Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108 Khảo sát nồng độ thuốc chống lao trên bệnh nhân điều trị tại khoa hô hấp bệnh viện bạch mai và khoa a5 bệnh viện TW quân đội 108
Trang 1
BO Y TE
TRUONG DAI HOC DUOC HA NOI
NGUYEN CONG THAI
KHAO SAT NONG DO THUOC CHONG LAO TREN BENH NHAN DIEU TRI TAI KHOA HO HAP BENH VIEN BACH MAI
VA KHOA A5 BENH VIEN TW QUAN DOT 108
KHOA LUAN TOT NGHIEP DUOC Si
Người hướng dẫn:
1 BS Tran Thị Thanh Huyền
2 ThS.BS Nguyễn Thanh Hãi
Nơi thực hiện:
1 Bộ mơn Dược lâm sàng _
2 Khoa hơ hấp bệnh viện Bạch Mai
Trang 2LOI CAM ON
Trong những dịng đâu tiên của luận án, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới:
BS Trần Thị Thanh Huyền ThS BS Nguyén Thanh Hoi
là những người thầy đã tận tình hướng dẫn và hết lịng giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực hiện đề tài
Tơi xin chân thành cám ơn cơ giáo 7S Nguyễn Thị Liên Hương và các giảng viên của bộ mơn Dược lâm sàng - những người luơn hướng dẫn, giúp đỡ
và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong quá trình học tập, thực nghiệm và nghiên cứu đề hồn thành khĩa luận này
Tơi cũng xin trân trọng cám ơn các bác sỹ và nhân viên của khoa hơ hắp
bệnh viện Bạch Mai và khoa A5 bệnh viên TWQĐ 108 đã giúp đỡ và tạo điều
kiện cho tơi trong quá trình thu thập dữ liệu nghiên cứu
Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới tồn thể gia đình, các thầy cơ
Trang 3MUC LUC
DAT VAN DE
Chuong 1: TONG QUAN
1.1 Tình hình bệnh lao trên thê giới và Việt Nam 1.2 Các đặc điểm cơ bản của bệnh lao
1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn lao và cơ chế bệnh sinh 1.2.2 Phân loại bệnh lao
1,3 Triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh lao I.3.1 Triệu chứng lâm sàng
1.3.2 Can lam sang
1.4 Một số đặc điểm về được động học và dược lực học của Rifampicin, isoniazid va pyrazinamid
1.4.1 Rifampicin
1.4.2 Pyrazinamid 1.4.3 Isoniazid
1.4.4 Cơ sở dược lý học của các thuốc trong điều trị lao
1.5 Nghiên cứu ứng dụng định lượng nịng độ 3 thuốc chống lao trong máu
1.5.1 Dai cuong về phân tích các thuốc trong dịch sinh học 1.5.2 Các nghiên cứu về phân tích nồng độ 3 thuốc chống lao trong máu
Chương 2: ĐƠI TƯỢNG, PHƯƠNG TIEN VA
Trang 42.1 Đơi tượng nghiên cứu
2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ 2.1.2 Số lượng bệnh nhân nghiên cứu 2.2 Vật liệu và phương tiện nghiên cứu
2.2.1 Thuốc nghiên cứu
2.2.2 Máy mĩc thiết bị
2.2.3 Nguyên liệu, hĩa chất dung mơi 2.2.4 Dụng cụ lấy mẫu và vận chuyển mẫu
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu
2.3.2 Mơ tả phương pháp nghiên cứu nơng dé RMP, INH và PZA trong huyết tương bệnh nhân
2.3.3 Phân tích các dữ liệu thu được từ nhĩm BN nghiên cứu
2.3.4 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
Chương 3: THỰC NGHIEM, KET QUA VA BAN LUAN 3.1 Thâm định phương pháp định lượng:
3.1.1 Độ chọn lọc của phương pháp
3.1.2 Xây dựng đường chuẩn
3.1.3 Giới hạn định lượng dưới (LLOO) 3.1.4 Độ đúng, độ chính xác
3.2 Nơng độ RMP, PZA và INH trong huyết tương bệnh nhân:
3.2.1 Đặc điểm chung của nhĩm nghiên cứu
