Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1

Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1 Nghiên cứu bào chế cốm probiotics chứa vi khuẩn lactobacillus acidophilus DH 1

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU BAO CHE COM

PROBIOTICS CHUA VI KHUAN Lactobacillus acidophilus

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2012

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÉ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

WTS CBW WES

DAO THI HANH

NGHIEN CUU BAO CHE COM

PROBIOTICS CHUA VI KHUAN Lactobacillus acidophilus

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHÉ MÃ SỐ: 60 73 01

Người hướng dẫn khoahọc: TS Dam Thanh Xuân

HÀ NỘI - 2012

Trang 3

LOI CAM ON

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin được gửi lời cảm ơn

chân thành tới TS Đàm Thanh Xuân, người đã luôn quan tâm, tận tình

hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS Nguyễn Khắc Tiệp, DS Lê Ngọc Khánh, cùng các thầy cô trong Bộ môn Công nghiệp Dược, những người đã đóng góp những ý kiến quý báu và hỗ trợ tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của cdc anh chi ky

thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược

Cuối cùng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã ln ủng hộ, khích lệ và hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 28 tháng 9 năm 2012

Trang 4

MỤC LỤC

Trang

27000.) 62)221127 7 1 Chương 1: TÔNG QUAN <5-e<s<sssssEsesEsEsEsEsESEsEeEsEzEsesesesesesessse 3 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTICS - 2s E9 £E+EeEeEzEzescxe 3

1.1.1 Khái niệm về probiotiC§ . ¿+ 2 s52 2 Sx+E+xsErrereerrrsred 3

1.1.2.Tinh hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotics trén thé giới và Việt Nam ¿2s se csEcsEsEsrsrserree 4

1.1.3 Các vi sinh vật được sử dụng trong các chế phẩm probiotics 8 1.2 Lactobaqcillus qCldODlHLÏHS c1 1111111911 kh 13

1.3 KỸ THUẬT TẠO CÔM - ¿6 5222x332 EEEEEEErkrkrrrreee 15

1.3.1 Phương pháp xát qua rây - - - Ss s1 ke 15 1.3.2 Phương pháp đùn - - - + HH HH ke 16 1.3.3 Phương pháp phun sấyy - - -k k+s+k+k+k xxx cee 17 1.3.4 Kiểm tra chất lượng cốm . + + + 2 22 +E+E+E+E+xzEzxezscee 17 1.3.5 Đánh giá chất lượng cốm probiotiCs 5-52 s se csczcxe 18

1.4 KỸ THUẬT LÀM KHHÔ ¿- ¿2-25 E+EE+E2E2Ee££z£EzEzerkred 18 1.4.1 Phương pháp sấy tĩnh ¿+5 2 2+6 +x‡E+EvEE£EzEeEeverxrererree 18 1.4.2 Phương pháp sấy tầng sôi . + +52 2z Sex cxsecerkrkrreree 19

1.4.3 Phương pháp đông khô - - BS gg k, 19

Chương 2 ĐỒI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 NGUYEN VAT LIEU VA THIET BỊ NGHIÊN CỨU 21 2.1.1 Ñguyên vật liỆu . - + + E2 St E31 E1 121111111 crrrrrred 21

2.1.2 Môi trường sử dụng trong nghiên CỨU - «55555555 << << + 21

8.6/12 7 22

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - + + 2 2 2+E+s+E+E+EzEzEzEsesrsreee 23 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 2-2 5£+<+E2x+£scszzree 23

Trang 5

2.3.2 Phương pháp nhân giống . + ++£+Ez+2Ez£z£xrererxred 24

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào . - 52 s¿ 24 2.3.4 Phương pháp xác định sinh khối ướt -. 2- ¿5-55 ss¿ 24

2.3.5 Phương pháp tạo cốm ƯỚt ¿- - + 2 2+s+s+£+£z£ezezxsrsrrered 25 2.3.6 Phương pháp làm khô cốm ướt ¿- + - + + ++s+s+£s£s+xzx2 26 2.3.7 Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu cốm probiotics tạo thành ¿- + + 2 +++E+S+EEE£E£xeEeErkrersrrsrsrered 27 2.3.8 Phương pháp xác định kích thước nguyên liệu cỗm 29

2.3.9 Phuong pháp xử lý số liệu . ¿2 2 + 2E E+E+E+EeEekereerereekd 29 Chương 3 KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU / THỰC NGHIỆM 31

3.1 Xác định phương pháp nuôi cấy và xử lý dịch nuôi cây để thu hỗn dịch tế bào VSV tt t Hành TH 21111 1101130111111 11311110111 1111k 31

3.1.1 Lựa chọn phương pháp nuôi cấy thu sinh khối tế bào 31 3.1.2 Xác định các thông số liên quan đến “được chất” (sinh khối tế

bào) trong quá trình tạo nguyên liệu probIofiCs - - -« + 34 3.2 Lựa chọn phương pháp và xác định thông số của quá trình tạo nguyên liệu probiotics dạng cốm chứa L acidophilus -. - 39

3.2.1 Lựa chọn phương pháp tạo cốm . 2 2 2 s+z+s+s+ezxcxd 39 3.2.2 Xác định thơng số của q trình đùn tạo cốm - 41 3.3 Lựa chọn phương pháp và xác định thông số của q trình làm khơ cơm probiotics chứa L acidophiiluus c5 5252 Se+c+esc+cereresreee 46

3.3.1 Lựa chọn phương pháp làm khô cốm - - 2 2 2 2 £+£zsz s2 46 3.3.2 Xác định ảnh hưởng của thời gian sây đến chất lượng cốm 48 3.4 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu cốm probiotics tạo thành trong thời gian bảo quản 2200 100110111111 1111111111 x xy 52

Chương 4: BÀN LUẬN o<o<so< sessEs£s=sEsESEsEsEsEsEsEsEsEsesesesesese 54 4.1 Xác định phương pháp nuôi cây và xử lý dịch nuôi cây thu hỗn dịch

Trang 6

4.2 Lựa chọn phương pháp, xác định thông số của quá trình tạo nguyên liệu probiotics dạng cốm -. ¿+2 + 2k +EvE2EEEEEEEEEEEEEErErkererrereee 55 4.3 Lựa chọn phương pháp, xác định thông số của q trình làm khơ cốm pDTOiOfÏCS - - ¿+ 52 S2 x‡E9E9EEEEEEEE912E1 2521111511111 31122 56

Trang 7

DANH MUC CAC BANG

Trang

Bang 3.1: Khối lượng sinh khối ướt 1 acidophilws trong 100ml MT nuôi cay

thu được sau 2 H esooo so o s60 6566 9 9866 99.986 69.9.9866 99686 96.686 996666996 8699966669666659686666 32

Bảng 3.2: Số lượng tế bào L acidophilus có trong 1ml dịch nhân giống sau

1.0000.) 01070 0ô 35 Bảng 3.3: Đánh giá khối bột âm khi sử dụng các phương pháp xử lý dịch nhân

giống khác nhau trong quá trình trỘn s-s-sesesesesesesesesesesesesesesese 36 Bang 3.4: Số lượng tế bào L acidophilus có trong 100g bột âm sau khi trộn với 60ml dịch gạn của các bình lên men cố dung tích khác nhau 38 Bảng 3.5: Đánh giá hiệu quả tạo cốm, chất lượng cốm bào chế băng 2 phương pháp: xát qua rây Va ùÙn << << < << s 2s 996.26 0 088889095.960.05088980045.966 0888 40 Bảng 3.6: Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng cốm được bào chế băng

phương pháp đùn với thời gian ủ khối âm khác nhau e- 42

Bang 3.7: Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng các cốm bào chế băng phương pháp đùn với tốc độ đùn khác nhau e-s-sses<ssssesesssssse 44

