpenoid nhóm lupan, sophoradiol dẫn chất nhóm olean[8 ] Tuỳ điều kiện cụ thể khí hậu, thổ nhưỡng, trồng trọt, cách thu hái thời gian thu hái mà hàm lượng rutin hoa khác Thông thường thu hái vào lúc nụ h non hàm lượng rutin đạt cao nhất[5] Nụ hoè nước ta chứa khoảng 25- 35% rutin [16] DĐVN II quy định hàm lượng rutin sấy khô trước 60°c không thấp %[2 ] 2.3 ứng dụng, Người ta thường sử dụng nụ hoè hoa hoè vói tên gọi hoè mễ hoè hoa nhiều lĩnh vực : đời sống hàng ngày dùng hãm để uống, y học dùng làm thuốc , công nghiệp chiết xuất dùng để chiết xuất rutin DĐVN qui định dược liệu không chứa 10% hoa nở Trong y học, sử dụng hoa hoè người iịa dùng phận khác với tên gọi hoè giác, Theo quan điểm y học cổ truyền, vị hoè hoa thuộc nhóm huyết - Tính vị: vị đắng, tính bình - Quy kinh: can đại tràng - Cơng - chủ trị: + Lương huyết huyết: dùng trường hợp huyết nhiệt gây chảy máu chảy máu cam, lỵ, trĩ, băng kinh, băng huyết, đại tiện máu + Thanh nhiệt bình can: dùng trường hợp can hoả thượng viêm gây đau mắt đỏ, đau đầu + Thanh phế chống viêm: dùng bệnh viêm đới nói khơng tiếng + Hạ huyết áp: dùng hoè vàng bệnh cao huyết áp, trị co thắt động mạch vành Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Rutin Rutin flavonoid thuộc nhóm flavon phân lập vào năm 1842 từ Cửu lý hương {Ruta graveolen) Veyss [8 ] Đến năm 1904 Schnidt xác định rõ cơng thức hố học rutin [7] Đến năm 1962, rutin tổng hợp tồn phần [24] 3.1 Cơng thức hố học tính chất Rutin (3,3',4',5,7 pentahydroxy flavone -3-Rutinosid) [8 ] H C12H21O9 OH ô Khi thuỷ phân tạo thành quercetin, glucose rhamnose Quercetin (3,3',4',5,7 pentahydroxy flavone) [8 ] OH OH OH Ô - Rutin bột kết tinh màu vàng hay vàng ánh xanh, khơng mùi Để ngồi ánh sáng có màu sẫm lại Tinh thể ngậm phân tử nước 2.4.2 Cách tiến hành: a ỵử lí nsuyên liêu: lấy nguyên liệu, xay thô b Chiết xuất Cân lOOg nguyên liệu qua xử lí, cho vào bình chiết, thêm 600ml cồn 60°, đun sơi cách thuỷ có sinh hàn hồi lưu 20 phút lấy dịch chiết Làm lần (lần thứ lấy 50ml dịch chiết, pha lỗng với 50ml nước, acid hố đến pH = thấy tủa ít) Gộp dịch chiết lại, đem cất thu hồi phần cồn Sau để nguội dịch cơ, cho rutin kết tinh tự nhiên 14 nhiệt độ phòng Lọc lấy tủa phễu buchner Tủa thu đem sấy 60°c khô thu rutin thô c Tinh chế: Nghiền rutin thơ thành bột mịn, hồ tan nước sơi, lọc nóng qua phễu buchner DL thu để nguội, cho rutin kết tinh tự nhiên 12 nhiệt độ phòng Lọc lấy tủa phễu buchner, loại bỏ nước lọc Tủa thu đem sấy 60°c khô rutin tinh khiết 2.43 Định lượng: tiến hành mục 2.2.3 2.5 Phương pháp chiết rutin kiềm lỗng 2.5.1 Sơ đồ quy trình chắxuất: mục 2.2.1 thay nước 100°c DD Na2 