3.2.2 Nơng độ các thuốc trên bệnh nhân lao phối
3.2.3 Phân tích 1 số yêu tổ liên quan đến nồng độ RMP,
Trang 53.3 Bàn luận về nơng độ các thuốc chỗng lao trong huyết tương bệnh nhân lao phổi
KẾT LUẬN KIEN NGHI
TAI LIEU THAM KHAO
CAC PHU LUC
Phụ lục 1: Phiếu theo dõi bệnh nhân nghiên cứu Phụ lục 2: Danh sách bệnh nhân nghiên cứu Phụ lục 3: Sắc ký d6 cia RMP, PZA va INH
40
Trang 6DANH MUC NHUNG CHU VIET TAT
AFB - Truc khuan bén véi acid (khang acid) ( Acid Fast Bacilli)
ALT - Alanin aminotransferase
AST - Aspartat transaminase
Cmax Nong d6 thuéc tối đa trong huyết tương
CTCLQG - Chương trình chống lao quốc gia
DOTS - Hĩa trị liệu ngắn ngày cĩ giám sát trực tiếp (Directly Observed Therapy Short course) E, EMB - Ethambutol FDA - Co quan quản lý Thực phẩm — Duge pham Mỹ (Food and Drug Administration) FDC - Thuốc viên hỗn hop cé dinh liéu (Fixed Dose Combination) H, INH - Isoniazid HPLC - Sắc ký lỏng hiệu nang cao (High Performance Liquid Chromatography)
HQC - Mẫu thâm định cĩ nồng độ cao
Trang 7DANH MUC CAC BANG TRONG KHOA LUAN
Trang Bang 1.1 Tac dung diệt khuẩn sớm và tiệt khuẩn của các thuốc chong lao 12 Bang i.2 PAE chia cac thuốc chống lao chinh doi voi Miuberculosis 13
Bang 2.1 Chuong trình pha động trong định lượng RMP và PZA 23 bằng phương pháp HPLC
Bảng 2.2 Khoảng nơng độ của các thuốc trong điều trị 24 Bảng 3.I Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) của phương pháp 29 Bảng 3.2 Xác định độ đúng, độ chính xác trong ngày 30
Bảng 3.3 Xác định độ đúng, độ chính xác khác ngày 3]
Bảng 3.4 Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân trước điều trị 32
Bảng 3.5 Khoảng cân nặng của bệnh nhân SKU
Bảng 3.6 Xét nghiệm chân đốn lao phổi của bệnh nhân 33
Bang 3.7 Dạng thuốc bệnh nhân sử dụng 34
Bảng 3.8 Liều thuốc sử dụng trên lâm sàng 34
Bang 3.9 So sánh nơng độ RMP, PZA và INH trung bình 40
Trang 8DANH MUC CAC HINH TRONG KHOA LUAN
Hình 3.1 Tương quan nồng độ chuẩn - diện tich pic PZA Hình 3.2 Tương quan nồng độ chuẩn - diện tích pic RMP Hình 3.3 Tương quan nồng đệ chuẩn - diện tích pic INH
Hình 3.4 Nồng độ RMP huyết tương bệnh nhân ở thời điểm 2h Hình 3.5 Nơng độ PZA huyết tương bệnh nhân ở thời điểm 2h Hình 3.6 Nơng độ INLI huyết tương bệnh nhân ở thời điểm 2h
Hình 3.7 Tương quan liệu RMP - nồng độ RMP huyết tượng
Hình 3.8 Tương quan liêu PZA — nơng độ PZA huyết tương Hình 3.9 Tương quan liêu INH - nồng độ INH huyết tương
Trang 28
Trang 9DAT VAN DE
Lao là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, phổ biến Bệnh do vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) gây ra Cơ quan chịu tác động phơ biến nhất của vi khuẩn lao là phối Khi người nhiễm lao hắt hơi, khạc nhỗ hoặc nĩi chuyện, vi khuân lao theo đĩ xâm nhập vào khơng khí, từ đĩ cĩ thê gây lây nhiễm cho người khác Các vị trí khác cĩ thể gây bệnh của vi khuẩn lao là xương, khớp, hạch và não [40]
Năm 1993, bệnh lao vẫn là bệnh nguy hiểm Theo WHO, lao là mơi đe dọa lớn trên tồn cầu về vấn đề sức khỏe [34], [41] Năm 2007, tồn thế giới cĩ 9.27 triệu ca lao được phát hiện, trong đĩ 55% là ở châu A Việt Nam là một