Bảng 3.8: Số lượng, tỷ lệ sống sót L øcidophilus và hàm âm của cốm sau khi làm khô bằng phương pháp đông khô và sấy tầng sôi .-.s-s-s<ss<s- 47

Trang 8

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Hình ảnh L acidophilus trên kính hiển vi điện tử «- 14

Hình 2.1: Quy trình tạo cốm ướt chứa L aciđophiius băng phương pháp xát QUA TÂY ‹ 6S 656 5.95995959800880 0.06 90000 0666666688 88099900.04.094 090006 0696666688808 25

Hình 2.2: Quy trình tạo cốm ướt chứa L øcidophilus bằng máy din QZJ 26 Hình 3.1: Đồ thị thể hiện lượng sinh khối ướt L acidophilws trong 100ml MT nuôi cấy thu được sau 244h -.s-ss<<c<esesesesesSsseSsseEsSesseseSesesesesesesessses 32 Hình 3.2: Đồ thi thé hiện ảnh hưởng của thời gian ủ khối ẩm lên hiệu suất tạo

CỐ ‹ s-s-scse seo S8 E9 E9E9ESES5598505858585E3 5.5 55 5509050589555 3 5 585850550908050500 050 42

Hình 3.3: Đồ thị thê hiện ảnh hưởng của thời gian ủ khối âm lên tỷ lệ cốm có kích thước có kích thước 1, ~ l,5Šimm ‹‹ .«eseocese se 6696698695685 96886698 43

Hình 3.4: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của tốc độ đùn lên hiệu suất tạo cốm khi sử dụng phương pháp ùn .-s- s5 =5 9.99996595665656556506nn0856088956 45

Hình 3.5: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của tốc độ đùn lên tỷ lệ cốm có kích

thước có kích thước 1,0 + 1,5mm khi sử dụng phương pháp đùn 45 Hình 3.6: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian sấy đến chất lượng cốm sau

khi được làm khô bằng phương pháp sấy tầng sơi -. ss-s<sesesessese 50

Hình 3.7: Quy trình bào chế nguyên liệu probiotics dạng cốm chứa L ACIAOPNULUS «eo <5 S666 66 6.6 66.6 06.0.08.0.0.0.06.9.90699.99999999909404444040440444404440040400406006000660 00 51 Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm âm của cốm probiotics chứa 1 acidophilus trong th g1an bảo QUẬN «««««««eeeess se s5 55668888888686688886699966666 53

Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn sự thay đôi tỷ lệ sống của L.aciđophiius trong côm

Trang 9

DANH MUC CAC CHU VIET TAT

CFU (Colony Forming Units): L acidophilus:

MRS (de Man, Rogosa, Sharpe):

VSV

B subtilis

S boulardii

IDF (International Dairy Federation):

LAB (Lactic acid bateria):

MT: WHO FAO Kl/t KI/kl Tt/kl Số đơn vị khuẩn lạc Lactobacillus acidophilus

Môi trường nuôi cẫy vi khuẩn MRS

Vị sinh vật

Bacillus subtilis

Saccharomyces boulardii Liên đoàn bơ sữa thế giới Nhóm vi khuẩn lactic Môi trường

Tổ chức Y tế thế giới

Tổ chức Lương thực thế giới

Trang 10

ĐẶT VẤN ĐÈ

Sự phát triển của công nghệ sinh học mà đỉnh cao là công nghệ gen đã và đang góp phản tích cực cho sự phát triên nhiều mặt đời sống xã hội con người Công nghệ sinh học đã mang đến những công nghệ mới, những phương pháp chữa bệnh mới, vaccIn cho người và động vật Có thể nói chúng ta chưa hình dung hết những gì mà cơng nghệ sinh học có thể mang lại cho con người trong thập niên tới

Probiotics là một sản phẩm của công nghệ sinh học truyền thống Probiotics là một hay nhiều vi sinh vật sống có tác dụng phục hồi và cân bằng số lượng vi sinh vật có ích trong đường ruột, từ đó cải thiện và hỗ trợ hệ tiêu hóa đường ruột

Vi sinh vật hay được sử dụng nhất trong các chế phẩm probiotics là

nhóm vi sinh vật sinh acid lactic, trong đó dién hinh 14 Lactobacillus

acidophilus

Hiện nay, trên thị trường Việt Nam ngày càng xuất hiện nhiều chế phẩm probiotics như: Biofidin, Biolacto (Mỹ), Biobaby, Antibio (Han Quốc), trong đó, chiếm lĩnh thị trường dược phẩm probiotics vẫn là các chế phẩm thuốc ngoại Đa số các cơ sở sản xuất được phâm probiotics trong nước chỉ đóng gói và phân phối sản phẩm với nguồn nguyên liệu ban đầu chủ yếu

phải nhập khẩu, giá thành cao

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu tạo nguyên liệu probiotics chứa vỉ khuẩn Lactobacillus acidophilus’’

Với các mục tiêu:

- Xác định phương pháp nuôi cấy và xử lý dịch nuôi cây để thu hỗn

Trang 12

Chuong 1: TONG QUAN

1.1 DAI CUONG VE PROBIOTICS 1.1.1 Khai niém vé probiotics

Probiotics bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “sự sống” Khái niệm probiotics đầu tiên xuất phát từ nhà khoa học Eli Metchnikoff, trong cuốn sách “Kéo dài sự sống” của ông đưa ra năm 1908 Ông cho răng những người nông dân Bulgary sống lâu là vì họ thường xuyên sử dụng sữa chua có chứa vi khuẩn lactic, các vi khuẩn này có lợi cho vi sinh vật đường ruột [33]

Thuật ngữ “probiotics” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi Kollath Probiotics được định nghĩa là “các yếu tố có nguồn sốc từ vi khuẩn,

kích thích sự phát triển của các vi khuân khác” [33]

Năm 1974, Parker đã phát triển định nghĩa này, ông cho răng probiotics là “những vi sinh vật và những cơ chất giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột” Sau đó vào năm 1989, Fuller đã thay đổi định nghĩa này, ông cho rằng

probiotics là “thực phẩm” bô sung một số vi sinh vat (VSV) sống có ích cho vật chủ nhằm cân bang hé vi sinh vật đường ruột Năm 1998, Salminen đã

định nghĩa probiotics là “những thực phẩm chứa vi khuân sống ảnh hưởng có lợi cho sức khoẻ” Năm 2002 Marteau đã định nghĩa probiotics hoàn chỉnh

hơn “probiotics là những chế phẩm chứa tế bào vi sinh vật hay những thành phần của tế bào vi sinh vật mà ảnh hưởng có lợi cho sức khỏe” [33], [34]

Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Tô chức Lương thực thế

Trang 13

1.1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotics

trên thế giới và Việt Nam

1.1.2.1 Tình hình sứ dụng các chế phẩm probiotics

Việc sử dụng thực pham c6 probiotics (nhu 1 thanh phan tu nhién của thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từ lâu, nhưng

việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probilotics mới thực

sự phát triển từ những năm 80 của thê kỷ 20 Những nghiên cứu về đặc điểm phân loại va quan thé vi sinh vat đường ruột ở người và động vật được tiễn hành bởi Apajalahti và cs (1998) [9]; Vander Wielen và cs

(2000) [31] đã cho thay néu nhu trong ruột non của người Bacteroides va

Bifidobacterium chiém wu thé thi 6 ga 1A Ruminococcus va Streptococcus Bằng kỹ thuật gen, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20 +