CO3 1%, điều kiện thường 2.5.2 Tiến hành : a Xử lí nsuyên liêu: thực 2.2.2 ab Chiết xuất', nguyên liệu sau xử lí, cho vào bình chiết nguội thêm vào lOOOml DD Na2CƠ3 1% Ngâm giờ, khuấy mạnh, sau rút lấy dịch chiết Làm lần (lần thứ lấy khoảng lOOml dịch chiết đem acid hóa đến pH = 2,5- thấy tủa ít) Gộp dịch chiết lại, đem acid hoá DD acid HCl 10% đến pH = 2,5- Để rutin kết tinh tự nhiên 14 nhiệt độ phòng Lọc lấy tủa phễu buchner Tủa thu đem sấy khô 60°c khô rutin thô c Tinh chế: thưc hiên muc 2.2.2.C Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 2.5.3 Định lượng: Thực mục 2.2.3 2.6 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu xử lý theo phương pháp thống kê ứng dụng y dược Xác định giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, khoảng tin cậy n n i=i S' = n - = x± t ^ ( x - x )^ ^ ‘ ^ s VĨT Trong đó: X - giá trị trung bình s - độ lệch chuẩn, n - số lần thí nghiệm, ụ - khoảng tin cậy Hiệu suất giai đoạn chiết xuất tính theo công thức: ,0/N_mT xioo T1cx(%) = đây: r|cx -hiệu xuất giai đoạn chiết xuất m^L ■ khối lượng rutin thô lượng dược liệu Hiệu suất giai đoạn tinh chế tính theo cơng thức: đây: ĩ ]tc - hiệu suất giai đoạn tinh chế m^c - khối lượng rutin tinh chế Kết thực nghiệm,và hkậtv xét 3.1 Định lượng rutin hoa hoè: thực mục , thí nghiệm làm lần , kết ghi bảng Bảng 1: Hàm lượng rutin hoa hoè STT n iD L ( g ) mtủa (g) Hàm lượng rutin (%) 0,2892 29,19 2 0,3125 31,54 0,3086 31,15 TB 0,3034 30,63 Kêt : hàm lượng rutin hoa hoè khoảng 30,63%, dược liệu đạt tiêu chuẩn DĐVNI tập I (yêu cầu > 20%) 3.2 Phương pháp chiết xuất rutin nước lOO^C 3.2.1 Tiến hành: mục 2.2.2 Sau tiến hành giai đoạn chiêt xuất tinh chế, kết ghi bảng Bảng 2: Hiệu suất chiết xuất rutin hiệu suất tinh chế STT mDL(g) 100 100 100 100 TB 100 100 niT(g) 17,86 18,28 18,15 18,20 17,35 17,87±0,52 ĩlcx (%) 17,86 18,28 18,15 18,20 17,35 17,87 + 0,52 T|jc(% ) 14,06 14,65 14,37 14,42 13,81 14,26 ±0,41 78,72 80,14 79,17 79,23 79,59 79,37 ±0,66 Kết quả: hiệu suất giai đoạn chiết xuất trung bình 17,87, hiệu suất giai đoạn tinh chế trung bình 79,37 Nhận xét: pp chiết xuất nước sơi đơn giản, dễ thực , hiệu suất th ấp Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 3.2.2 Định lượng: mục 2.2.3, đem rutin tinh chế định lượng, kết ghi bảng Bảng 3: Hàm lượng rutin quercetin rutin tinh chế STT Hàm lượng rutin (%) Hàm lượng quercetin (%) 96,24 1,41 94,87 1,75 95,39 1,69 94,64 1,74 95,42 2,45 TB 95,31 ±0,77 1,81 ±0,47 Kết : hàm lượng rutin trung bình đạt 95,31%, hàm lượng quercetin trung bình 1,81 Vậy rutin tinh chế đạt tiêu chuẩn DĐVN II tập 3( yêu cầu hàm lượng rutin > 95%,hàm lượng quercetin