nước cĩ số người mắc lao cao, năm 2007 cả nước cĩ 192.000 bệnh nhân lao
trong đĩ 150.000 trường hợp lao mới [39] Theo số liệu của chương trình chong lao quoc gia, ty lệ lao phối mới ở nước ta hiện nay là 67/100.000 dân [2]
Trong diéu tri bénh lao, héa tri ligu la vi khi quan trọng đê đảm bảo bệnh nhân được điều trị khỏi bệnh và cắt nguồn lây ra cộng đồng Đề điều trị bệnh lao, tổ chức y tế thế giới đã phát triển và hồn thiện liệu pháp điều trị ngăn ngày cĩ giám sát trực tiếp (DOTS) Phác đồ điều trị lao mới bao gồm 2 tháng dung isoniazid, rifampicin, pyrazinamid va ethambutol Sau do, bénh nhan điều trị duy trì 4 thang bang isoniazid va rifampicin Tuy nhiên, ở Việt Nam, các thuốc được điều trị đầu tiên được thay đổi thành rifampicin, isoniazid, pyrazinamid va streptomycin [37]
Vi khuẩn lao kháng thuốc hiện nay đang cĩ xu hướng gia tăng Vi khuẩn lao kháng cả RMP và INH được gọi là lao đa kháng [39] Vi khuẩn lao kháng
Trang 10nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng tới kết quả trong điều trị như: chất lượng thuốc khơng đảm bảo, khơng tuân thủ điêu trị, sử dụng thuốc chưa hợp lý trên lâm sàng Nơng độ thuốc chống lao trong máu cĩ liên quan chặt chẽ đến hiệu quả điều trị thực tế Để đánh giá chính xác được việc điều trị cĩ đạt yêu cầu hay khơng, việc định lượng nồng độ thuốc trong máu bệnh nhân là một yêu
cau cần thiết được đặt ra, từ đĩ đưa ra những khuyên cáo nhăm nâng cao chật
lượng điều trị trên lâm sàng Mục tiều nghiên cứu:
1.Thdém định quy trình HPLC trong định lượng nơng độ 3 thuốc isoniazid, rifampiein và pyrazinamid trong huyết tương bệnh nhân
Trang 11Chuong I
TONG QUAN
1.1 TÌNH HÌNH BỆNH LAO Ở VIỆT NAM VA TREN THE GIOI
Trong lịch sử sự ra đời của thuốc chống lao cĩ hiệu lực cao trong
khoảng thập kỷ 60-70 đã giúp cho tình hình bệnh lao giảm đi, nhưng những năm gần đây bệnh lao đang quay trở lại và trở thành bệnh cĩ tỷ lệ mắc cao Theo WHO (2003) mỗi năm sẽ cĩ khoảng 3 triệu người chết và 9 triệu người mắc lao mới [37] Nĩ được coi là bệnh cĩ tính chất xã hội đặc biệt ở các nước đang phát triển Khoảng 95% những trường hợp lao mới và 99% những trường hợp tử vong do lao là từ những nước đang phát triển Những nguyên nhân gia tăng bệnh lao hiện nay bao gồm:
- _ Sự gia tăng số bệnh nhân mắc HIV làm tăng số bệnh nhân mắc kèm bệnh lao
- Gia tang tinh trang di dan từ nơi cĩ tỷ lệ mặc lao cao tới những nước đang phát triển, nơi trước đây cĩ tỷ lệ mắc lao thấp
- _ Sự bùng nỗ dân số làm số lượng bệnh nhân tuyệt đối tăng
- _ Sự xuất hiện nhiều chủng vi khuân lao kháng thuốc,
- _ Hoạt động chương trình chồng lao cịn kém hiệu quả [6]
Cùng với 3.2 triệu ca lao, Đơng Nam Á là khu vực cĩ tỷ lệ mắc lao và số ea lao đứng thứ 2 trên thế giới chỉ sau châu Phi [34] Việt Nam nằm trong danh sách các nước cĩ số ca mắc lao cao trên thế giới, đứng thứ 12/23 nước cĩ sơ lượng bệnh nhân lao cao trên tồn cầu Tại Việt Nam số ca lưu hành
năm 2007 là 192000 ca trong đĩ cĩ 150000 ca trường hợp lao mới [6], [8]