50% số loài vi sinh vật đường ruột ở động vật được phân lập, nuôi cây như

nguồn probiotics Netherwood va cs (1999) [23]; Gong va cs (2002) [15]; Zhu và cs (2002) [35] đã sử dụng kỹ thuật gen để nghiên cứu sự thay đổi câu trúc quân thê và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới tác động của probiotics Tuy nhiên, cho đến nay những nhân

tố nào góp phần tạo nên một hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rỗi loạn sự

cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ Đã có rất nhiều nghiên cứu về vai trò của probiotics đối với đời sống động vật như tác động của probiotics đối với hệ thống miễn dịch ở niêm mạc

ruột (Schat và Mayer, 1991) [29]; (Hersbberg và Mayer, 2000) [17]; đối với sự thay đôi của niêm mạc ruột non ở vật nuôi (McCracken và Lorenz,

Trang 14

thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố

và các sản phẩm trao đổi (các axit béo bay hơi, các chất giống kháng

sinh ), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống

miễn dịch ruột [27]

Hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng có ba dạng chế phẩm probiotics chủ yếu là: được phẩm, thực phâm chức năng và sản phẩm thủy sản Chế phẩm probiotics ở dạng dược phẩm, thực phẩm chức năng được sử dụng trong phòng và điều trị các bệnh đường tiêu hóa: phịng ngừa nhiễm trùng đường ruột cấp tính, phối phợp điều trị tiêu chảy, Các sản phẩm probiotics được dùng phố biến trong nuôi trồng

thủy sản nhằm kiểm sốt và phịng bệnh cho vật nuôi nhờ bố sung VSV

sống có lợi vào ao nuôi, gia tăng quan thể VSV làm thức ăn, cải thiện

dinh dưỡng từ đó tăng cường khả năng miễn dịch của vật ni với mầm

bệnh, góp phan làm giảm thiểu việc sử dụng hóa chất, kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho vật nuôi

Trang 15

Bảng 1.1: Các thế hệ bào chế chế phẩm probiotics trên thể giới Đặc điểm VSV

Thé hệ probiofics _ Ưu điểm Nhược điểm

Thế hệ 1 VSV sống (trong sữa | Giá rẻ — sử dụng | VSV có thể chết (Non-coated) chua, phomat, kim nhiều rất nhiêu khi qua

chị, ) đạ dày và dịch

mật

Bào tử VSV Thuận lợi cho|Mất nhiều thời

nuôi cấy, sản xuất, |gian phát triển lưu hành thành VSV —

chậm tác dụng,

hạn chế khả năng

cạnh tranh với

VSV gây bệnh Probiotics đông khô Không khai thác

hết tác dụng của probiotics sống

Thế hệ 2 VSV đưa vào dưới |Bảo vệ VSV khi| Mat thời gian

Entericcoated | dang viên nang có lớp đi qua dạ dày và màng bao tan rã bao ngoài tan trong | dịch mật đê giải phóng

ruột VSV

Thé hé 3 Dang bao vi nang Hoàn thiện ý |Chưa khắc phục Microencapsu tuong cua thé hệ | được nhược điểm

lated 2 của thê hệ 2

Thế hệ 4 Lớp bên trong là | VSV có tỷ lệ sống | Đồi hỏi công nghệ Tạo lớp bao protein, lớp ngoài là|cao Chịu được cao, kỹ thuật bào kép polysaccharid acid dich vị và | chê hiện đại, trang

Dual - coated muối mật Lớp

bao kép phóng

thích nhanh VSV, thiết bị đắt tiền

Gia thành cao

Trang 16

Hiện nay các chế phẩm probiotics chủ yếu là dạng khô (bột, cốm, viên viên nang, ), nguyên liệu để sản xuất dạng này đều là bột đông khô đề đảm bảo số lượng VSV sống trong quá trình bảo quản Dạng bột khô là dạng bào

chế tốt nhất so với dạng viên nén và viên nang [3Ï ]

1.1.2.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotics ở Việt Nam Ở nước ta, các chế phẩm probiotics đã chiếm lĩnh thị trường hơn 10 năm; tuy nhiên việc nghiên cứu sản xuất probiotics phục vụ cho đời sống còn rất mới mẻ và bắt đầu được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây Hiện nay mới chỉ có khoảng mười xí nghiệp sản xuất các chế phẩm probiotics là dược phẩm và thực phẩm chức năng

Không thể không kê đến vai trò quan trọng của Công ty TNHH một thành viên vaccin và sinh phẩm Nha Trang, Công ty TNHH một thành viên Pásteur Đà Lạt là các cơ sở sản xuất chế phẩm probiotics lớn nhất Việt Nam với nhiều

chế phẩm như Viabiovit, Vivac bio, Healthy liver, Biosubtyl LD - gói 1g

chtra chira 10’ - 10° cfu B subtilis va L acidophilus Céng ty Anabio R&D

là nhà máy sản xuất nguyên liệu probiotics thế hệ mới đầu tiên tại Việt Nam,

với triển vọng không chỉ cung cấp nguyên liệu cho cả nước mà còn xuất khẩu ra nước ngoài

Tuy nhiên, sản phẩm sản xuất bởi các công ty trong nước vẫn chủ yếu thuộc thế hệ 1 nên lượng VSV sống sót vẫn còn rất nhỏ

1.1.2.4 Một số chế phẩm probiotics thông dụng trên thị trường dược phẩm Việt Nam hiện nay

Các chế phẩm probiotics trên thị trường chủ yếu là đạng thuốc bột, cm

hoặc nang chứa bột thuốc hay cém thuốc có thể chứa một hay một số vi sinh vật được phối hợp với nhau Dễ nhận thay L acidophilus được sử dụng phô

Trang 17

Bảng 1.2: Một số chế phẩm probiotics trên thị trường hiện nay

STT | Biệt dược Thành phần Nhà sản xuất 1 L-Bio-3D 300mg vi khuan: L acidophilus, | Me-Auspharm Bifidobacterium longum, L|Liên doanh

rhamnosus Việt Nam

2 Abiiogran Thuôc côm, lg chứa 10” cfu L |Dae Han New acidophilus Pharm — Han

Quéc

3 Antibio Goi bot udng 1g chtra 10° cfu L | Organon — acidophilus Han Quéc 4 Antibiophilus | Viên nang chứa 2x10” - 2x10” cfu|Lyocenre -—

L acidophilus Phap

5 Biolacto Viên nang chira it nhat 10° cfu L | Union - Mỹ acidophilus va L bulgaricus

6 Lactomed Viên nang 320mg chứa: II Dong - Hàn

2x10° cfu L bifidus quốc

2 x 10° cfu L acidophilus

2 x 10° cfu Streptococcus faecalis

7 Ultraflore Viên nang 0,2g chứa 2 x 10 nâm | Sobio — Phap men Saccharomyces cerevisiae

8 | Biosubtyl LD | Goi 1g chtra 10’ - 10° cfu B subtilis | Vién — vaccin va L acidophilus Da Lat — Việt

Nam

9 Probio Gói bột ng chứa 10° cfu L.|Imexpharm - acidophilus Việt Nam

10 | Y-bio Gói bột chứa 10’ cfu L acidophilus |CTCP Dược

Hau Giang

1.1.3 Các vi sinh vật được sử dụng trong các chế phẩm probiotics

Trang 18

đưa ra được các yêu cầu về đặc điểm cần phải có đối với các vi sinh vật sử dụng làm nguyên liệu probiotics, đó là:

- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa của vật chủ

- Chịu được pH thấp ở đạ dày và acid mật ở ruột non - Không sinh độc tố và không gây bệnh cho vật chủ

- Có khả năng sống và cư trú trong ruột

- Dễ nuôi cây và có khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian dài

[6], [26]

Nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotics là:

- Nhóm vi khuẩn lactic: gồm 2 chỉ phô bién 1a chi Lactobacillus va

Bifidobacterium

- Nh6m vi khuan khong phai vi khuan lactic:

+ Chi Propionibacterium: P freudenreichii, P cyclohexanicum + Chi Bacillus: B subtilis, B clausii

+ Chi Brevibacillus: B laterosporus

+ Chi Sporolactobacillus: S laevolacticus [14]

- Nhom nam men: chủ yếu là chi Saccharomyces dai dién 1a S cerevisiae

Nhóm vi khuẩn lactic có hình dạng và kích thước tương đối đa dạng có thê là hình câu, hình que, có thể là đơn bào đơn độc hoặc tạo chuỗi; có thê

sinh trưởng tốt ở điều kiện pH thấp, có khả năng đồng hòa nhiều loại đường

khác nhau như đường glucose, lactose, manfose, saccarose, Nhờ những đặc

điểm này mà vi khuẩn lactic có nhiêu ưu thế trong bảo quản thực phâm [14]

Chi Lactobacillus 1a chi 16n nhat trong ho vi khuẩn lactic đại diện là 7

acidophilus gồm các vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, có hình que hoặc lưỡi cầu cong xuất hiện đơn lẻ hoặc đưới dạng chuỗi, có khi dạng sợi, đi động hoặc không di động, thành phần G C của genome < 50% (vi khuẩn có G C

Trang 19

hiếu khí đến hiễu khí, catalase âm tính, có thể xảy ra hiện tượng catalase giả ở

một số chủng Lacfobacilius có mặt ở khắp mọi nơi, ở hầu hết các mơi trường

có carbohydrat như thức ăn (sữa, thịt lên men, rau quả, nước giải khát), đường tiêu hóa, đường hô hấp, đường sinh dục của con người và động vật, rác thải Sự phân bố của chúng ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH, nồng độ OXy, sự tương tác giữa các vi khuẩn

Vào tháng 9/2008 người ta đã thông kê được có khoảng 116 lồi thuộc

chi Lactobacillus [14]

Có nhiều nghiên cứu và tng dung Lactobacillus trong san xuất cũng như trong đời sống con người Chúng có khả năng làm giảm số lượng các vi

sinh vật hoặc nắm có hại ở ruột non; có khả nang sinh lactase - một enzym

quan trọng trong chuyên hóa sữa; có liên quan đến quá trình sản xuất một số vitamin nhóm B nhu: niacin, acid folic, pyridoxin; tăng cường chức năng của

hệ thống miễn dịch; giảm sự tiêu diệt vi sinh vật có ích do sử dụng kháng sinh

đài ngày [8]

Chi Lactobacillus g6m 6 đại điện mang đặc tính probiotics: L acidophilus,

L paracasei, L delbrueckii, L plantarum, L rhamnosus, L sporogenes

Bifidobacterium thuộc nhóm vi khuẩn sinh acid lactic, là vi khuẩn

Gram (+) có thê phân nhánh, không di động, không sinh bào tử và kị khí, có nhiều hình dạng khác nhau gồm hình que cong ngắn, hình gậy, hình chữ Y

Các loài thuộc các chi này sử dụng chuỗi chuyển hóa sinh học để phân hủy

đường hexose goi 14 “bifid shunt” Enzym chinh dùng để phân loại đồng thời phân biệt với các loài khác là fructose-6-phosphoketolase

Đến 8/2008 theo théng ké chi Bifidobacterium có khoảng 30 lồi [14]

Bifidobacteria là lồi có vai trị tối quan trọng trong hệ sinh thái phức hợp và năng động ở đường ruột của người, động vật máu nóng cũng như ong mật

Chúng phân bố ở các hốc sinh thái khác nhau trong đường tiêu hóa và đường tiết

Trang 20

niệu, tỷ lệ thay đối phụ thuộc vào độ tuổi và khẩu phần ăn Hệ vi sinh vật tự

nhiên của em bé chủ yếu là B/?4obacreria được hình thành ngay sau khi sinh Sự nhân lên của chúng được kích thích bởi các thành phần glycoprotein của k- casein trong sữa non, sữa người Số lượng Bÿiđobacteria giảm dần theo tuôi và

cuối cùng trở thành chi có số lượng vi sinh vật nhiều thứ 3 trong hệ vi khuẩn ở

đường tiêu hóa sau chỉ Lacfobacillius và Eubacferium Đây là một trong những chỉ quan trọng trong công nghiệp sản xuất bơ sữa [14]

Ching Bifidobacteria mang dic tinh probiotics gồm 5 đại diện: Ö animalis, B bifidum, B breve, B longum va B adolescentis [14]

Đại diện cho nhóm nắm men là Saccharomyces, được gọi là nắm men

bia hoặc nắm men bánh mi Saccharomyces phat trién nhanh chóng và trưởng thành trong ba ngày, khơng có khả năng sử dụng nitrat và khả năng lên men khác nhau carbohydrat Saccharomyces la nhitng vi sinh vat don bao, cé

nhiều chỉ được sử dụng trong y học Š bowlarđii có khả duy trì và phục hồi

hệ vi sinh vật trong ruột, phòng ngừa và điều trị rỗi loạn tiêu hóa [32]

Enferococcus thuộc nhóm khơng sinh acid lactic, là vi khn Gram (+),

ky khí khơng bắt buộc, khơng có khả năng sinh bào tử, sống trên đường tiêu hóa của con người và động vật có vú khác [13]

1.1.4 Cơ chế tác dụng và ứng dung cia probiotic 1.1.4.1 Cơ chế tác dụng

* Cạnh tranh năng lượng, vị trí bám:

Probiotics cạnh tranh chất dinh dưỡng và năng lượng với các vi khuẩn

gây bệnh để duy trì và phát triển Bằng cách chiếm lĩnh và bám chặt vào thành

ruột, probiofics ngăn ngừa các vi khuẩn có hại tần cơng và phát triển * Tăng cường chức năng chống đỡ của niêm mạc ruội

Trang 21

từ ruột vào mạch máu Chức năng này giúp giảm sự nhiễm khuẩn và dị ứng đối với các kháng nguyên có trong thực phẩm

* Sản sinh ra các chất ức chế

Một số probiotics sản sinh ra các kháng sinh như bacteriocins giúp ngăn ngừa và tiêu diệt mầm bệnh

Trong quá trình lên men đường, các thành phần khác nhau của probiotics sản sinh ra acid lactic giúp làm giảm pH của ruột và ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn không cần thiết

Một số probiotics sản sinh ra metabolic, butyrat và acid butyric có khả năng chống ung thư

* Kích thích đáp ứng miễn dịch

Vi khuẩn probiotics có khả năng làm tăng cả phản ứng miễn dịch đặc

hiệu và không đặc hiệu bằng cách kích thích các tế bào phản ứng miễn dịch

(macrophase, lymphocyte) và tăng cường sự sản xuất các thành phần miễn nhiễm (cytoline, immunoglobulins, interferon)

* Tăng cường chức năng tiêu hóa

Probiotics trong ruột non giúp giảm lượng mật trong cơ thê và giảm cholesterol, sản sinh ra các enzym khắc phục quá trình tiêu hủy carbohydrat

và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình hấp thụ năng lượng từ các chất dinh

dưỡng ở ruột, đồng thời lên men những carbohydrat không tiêu hóa được

trong ruột non và sản xuất ra vitamin B, K [10], [25]

1.1.4.2 Ung dung cia probiotics Probiotics được ứng dụng: ° Trong các bệnh tiêu hóa

- Tăng khả năng tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzym khác

- H6 trợ trong điều trị tiêu chảy do sử dụng kháng sinh

Trang 22

- _ Điều trị viêm đường tiêu hóa

- Tac dung lén Helicobacter pylori - Diéutri ung thư ruột kết

- _ Hạn chế nguy cơ sỏi thận ° Tăng cường miễn dịnh

- _ Kích thích miễn dịch niêm mạc

- _ Tăng cường miễn dịch, giảm phản ứng dị ứng ° Giảm nguy cơ nhiễm vì khuẩn, nấm

° Giảm nguy cơ mắc ung thư

° Chống tăng huyết áp, giảm cholesterol máu ° Ứng dụng trong nuôi trông thủy sản

Xu hướng sử dụng probiotics trong nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng lên do các kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng làm tăng năng suất và ngăn ngừa bệnh của chúng Probiotics có thể được sử dụng nhằm ngăn ngừa

mùi vị, giảm thành phần tảo lục, tảo lam, giảm nifrat, nitrit, amoni và

phosphat, tăng oxygen hòa tan và nâng cao khả năng phân hủy chất hữu cơ Cac dong chon loc Bacillus spp da dugc su dung qua thực nghiệm dé kiém

ché su lay nhiễm cua cdc loai Vibrio [10], [25]

1.2 Lactobacillus acidophilus

L acidophilus thudc chi Lactobacillus 1a dai diện của nhóm vi khuan

sinh acid lactic, 14 trực khuẩn Gram (+), hình que hay hình cầu, kích thước 0,6

- 0,9 x 1,5 - 6,0um, mọc đơn, đôi hoặc tạo thành chuỗi ngắn L acidophilus

khơng có lơng roi, không di động, không sinh bào tử, không ưa muối, ưa acid,

catalase âm tính, kị khí tùy tiện L aciđophilus phát triển tốt trong điều kiện sức căng bề mặt thấp và có khả năng kháng lysozym [4], [6], [11], [19]

Trang 23

khuân không có cytochrom, do đó benzidin âm tính G + C chiếm tỷ lệ 34 -

37% trong gen [11]

Do L acidophilus vi hiểu khí nên môi trường nuôi cây thường là kị khí

hoặc giảm áp oxy với 5 - 10% CO¿ L acidophilus có thê sinh trưởng ở nhiệt độ cao (ở 45°C), tuy nhiên phát trién tối ưu ở 37°C, không phát triển dưới 20 -

22°C hoặc ở nhiệt độ cao hon 48°C Vi khuan này có thê chịu được acid 0,3 - 1,9%, với pH tối thích trong khoảng 5,5 — 6,0 Nhu cầu dinh dưỡng của L acidophilus tương đỗi phức tạp Môi trường nuôi cây L acidophilus cần các loại carbohydrat có thể lên men, protein và các sản phẩm phân giải, hỗn hợp

các vitamin nhóm B, dẫn xuất của acid nucleic, cac acid béo tu do chua bao

hòa, cùng các chất khoáng như magnesi, mangan và sắt Pepton và trypsin có tác dụng kích thích khả năng sinh acid của loài vi khuẩn này Hiện nay, L acidophilus thường được nuôi cấy trong môi trường MRS Ở trong đường tiêu hóa, L acidophilus găn gián tiếp lên niêm mạc ruột qua lectin do chúng

tự tông hợp hoặc bám trực tiếp lên các tế bào biểu mô ruột [4], [6], [11]

aa vui Ce set AL

Hình 1.1: Hình ảnh L acidophilus trên kính hiển vi điện tử

L acidophilus chiêm ổa sô trong các chê phâm probiotics nhờ các ưu

thê: củng cô hàng rào miễn dịch và không miễn dịch chông lại các nhiễm

khuân đường ruột; cải thiện chức năng miễn dịch; phòng ngừa bệnh tiêu chảy;

Trang 24

phòng chống ung thư ruột kết; ngăn ngừa cholesterol máu cao; cải thiện khả năng dung nạp lactose; phòng chống các bệnh ở đường tiêu hóa trên; ơn định

hàng rào niêm mạc ruột [19]

L acidophilus có tác dụng đối kháng lại sự phát triển của các vi khuẩn

gây bệnh đường ruột như S/aphyÌococcus qureus, Salmonella typhừữnurium, Yersimia enterocolitica và Clostridium perfringens thông qua cơ chế kháng vi sinh vật, bằng cách cạnh tranh chất dinh dưỡng, năng lượng cũng như vị trí

bám lên niêm mạc ruột của các vi khuẩn gây bệnh Đồng thời L acidophilus

cũng sản xuất ra các acid hữu cơ như acid lactic và acid acetic, các bacteriocin và các sản phẩm chuyển hóa cơ bản khác gồm hydrogen peroxid, carbon dioxid va diacetyl

L acidophilus va Bifidobacterium spp được công nhận có tác dụng làm giảm nồng độ các enzym xúc tác cho quá trình chuyển đổi của các amin gây ung thư ruột kết, như B-glucuronidase, B-glucosidase, azoreductase, nitro-

reductase va urease

L acidophilus có tác dụng phân giải các acid mật thành các acid tự do Các acid tự do này được đào thải khỏi đường tiêu hóa nhanh hơn nhiều so với các acid mật dạng kết hợp Điều này khiến nồng độ acid mật giảm xuống, đời hỏi cơ thể phải tổng hợp mới acid mật từ cholesterol, tạo ra tác dụng giảm nông độ cholesterol toàn phân trong cơ thé [19]

1.3 KỸ THUẬT TẠO CĨM

Có ba phương pháp tạo cốm: phương pháp xát qua rây, phương pháp đùn và phương pháp phun sấy

1.3.1 Phương pháp xát qua rây

Đây là phương pháp tương đối đơn giản, dễ thực hiện, qua các bước:

Trộn bột kép

Trang 25

Tạo khối âm — xát hạt

!

Lam khé cém — stra hat

vss côm

- Trộn bột kép: Các thành phần ban đầu sau khi qua bước nghiền mịn được trộn khô theo nguyên tắc đồng lượng đề đảm bảo đồng nhất hỗn hợp

- Tạo khối ẩm- xát hạt: Trộn bột kép với tá dược dính lỏng để liên kết các tiêu phân bột Tỷ lệ và loại tá được dính, thiết bị và thời gian nhào trộn

cần được xác định cho từng công thức cụ thể Sau khi trộn xong nên để khối

âm ồn định trong thời gian thích hợp (30 — 45 phút), rồi xát hạt (hoặc sợi) qua

cỡ ray thích hợp (1,0 — 2,0mm))

- Say hat — sửa hạt: Sây khô hạt ở nhiệt độ thích hợp (40 — 70°C) đến

hàm âm dưới 5% Sửa hạt qua cỡ rây quy định để loại bỏ bột mịn và cục vón,

làm cho kích thước hạt đồng nhất hơn

1.3.2 Phương pháp đùn

* Được tiễn hành sản xuất trên thiết bị đùn qua các bước:

- Tao khối dẻo — đùn thành sợi: Trộn bột kép với tá dược dính lỏng trong thiết bị nhào trộn thích hợp để liên kết tiêu phân Tỉ lệ và loại tá được dính, thiết bị và thời gian nhào trộn cân được xác định cho từng công thức cụ

thé Sau khi trộn xong nên để khối âm Ổn định trong thời gian thích hợp (30 —

45 phút) rồi đùn thành sợi hình trụ qua cỡ rây thích hợp

- Làm khô: cỗm được làm khô đến độ âm quy định bằng các phương pháp thích hợp

Ưu điểm: Côm bào chế theo phương pháp này có độ bền cơ học cao, năng suât cao

Trang 26

Nhược điểm: Yêu cầu phải có máy chuyên dụng 1.3.3 Phương pháp phun sấy

Phương pháp này thường dùng bào chế cốm tan, cốm thuốc từ dịch

chiết được liệu

Nguyên lý: phun một dung dịch hoặc hỗn dịch các nguyên liệu dưới

dạng sương mù hoặc giọt nhỏ để bốc hơi trong một buồng khơng khí nóng,

các giọt nhỏ được sấy khô ngay lập tức thành các tiêu phân hình câu Kích

thước của các tiêu phân phụ thuộc vào kích thước vòi phun, tốc độ phun và

nồng độ dung dịch (hỗn dịch) Các tiêu phân sẽ được tách khỏi hỗn hợp bằng cách thối qua các cyclon