Trang 12cần kéo đài, đều đặn và cĩ kiểm sốt Trước tình trạng này, trong 2 năm 1994 đến 1995, tổ chức y tế Thế giới đã phát triển và hồn thiện liệu pháp điều trị ngắn ngày cĩ giám sát trực tiếp (DOTS) [26] Cũng vào năm 1995 chiến lược
DOTS được triển khai ở Việt Nam Chiến lược DOTS được áp dụng tại hầu
hết các tỉnh ở Việt Nam do chương trình chống lao quốc gia (NTP) thực hiện Đến năm 2005 Việt Nam đã cơ bản phát hiện được trên 70%% trường hợp lao dương tính khi xét nghiệm soi đờm và chữa khỏi trên §5% các trường hợp
này [12], [26]
Tuy nhiên, cùng với sự gia tăng số bệnh nhân lao trên thế giới, những số liệu gần đây cho thấy tỉ lệ số bệnh nhân lao tái phát và thất bại điều trị cĩ xu hướng gia tăng Một vấn để nữa cần quan tâm là hiện nay cĩ tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn lao Theo I khảo sát cắt ngang khác tại miền Bắc, cĩ 21% bệnh nhân lao mới kháng với Isoniazid, 3% kháng với rifampicin, 19.1% khang yoi streptomycin va 4.3% khang với ethambutol Tỷ lệ lao đa kháng ở các bệnh nhân điều trị lại cao hơn khoảng 4 lần so với ở các bệnh nhân mới [39]
1.2 CAC DAC DIEM CO BAN CUA BỆNH LAO: 1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn lao và cơ chế bệnh sinh:
Vị khuẩn lao gây bệnh cho người thuộc họ Mycobacterium
Trang 13Vi khuan lao hiéu khi Nhiét d6 thich hgp 1a 37 d6 C Vi khuan phat
triển chậm, thường sau 1-2 tháng mới cĩ khuẩn lạc Thời gian nhân đơi của vi khuẩn lao là từ 16-20 giờ, chậm hơn so với nhiều loại vi khuân khác [28] Vi khuân lao cĩ sức đề kháng cao với các yếu tố lý hĩa Trong đờm âm vi khuân cĩ thể tồn tại trong vịng một tháng Trực khuẩn lao khơng cĩ nội độc tố và ngoại độc tố, nhưng độc lực của vi khuân là tập hợp của nhiều yếu tơ trong đĩ vếu tơ sợi và lớp sáp ở vách tế bào cĩ ý nghĩa quan trọng [4]
Đờm của bệnh nhân là nguồn lây chính Khi bệnh nhân ho khạc trong những hạt nước bọt của bệnh nhân cĩ chứa nhiều vi khuẩn lơ lửng trong khơng khí, người lành hít phải những hạt này vào phối cĩ thể mắc bệnh Lao chủ yêu lây qua đường hơ hap Ngồi ra cĩ thé lây qua da hay đường tiêu hĩa [4] [20]
Khi cơ thể bị vi khuẩn xâm nhập gọi là nhiễm lao Khoảng 95% người nhiễm lao khơng cĩ triệu chứng trên lâm sàng Nếu vi khuẩn vượt qua sự khống chế ở hạch rốn phổi, chúng sẽ vào máu đến các cơ quan gây ra tổn thương ban đầu gây ra tình trạng viêm trong túi phế nang, tình trạng này gọi là lao sơ nhiễm Vi khuẩn lao gây viêm phế nang hoại tử, tổn thương cĩ thé là các đám thâm nhiễm cĩ đường kính 2-3 cm hoặc nốt 5- 7 em thường gặp ở thùy trên phổi hoặc rải rác cả hai phổi Bã đậu nhuyễn hĩa từ trung tâm của tên thương làm thành đờm thơng với phế quản thốt ra ngồi tạo thành các
hang lao Tơ chức xơ phát triển từ ngồi bao bọc quanh hang gây biến dạng
các hang lao, biển dạng phế quản và phát triển vào các tổ chức lân cận như tim, phế quản [20]
Đa phân những tổn thương sơ nhiễm cĩ thể tự mất đi hoặc đẻ lại chất bã đậu cĩ lắng đọng dần calci, quá trình này gọi là quá trình vơi hĩa Trong tồn thương sơ nhiễm đã vơi hĩa vẫn tồn tại một số vi khuẩn lao khơng hoạt