Ưu điểm: Cỗm thu được có hình gần giống hình cầu, có khả năng chảy

tự do và tính chịu nén cao

Nhược điểm: - Không áp dụng được với các được chất kém bên với nhiệt, trong đó có “được chất” probiotics

- Chi phi cao 1.3.4 Kiếm tra chất lượng cốm

Một số yêu câu chất lượng chung đối với thuốc cơm:

- Hình thức: Thuốc côm phải khô, đồng đều về kích thước hạt, khơng có hiện tượng hút âm, không bị mềm và biến màu

- Độ ẩm: Không quá 5,0%

- Độ đồng đêu hàm lượng: Thuộc côm không quy định thử độ đồng đều

về khối lượng thì phải thử độ đồng đều về hàm lượng theo phương pháp 1 —

Phụ lục 11.2— Dược Điền Việt Nam 4

- Độ rã: Cho một lượng cốm đóng gói trong I đơn vị phân liều vào cốc

Trang 27

1.3.5 Đánh giá chất lượng cốm probiotics

Các thuốc cốm nói chung được đánh giá chất lượng thông qua các tiêu chí như đã nêu trong mục 1.3.4 Tuy nhiên, cốm probiotics là loại cốm đặc biệt, “được chất” chính trong cốm là các vi khuẩn probiotics Bởi vậy các tiêu chí cơ bản nhằm đánh giá chất lượng cốm probiotics cũng có những điểm đặc biệt, đáng lưu ý

- Hàm ẩm: Yêu cầu hàm âm đối với các thuốc cốm nói chung là không quá 5,0% Tuy nhiên, trong môi trường hàm âm cao, các vi khuân probiotics rất dễ bị chết Bởi vậy, hàm âm cốm probiotics càng nhỏ càng tốt, có thể chỉ 1 — 3% [12]

- Hàm lượng “được chất”: Đối với cơm probiotics, tiêu chí này được thé hiện ở số lượng vi sinh vật còn sống Theo khuyến cáo của IDF, chế phẩm

probiotics phải chứa từ 10” - 10” cfu/g [16]

Vi du: Abiiogran (Han Quéc): 10° cfu/g L acidophilus Antibio (Han Quéc): 10° cfu/g L acidophilus

Antibiophilus (Pháp): 2x 10°—2 x 10” cfu/g L acidophilus

1.4 KY THUAT LAM KHO

Làm khơ là một quy trình sử dụng phổ biến trong sản xuất được phẩm,

mục đích chủ yếu là để bảo quản sản phẩm và làm cho sản phẩm có thê chất phù hợp Quá trình này được sử dụng trong công nghệ sản xuất nhiều dạng thuốc

khác nhau, đặc biệt là dạng thuốc thê rắn Hiện nay có 3 phương pháp làm khô

được sử dụng rộng rãi: Phương pháp sấy tĩnh, sây tầng sôi và đông khô

1.4.1 Phương pháp sấy tĩnh

Nguyên tắc: hạt cần sẵy được trải trên các khay sây đặt tĩnh trong buông sấy, năng lượng cung cấp thường bằng phương pháp dẫn nhiệt: nhiệt

truyền từ khay lên khối hạt Hơi nước tạo thành được loại bằng hút chân không hoặc băng cách thơi gió

Trang 28

Thiết bị sấy tĩnh đơn giản dễ chế tạo và vận hành Tuy nhiên, phương pháp sấy tĩnh có nhược điểm là sự truyền nhiệt kém do diện tích tiếp xúc giữa khay sấy và hạt nhỏ, vì thế thời gian sấy dài (thường 8 + 24h), khó làm nóng đều khối nguyên liệu cần sấy và chỉ phí lao động lớn, tốn diện tích nhà xưởng Riêng với

cém probiotics, thời gian sấy lâu ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sống sót của VSV nên phương pháp sấy fĩnh không được lựa chọn nghiên cứu

1.4.2 Phương pháp sấy tầng sơi

Ngun lý: Khơng khí đã đốt nóng được thơi qua khối nguyên liệu trong thùng chứa có đáy là lưới rây Ở tốc độ thấp khơng khí thối qua chậm nhưng ở tốc độ cao lực cản, ma sát làm cho các tiêu phân chuyển động dan

nở và lực cản giảm đi Tại một tốc độ thối thích hợp các tiểu phân sẽ bị

phân lập riêng rẽ và nó sẽ năm cân bằng trong thùng bởi lực thổi lên và trọng lực kéo xuống

Ưu điểm: phương pháp sấy tầng sôi:

o Tăng sự tiếp xúc đồng đều giữa các tiêu phân và khí nóng o_ Hạt được đảo đều liên tục trong quá trình sấy

o_ Hơi nước bay hơi được loại bỏ ngay

o_ Quá trình sấy nhanh [20]

1.4.3 Phương pháp đông khô

Đông khô là q trình làm khơ các thuốc và chế phẩm sinh học ở nhiệt độ

thấp, dưới các điều kiện cho phép, đề loại trừ nước bằng cách thăng hoa, thay đổi

trạng thái nước từ thể rắn sang thể hơi mà không qua thể lỏng [1], [22], [28]

Phương pháp đông khô thường được sử dụng để bảo quản và giữ chủng vi sinh vật (do sau q trình đơng khơ, vi sinh vật tồn tại được trong thời gian

rất đài - hàng chục năm mà vẫn giữ được đặc điểm hình thái và tính chất sinh

hóa ban đầu) Đơng khơ cũng được áp dụng trong công nghiệp bào chế các dạng thuốc đông khô như thuốc tiêm, bột vô khuẩn dùng trong điều trị các bệnh đường hô hấp, chế phẩm probiotics [28]

Trang 29

- Giai đoạn tiên đông: Nhiệt độ được hạ thấp đến mức thích hợp — dưới điểm Eutecti của hệ, nước được tách dân ra khỏi hệ và đóng băng thành đá Giai

đoạn tiền đông thường được tiến hành ở nhiệt độ - 40°C hoặc thấp hơn

- Giai đoạn làm khô sơ cấp: Áp suất buồng đông khô được giảm xuống dưới áp suất hơi của đá, hệ được cung cấp đủ nhiệt để nước đá bắt đầu thăng

hoa Giai đoạn này thường được tiễn hành dưới áp suất vài mbar, nhiệt độ

buồng ngưng khoảng - 50°C hoặc thấp hơn

- Giai đoạn làm khô thứ cấp: Nhiệt độ khay sây được tăng lên cao hơn

một chút so với giai đoạn làm khô sơ cấp nhằm loại bỏ nước không đóng băng, giảm lượng nước có trong sản phẩm một cách tối đa để đảm bảo độ ôn

định của sản phẩm trong quá trình bảo quản [22], [28]

Trang 30

Chương 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYEN VAT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên vật liệu

%%* Chúng vì khuẩn: Lactobacillus acidophilus (Bộ môn Công nghiệp

Dược — Trường Đại học Dược Hà Nội)

s* Nguyên liệu pha môi trường:

Acetat natri (Trung Quốc) Triamoni citrat (Trung Quéc)

Agar - agar (Viét Nam) Tween 80 (Trung Quốc) Cao nam men (Trung Quốc) K,HPO, (Trung Quốc)

Cao thịt (Trung Quốc) MgSO,.7H,O (Trung Quốc) Glucose (Trung Quốc) MnSO,.4H,0 (Trung Quốc) Pepton (Trung Quốc)

s* Các tá dược sử dụng: Avicel PH 101 (Braxin)

Sữa gây (Việt Nam)

2.1.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu - Môi trường MRS lỏng (MTT:) Glucose 20g Pepton 10g Tween 80 1,0g MgsSO,.7H20 0,2g Cao thịt 10g

Cao nam men 5g

Trang 31

Acetat natri K,HPO, MnS0O,.4H,O Nước cất pH 2,08 0,05g vđ 1000ml 6,8 — 7,0 - Môi trường MRS thạch (MT2):

MT2 = MT1 + Agar - agar (18g/1000ml mi truong)

2.1.3 Thiét bi Thiết bị Xuất xứ Tủ cây Sanyo (Nhật)

Nôi hâp ALP (Nhật)

Tủ âm CO; Sanyo (Nhật) Cân xác định độ âm Precisa (Thụy Sĩ)

Cân kỹ thuật Sartorius (Đức)

Cân phân tích Sartorius (Đức)

Nôi cách thủy Trung Quốc Máy đùn - tạo câu QZJ (Trung Quốc)

Máy sây tâng sôi Diosna (Duc)

May do d6 mai mon Erkewa (Duc)

Bình hút âm Trung Quôc

Máy đông khô Christ Alpha 1 -2 LD Máy ly tâm Sigma 3 — 18 K — Sartorius

Rây, chày, côi, đĩa petri, pipet bâm, ông nghiệm, đâu côn,

Trang 32

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu nhằm giải quyết các mục tiêu đề ra Nội dung nghiên cứu gồm có:

* Xác định phương pháp nuôi cấy và xử lý dịch nuôi cấy để thu hỗn dịch tê bao VSV L acidophilus

- Lựa chọn phương pháp nuôi cấy thu sinh khối tế bao

- Xác định các thông số liên quan đến “dược chất” (sinh khối tế bào) trong quá trình tạo nguyên liệu probiotics

+ Xác định mật độ tế bào L acidophilus trong dịch nuôi cây

+ Lựa chọn phương pháp xử lý dịch nuôi cấy thu sinh khối tạo khối 4m

trong quá trình tao cém

+ Xác định thể tích dịch nuôi cây sử dụng thu hỗn dịch vi sinh vật dùng tạo

cốm

* Lựa chọn phương pháp và xác định thơng số của q trình tạo nguyên liệu probiotics dang cốm chứa L acidophilus

- Lựa chọn phương pháp tạo cốm

- Xác định thông số của quá trình đùn tạo cốm

* Lựa chọn phương pháp và xác định thông số của q trình làm khơ cm probiotics chua L acidophilus

- Lựa chọn phương pháp làm khô cốm - Xác định thơng số của q trình sấy

* Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu cốm probiotics tao thanh trong thời gian bảo quản

- Đánh giá chỉ tiêu số lượng VSV sống sót, hàm ẩm, độ rã

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp hoạt hóa giống

Trang 33

hấp ở điều kiện 0,6 atm/20 phút, để nguội Cấy giống vào các ống trên từ các ống chứa bột đông khô L acidophilus Bước này tiễn hành trong tủ cây vô trùng Nuôi trong tủ CO; 5% ở nhiệt độ 37 + 1”C khoảng 24h rồi tiến hành nhân giống

2.3.2 Phương pháp nhân giống

Pha môi trường MRS lỏng (theo mục 2.1.2), đỗ 10ml MRS lỏng vào

ống nghiệm, nút kín, hấp tiệt trùng ở điều kiện 0,6 atm/20 phút, để nguội Tiến hành cấy giống vào ông nghiệm trên Nuôi cây 20 - 24h trong tủ CO; 5% ở nhiệt độ 37 + 1C

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào

Phương pháp ni cấy chìm: Pha 100ml môi trường MRS lỏng (theo mục 2.1.2) vào bình nón 250ml, nút kín, hấp tiệt trùng ở 0,6 atm/20 phút, để nguội Sử dụng các ống nhân giống cây vào các bình nón chứa MRS lỏng và ủ 24h

trong tủ CO; 5% ở nhiệt độ 37 + 1C, thu được hỗn dịch tế bao L acidophilus

Phương pháp nuôi cấy bê mặt: Pha 100m] môi trường MRS thạch (theo

mục 2.1.2) vào bình nón 250ml, nút kín, hấp tiệt trùng ở 0,6 atm/20 phút, sau

đó đỗ vào 5 đĩa petri (đã hấp tiệt trùng) mỗi đĩa 20ml, để nguội Sử dụng các

ống nhân giống cấy giống vào các đĩa petri 1,5mm /1 petri và ủ 24h trong tủ

CO; 5% ở nhiệt độ 37 + 1°C sau đó gạn thu sinh khối 2.3.4 Phương pháp xác định sinh khối ướt

* Lên men chìm: Rửa sạch ơng ly tâm Eppendorf sây khô, cân xác định khối lượng ống (m; g) Lắc đều các ống nghiệm để sinh khối phân tán vào

môi trường, thu sinh khối có trong dịch nuôi cẫy bằng máy ly tâm siêu tốc với

tốc độ 15.000 vòng/ phút trong thời gian 10 phút, sau đó gạn bỏ lớp dịch

trong phía trên Cân khối lượng ống ly tâm có chứa sinh khối ướt (m; g) Khối lượng sinh khối thu được là (mạ — mị) g

Trang 34

* Lên men bê mặt: Gạn thu lớp sinh khối mọc trên bé mặt môi trường

rắn Dùng nước cất rửa sạch bề mặt để thu sinh khối, sau đó thực hiện thu

sinh khối ướt bằng phương pháp li tâm tương tự như trên

2.3.5 Phương pháp tạo cốm ướt

a> Tao cém wot bang phương pháp xát qua rây

Hỗn hợp tá được sữa gây, avicel với tỷ lệ 3 : 7 sau khi tiệt trùng (sữa gây: tiệt trùng theo phương pháp Tyndall, avicel 101: hấp tiệt trùng ở 0,6

atm/30 phút) được phối hợp với hỗn dịch VSV L acidophilus tạo khối bột âm Sau khi ủ, khối bột được xát qua rây đã tiệt trùng với đường kính mắt rây

1,5mm tạo cốm wot probiotics

Sơ đồ quy trình tạo cốm ướt chứa L acidophilus bằng phương pháp xát

qua rây được thể hiện trong hình 2.1:

Sữa gây Avicel

— Trộn bột kép Hỗn dịch VSV chứa L > acidophilus y Tao khéi 4m y U A Xát hạt (Ray 1,5mm) Vv Com wot

Trang 35

b> Tao cém wot bang mdy din tao cau

Hỗn hợp tá dược sữa gây, avicel với tỷ lệ 3 : 7 sau khi tiệt trùng được phối

hợp với hỗn dịch VSV L acidophilus tạo khỗi bột âm Sau khi ủ, khối bột được

đùn băng máy đùn với đường kính mắt đùn 1,5mm tạo côm ướt probiotics Sơ đồ quy trình tạo cốm ướt chứa L acidophilus bang phuong pháp đùn qua máy QZJ (Trung Quốc) được thê hiện ở sơ đồ trong hình 2.2:

Sữa gây Avicel

Trộn bột kép Hỗn dịch VSV chứa L acidophilus Vv

Tạo khôi âm

| Dun y Côm ướt

Hình 2.2: Quy trình tạo cốm ướt chứa L acidophilus bằng máy dan QZJ

2.3.6 Phương pháp làm khô cốm ướt

a Làm khô bằng phương pháp sấy tầng sôi

Mẫu côm ướt được làm khô bằng máy sấy tầng sôi ở điều kiện: nhiệt độ sây 37 + 1C, tốc độ gió 95%, 100g nguyên liệu/mẻ