Trang 14giữa khả năng chống đỡ của cơ thể với số lượng và độc tính của vi khuẩn lao sẽ dẫn đến xuất hiện bệnh lao sau nhiễm lao Như vậy cĩ 2 khả năng dẫn đến bệnh lao: vi khuẩn lao ở ngồi xâm nhập vào gây bệnh hoặc vi khuẩn lao trong tổn thương sơ nhiễm tái hoạt động gây bệnh lao [2] [20]
1.2.2 Phân loại bệnh lao:
Cĩ nhiều cách phân loại bệnh lao:
- Phân loại theo cơ quan bị tổn thương: tùy theo vị trí co thé bi tén thương: lao phổi, lao màng phối, lao hạch, lao màng não
- Phân loại theo xét nghiệm đờm: + lao phổi AFB dương tính + lao phơi AFB âm tính - Phân loại dựa theo điều trị:
+ lao mới: bệnh nhân ở thời điểm được chẳn đốn chưa điều trị lao trước đây hoặc đã điêu trị thuốc < 1 tháng
+ lao tái trị: baư gồm các bệnh nhân sâu:
Điều trị lại sau bỏ trị: bệnh nhân khơng dùng thuốc > 2 tuần
trong quá trình điều trị, nay quay lại điều trị
Tái phát: bệnh nhân đã được diều trị lao đủ thời gian và được
thấy thuốc xác định là khỏi bệnh nay mắc bệnh trở lại AFB đương tính
Thất bại: bệnh nhân cịn AFB dương tính trong đờm từ tháng điều trị thứ 5 trở di,
+ Lao trên bệnh nhân HIV: những bệnh nhân bị nhiễm HIV dẫn
đến mắc lao
- Phân loại dựa vào độ tuổi: lao ở người lớn, lao ở trẻ em cách phân loại này thường kèm theo cơ quan tơn thương Ví dụ: lao phổi người lớn lao màng não ở trẻ em
Trang 15+ Lao phổi cấp tính: lao kê, phế viêm lao, phế quản phế viêm
lao đây là những thể lao nặng, cĩ triệu chứng lâm sàng rằm rộ cấp tính, tỉ lệ
tử vong cao
+ Lao phối mạn tính: cĩ hang lao, các triệu chứng âm thầm, im lặng [2], [9]
1.3 TRIEU CHUNG LAM SANG, CAN LAM SANG CUA BENH LAO 1.3.1 Triéu chirng lam sang:
* Triéti chifis toan than:
- Sốt nhẹ kéo dài, sốt về chiều hoặc đêm, cĩ thể sốt cao rét run
- Gây, sút cân Mệt mỏi chán ăn Bệnh tiến triển kéo dài, người bệnh suy kiệt, thiếu máu
- Ra mồ hơi về đêm *Triệu chứng về hơ hấp:
- Ho kéo dài là triệu chứng hay gặp nhất, cĩ thể ho khan hoặc ho cĩ
đờm
- Ho ra máu: cĩ thể ít máu lẫn đờm hoặc đơi khi co ho ra mau - Đau ngực âm ỉ vùng tơn thương Cĩ thể cĩ khĩ thở
- Khám phổi thấy ran âm, ran nỗ vùng tồn thương hoặc khơng thấy gì đặc biệt [20] [2]
1.3.2 Cận lầm sàng:
Các xét nghiệm thường được dùng trong chẩn đốn xác định lao bao
gồm:
- Nhuộm soi đờm trực tiếp trong mẫu bệnh phẩm: nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelsen Làm xét nghiệm ít nhất 3 lần trong 3 ngày liên tiếp nếu cho kết quả AFB dương tính thì kết luận mắc bệnh lao
- Nuơi cấy trong mồi trường Loeweinstein sau 4-§ tuân nều cĩ khuẩn
Trang 16- Phản ứng da Tuberculin: phản ứng tuberculine dương tính mạnh giúp hướng tới chân đốn lao phổi ở trường hợp cĩ tơn thương thâm nhiễm gợi ý lao trên X-quang nhưng AFB âm tính hoặc chân đốn lao tiềm ân nếu khơng rõ tốn thương X-quang
- Chụp X quang phơi thắng, nghiêng trái và chụp CT Scan khi cĩ gợi ý trên lâm sàng nhưng X quang phổi khơng rõ Các dạng tên thương thường gặp bao gồm: nĩt, đám thâm nhiễm, hang u lao, nốt vơi hĩa, đường mờ (dải xơ) [2]
- Xét nghiệm máu: hầu hết đều bình thường Một số trường hợp cĩ thê thấy thiếu máu nhẹ Số lượng bạch cau lympho tang, toc d6 máu lắng tăng Tuy nhiên những chỉ số này khơng đặc hiệu
- Một sơ phương pháp mới: MGIT, xét nghiệm PCR, kỹ thuật miễn địch ELISA [2] I4]
+ MGTIT là phương pháp nuơi cấy trong ống chỉ điểm sự phát
triển của vi khuân lao để phát hiện sự cĩ mặt hay khơng của vi khuẩn lao
trong bệnh phẩm Bệnh phẩm của bệnh nhân sau khi được lấy sẽ được cơ lập và nuơi trong mơi trường thích hợp và theo dõi để phát hiện sự cĩ mặt hay khơng của vi khuẩn lao bằng đèn UV Quá trình nuơi cấy cĩ thể kéo đài 42- 56 ngày [29]
+ PCR: là kỹ thuật phát hiện vi khuẩn lao ở những bệnh phẩm cĩ
chứa rất ít vi khuẩn (1-3 vi khudn/1 ml) Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý
ADN tách ra từ bệnh phẩm được nhân lên bằng PCR Ưu điểm của phương pháp này là rất nhạy nhưng ngay cả những trường hợp chỉ cĩ xác vi khuân cũng cho kết quả đương tính Do đĩ chỉ thực hiện đối với những mẫu đờm cho kết quả soi nhuộm trực tiếp âm tính [29]
Trang 171.4.1 Rifampicin:
* Duoc dong hoc:
Rifampicin hấp thu nhanh qua đường tiêu hĩa Sau khi uống thuốc 2-4h đạt nơng độ đỉnh trong huyết tương là 7-9 pg/ml sau khi uống liều 600 mg Thức ăn làm chậm và giảm hấp thu thuốc Liên kết với protein huyết tương là §0% Thuốc phân bố rộng rãi vào các mơ và dịch của cơ thể, đạt nơng độ cao ở hoạt dịch, địch màng bung va mang phổi Thuốc qua được nhau thai và
sữa mẹ Thuốc chuyển hĩa qua gan bằng quá trình acetyl hĩa thành chất
chuyên hĩa cịn hoạt tính (25-O-deacety] rifampicin) Rifampicin thải trừ qua gan, mật và trải qua chu trình ruột-gan Khoảng 65% liều dùng thải trừ qua phân, 30% qua nước tiểu, cịn lại thải qua mồ hơi, nước bọt, nước mắt Nửa đời thải trừ của rifampicin là 2-Š giờ, nhưng khi dùng lặp lại nửa đời thải trừ giảm xuống 1-3 giờ [7], [13]
* Dược lý và cơ chế tác dụng:
Rifampicin là 1 kháng sinh phổ rộng cĩ tác dụng tốt trên nhiều vi khuẩn Gr (+) và Gr (-) Rifampicin cĩ tác dụng tốt trên các vi khuân họ Mycobacterium dac biét 1a Mycobacterium tubercuolosis va vi khuan phong Mycobacterium laprae Nơng độ ức chế tối thiểu với trực khuẩn lao là 0.1- 2.0 ug/ml Ngồi ra rifampiein cĩ tác dụng tốt trên lậu cầu, não mơ cầu, liên cầu kể cả chủng kháng methicillin, Haemophilus influenzae [16]
Co ché téc dung: rifampicin gin vào tiểu don vi 8 cla ARN-polymerase tạo thành phức hợp bên vững, làm sai lệch thơng tin của enzym này, do đĩ ức chế sự khởi đầu quá trình tổng hợp ARN mới [3]
Vi khuẩn lao kháng thuốc là do sự thay đổi cấu trúc ở tiểu don vi B của enzym ARN-polymerase Rifampicin khơng kháng chéo với các thuốc chống lao khác nhưng khi sử dụng đơn độc và lạm đụng dẫn đến tăng tỷ lệ kháng
Trang 1810
lao cĩ trực khuẩn kháng rifampicin [12] Do d6 str dung rifampicin can cé su giám sát nghiêm ngặt để đảm bào hiệu quả điều trị
Chỉ định điều trị: dùng đề điều trị mọi thê lao (phối hợp với các thuốc khác theo phác đồ); điều trị bệnh phong: phịng và điều trị viêm màng não do Haemophilus influenzae, diéu trị nhiễm khuan nang do Staphylococus khang methicilin
1.4.2 Pyrazinamid: * Dược động học:
Pyrazinamid hap thu tốt qua đường tiêu hĩa Nơng độ đỉnh trong huyết tương sau 2 giờ là 33 wug/ml sau khi uống 1.5 g va 59 ug/ml sau khi uống 3g Thuốc phân bố tốt vào các mơ và dịch của cơ thể kể cả gan phổi, địch não tủy, qua được nhau thai và sữa mẹ Tỷ lệ gắn với protein huyết tương là 10% Thuốc chuyển hĩa ở gan và thải trừ ở thận, chủ yếu do lọc ở cầu thận Thời gian bán thải 9-10 gid [7], [13]
š Đizợe lý hoe và eỡ chê táe đụng:
Pyrazinamid là thuốc được sử dụng chủ yếu trong 8 tuần đầu của hĩa trị liệu lao Pyrazinamid cĩ tác dung tiéu diét M tuberculosis nhung lại khơng cĩ tác dụng với các À4ycobacferiưmn khác Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu là đưới 20 \ig/ml Thuốc cĩ tác dụng tốt ở pH từ 5 - 5.5, tác dụng yếu ở pH trung tính
Thuốc tác dụng với mọi thê lao nhưng tốt nhất là các vi khuẩn lao tồn
Trang 1911
Chi định: điều trị các thể lao mới hoặc tái trị trong phối hoặc ngồi phổi Phối hợp với các thuốc khác trong giai đoạn tắn cơng ban đâu [3]
1.4.3 Isoniazid:
* Lược động học:
Isoniazid hấp thu nhanh và hồn tồn qua đường tiêu hĩa và tiêm bắp Sau khi uống thuốc 1-2 giờ, nồng độ đỉnh trong huyết tương là 3-7 Iig/ml Thức ăn làm giảm hắp thu thuốc Thuốc phân bố vào các cơ quan, các mơ và dịch của cơ thể Nồng độ thuốc tăng lên trong dịch não tủy khi màng não bị viêm Thuốc thấm được vào hang lao, qua được nhau thai và sữa mẹ
Thuốc chuyển hĩa qua gan bằng phản ứng acetyl hĩa tạo thành acid isonicotinic và acetyl isoniazid Tốc độ chuyển hĩa acetyl phụ thuộc nhiều vào yếu tơ đi truyền (người châu Á cĩ tốc độ chuyển hĩa nhanh) Thuốc được thải trừ qua thận 75-95% trong 24 giờ đầu dưới dạng đã chuyền hĩa [7] [37]
* Dược lý học và cơ chế tác dụng:
Isoniazid cĩ tác dụng đặe hiệu trên vi khuẩn laơ M.tuibereulưSis va ếe Mycobacterium khác Isoniazid điệt khuẩn phụ thuộc nồng độ thuốc ở vị trí tên thương và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn Nồng độ ức chế tối thiểu với trực khuẩn lao là 0.025 — 0.05 ug/ml Thuốc tác dụng tốt với mọi dạng lao trong và ngồi phổi, kế cả thể cắp và thể mạn
Cơ chế: thuốc ức chế tổng hợp acid mycolic là thành phần chủ yếu tạo
nên lớp vỏ phospholipid của vi khuẩn lao Một số tác giả khác cho rằng
isoniazid tạo phức chelat với đồng và ức chế cạnh tranh với nicotinamid và pyridoxin làm rối loạn chuyên hĩa ở trực khuẩn lao
Trang 20Chi dinh:
12
- Diéu tri lao: phối hợp với các thuốc khác theo phác đồ
- Dự phịng lao: chỉ định dự phịng cho nhĩm đối tượng cĩ nguy cơ cao({3], [13]
1.4.4 Cơ sở được lý học của các thuốc trong điều trị lao:
Trong quá trình sử dụng thuốc lao, mỗi thuốc cĩ tác dụng ưu thể tai | vị trí và tại 1 thời điểm nhất định Theo Miechison DA (1992) [24], tác dụng diệt khuẩn sớm và tiệt khuẩn của các thuốc chơng lao được thê hiện trong bang 1.1
Bang 1.1 Tác dụng điệt khuẩn sớm và tiệt khuẩn của thuốc chống lao Tác dụng điệt khuân sớm Tác dụng tiệt khuân Tác dụng đi với
Thuốc | Mức Tỉ lệ âm tính? Mức | Tilệ tái phát | quần thể vi khuẩn
độ (nuơi cấy sau 2 tháng) độ sau điều trị*
I+ 29% trong tê bào
INH 3+ 49% ngoai té bao
trong chất bã đậu
3+ 8% trong tê bào
PZA 1+ 64% ngồi tế bảo (mơi trường viêm) trong tế bào RMP 21 73% 34 3% ngoai té bao trong chất bã đậu