Trang 36

b Làm khô bằng phương pháp đông khô:

Mẫu cốm ướt được tiền đông trong tủ lạnh sâu (-50 đến -40°C) trong 2h Sau đó, mẫu được đơng khơ trong buông lạnh đông của máy đông khô

Nhiệt độ: -50°C; áp suất: 0,05mbar; thời gian: 16h

Kết thúc quá trình, lẫy mẫu ra khỏi máy, bảo quản trong túi nilon kín ở 4°C trong tủ lạnh

2.3.7 Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu cốm probiotics tạo thành

Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng nguyên liệu cốm probiotics tạo thành

bao gồm:

- Hàm lượng “được chất”: thê hiện ở số lượng vi sinh vật còn sống

Theo khuyến cáo của IDF, chế phẩm probiotics phải chứa từ 107 - 10”

cfu/g [12]

- Ham am: dui 5%, theo tiéu chuan ham âm thuốc cốm

- Độ rã: theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam 4

2.3.7.1 Phương pháp xác định số lượng vỉ khuẩn còn sống theo phương pháp pha loãng liên tục

Chuẩn bị các ống nghiệm, 1 ống chứa 10ml nước cất, mỗi ống còn lại

chứa 9ml nước cất Hấp tiệt trùng ở 0,6 atm/20 phút, đề nguội Cân chính xác

1g mẫu cần đếm số lượng tế bào, pha vào ống 10ml, lắc đều Sau đó, hút

chính xác 1ml dịch ở ống 10ml trên, pha loãng vào ống nghiệm thứ 2 (9ml nước cất), lắc đều Rồi tiếp tục hút chính xác Iml dịch ở ống nghiệm thứ 2

vào ống nghiệm thứ 3 (9ml nước cất), lắc đều Cử như vậy cho tới ống nghiệm cuối cùng cần pha loãng

Trang 37

khảo sát vào các đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên, dàn đều, mỗi nông độ tiễn hành

với 3 đĩa Ủ trong tủ CO; 5%, ở nhiệt d6 37 + 1°C; sau 48h dem ra đọc kết quả

Tính kết quả: Số lượng vi khuẩn cịn sống có trong 1g mẫu cần định lượng được tính theo cơng thức:

A6 x 10° + A7 x 10’ + A8 x 10°

X=

Trong đó:

X: số lượng vi khuân sống trong 1g mẫu

A6, A7, A8: số lượng khuẩn lạc có trong đĩa petri chứa vi khuẩn ở độ

pha loang 10°, 10’, 10°

2.3.7.2 Phương pháp xác định hàm âm của mẫu

Hàm âm của các mẫu cốm được xác định bằng máy đo hàm âm Precisa Nguyên fốc: Dựa trên sự giảm khối lượng của mẫu thử, biểu thị bằng phân trăm (kl/kl) khi được làm khô trong điều kiện xác định

2.3.7.3 Phương pháp xác định độ rã của mẫu

Sử dụng thiết bị thử độ rã Erkewa Môi trường thử là nước Duy trì

nhiệt độ môi trường thử ở 36 - 38°C trong suốt quá trình thử Lẫy khoảng 1g

mẫu cho vào mỗi ống trong 6 ống thủy tinh của thiết bị thử độ rã 6 ống thủy tinh này được găn có định vào bộ giá đỡ có khả năng chuyên động lên xuống

nhẹ nhàng một khoảng 50 - 60mm với tân số cô định 28 - 32 lần/phút Thời

øian của phép thử kéo đài trong 30 phút

Mẫu được coi là rã, khi đáp ứng một trong những yêu cầu sau: - Khơng cịn cắn trên mặt lưới

- Nếu còn cắn, đây là khối mềm không có màng nhận thấy rõ, khơng có

nhân khơ

Mẫu thử đạt yêu câu khi tât cả 6 mẫu đêu rã

Trang 38

2.3.8 Phương pháp xác định kích thước nguyên liệu cốm

- Đặt chồng bộ rây theo thứ tự cỡ mắt rây giảm dân từ trên xuống dưới:

1,5mm; 1mm; 0,85mm; 0,71mm; 0,5mm Các mẫu cốm cần xác định kích thước hạt được cho qua bộ rây trên (theo chiều từ trên xuống dưới) Gõ nhẹ từng rây trong khoảng 30 phút (thứ tự từ trên xuống dưới)

- Xác định khối lượng hạt nằm lại trên mỗi rây, từ đó tính tỷ lệ phần

trăm hạt nằm trong mỗi khoảng kích thước 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu

Xử lý các kết quả, số liệu nghiên cứu bằng phần mềm Excel và phương pháp thống kê toán học, sử dụng công thức sau:

_ XP 2 (D,-D)* * = s=I1|EL_D— n n—-1 Trong đó: D: Giá trị trung bình s: Độ lệch chuẩn

n: Số thí nghiệm tiến hành song song (Thông thường n = 3)

* % chênh lệch khối lượng sinh khối thu được giữa phương pháp lên men chìm và lên men bề mặt:

ƒm — M2

% chênh lệch= ————————— x 100%

my

Trong đó:

m¡: khối lượng sinh khối ướt thu được trong phương pháp lên men chim (g)

m;: khối lượng sinh khối ướt thu được trong phương pháp lên men bề

Trang 39

* Hiệu suất tạo cốm (P;):

M3

P,(%) = — x100%

mạ Trong đó:

mạ : khối lượng cém khô thu được (g)

m¿ : khối lượng bột nguyên liệu sử dụng tạo cốm (g)

* 'Tỷ lệ cm có kích thước 1,0 + 1,5mm (P;):

M5

P,(%) = — x 100%

mẹ Trong đó:

ms: khối lượng cốm có kích thước 1,0 + 1,5mm (g)

m; : khối lượng cốm khô thu được (g)

Trang 40

Chương 3 KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU / THỰC NGHIỆM

3.1 Xác định phương pháp nuôi cấy và xứ lý dịch nuôi cấy để thu hỗn

dịch tế bào VSV

3.1.1 Lựa chọn phương pháp nuôi cấy thu sinh khối tế bào

L acidophilus 1a VSV vi hiếu khí, vì vậy thường được ni cây bằng

phương pháp lên men chìm Tuy nhiên với sản phẩm acid lactic, môi trường lỏng thường bị acid hóa nên trong q trình ni cấy các tế bào có thê bị ức chế và giảm khả năng sinh sản Khi nuôi cấy trên bề mặt, ảnh hưởng của pH sẽ giảm so với phương pháp lên men chìm và giúp VSV quen điều kiện khô khi tạo sản phẩm Vì vậy, hai phương pháp lên men chìm và lên men bề mặt được lựa chọn nuôi cây thu sinh khối tế bào

Mục đích: Khảo sát lượng sinh khối thu được trong hai phương pháp lên men bề mặt và lên men chìm, từ đó lựa chọn phương pháp nuôi cấy thu

sinh khối tế bào VSV Tiến hành:

- Nuôi cây L acidophilus trong 2 điều kiện: nuôi cẫy bề mặt và nuôi cây chìm theo các thơng số như sau:

Nuôi cấy bê mặt: 100ml môi trường MRS đặc được phân phối vào 5

đĩa petri và nuôi cây theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.3

Nuôi cấy chìm: 100ml mơi trường MRS lỏng đựng trong bình nón 250ml và nuôi cấy theo phương pháp trình bày trong mục 2.3.3

- Sau 24h nhân giống, tiễn hành thu sinh khối theo phương pháp trình bày trong mục 2.3.4

- So sánh lượng sinh khối thu được của 2 phương pháp lên men chìm

và lên men bề mặt từ đó lựa chọn phương pháp nuôi cấy thu sinh khối tế bào