* tỉ lệ âm tính và tái phát khi điều trị bằng đơn trị liệu
I(+) mức độ yếu, 2(+) mức độ trung bình, 3(t+) mức độ mạnh
EBA (early bactericial activity) hay tác dụng diệt khuẩn sớm của thuốc thể hiển tốc độ tiêu diệt vi khuẩn nhanh hay chậm của thuốc trong những ngày đầu điều trị INH là thuốc cĩ EBA mạnh nhất trong 3 thuốc và cĩ vai trị
XI CS AC SE
Trang 2113
ngày đầu tiên điều trị Tuy nhiên EBA của INH lớn nhất trong 2 ngày điều trị
đầu tiên; nhưng những ngày sau thì giảm đi và sau 14 ngày tỉ lệ vi khuan bị
tiêu diệt khơng lớn hon so voi RMP va PZA [17]
INH cé vai trị tiêu diệt quần thẻ vi khuẩn phát triên nhanh cịn RMP cĩ EBA kém hơn nhưng cĩ vai trị chủ yếu tiêu điệt những vi khuẩn chuyền hĩa chậm PZA cĩ hệ số EBA ở mức độ trung bình nhưng cĩ tác dụng diệt khuẩn cao với những vi khuẩn trong đại thực bào và mơi trường viêm cĩ pH thấp
Tac dung hau khang sinh (PAE- post antibiotic effects) 14 kha nang tre chế sự phát triển của vi khuẩn sau khi ngừng tiếp xúc của vi khuẩn với kháng
sinh Thuốc cĩ PAE kéo dài cho phép kéo dài khoảng cách đưa thuốc nhưng
khơng mất đi hiệu lực điều trị Đây là cơ sở cho việc thiết lập các phác đồ điều trị cách quãng, Theo Chan CY và cộng sự (2001) [15] sự thay đổi PAE của các thuốc chống lao khi dùng đơn độc và dùng phối hợp như bảng ¡.2
Bang 1.2 PAE cua cac thuốc chống lao chính đối với M.tuberculosis (sau 2h tiếp xúc với thuốc đơn độc hoặc phối hợp)
Thuốc MIC Nơng độ tiếp | PAE Phối hợp PAE
Trang 2214
Việc phối hợp các thuốc chống lao làm tăng PAE so voi str dụng thuốc chống lao đơn độc Dựa vào thơng số PAE đối với vi khuẩn lao giúp cho việc tính tốn sử dụng SHRZ„ HRZE hàng ngày hoặc 2 - 3 lần/ tuần Dựa trên các thơng số trên, phác đồ 2HR.Z/4RH là tối ưu cho những trường hợp lao mới và nhiễm chủng vi khuẩn nhạy cảm với các thuốc chống lao Tuy nhiên theo khuyến cáo của WHO, ở các quốc gia cĩ thu nhập trung bình nên dùng 4 thuốc trong giai đoạn tấn cơng (bỗ sung ethambutol hoặc streptomycin) để giảm tỷ lệ kháng thuốc Trong giai đoạn duy trì cĩ thể dùng RMP và INH hàng ngày hoặc cách ngày trong 4 tháng [14]
1.5 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG NỊNG ĐỘ 3 THUĨC
CHĨNG LAO TRONG MÁU:
1.5.1 Đại cương về phân tích các thuốc trong dịch sinh học:
Trong nghiên cứu sinh khả dụng và dược động học của thuốc, việc phân tích các thuốc trong dịch sinh học (huyết tương, dịch não tủy) cĩ vai trị
quyết định, từ đĩ the đối nằng độ thuốc trơng điều trị và đưa ra điều chỉnh
hoặc chỉ định dùng thuốc hợp lý trên lâm sàng Các phương pháp phân tích trong dịch sinh học dựa trên các kỹ thuật hĩa lý và sinh học hiện đại Các phương pháp phân tích sinh học phải được thâm định để đảm bảo kết quả thu được chính xác và tin cậy [I1]
Cĩ rất nhiều kỹ thuật để phân tích dịch sinh học Các kỹ thuật hay dùng
là sắc ký, điện di, phĩng xạ miễn dịch Nhưng phương pháp được dùng phỏ
biển nhất là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Kỹ thuật này cĩ ưu điểm là cĩ độ chọn lọc tốt, độ nhạy, độ chính xác cao và cĩ thể tự động hĩa được Đã cĩ rất nhiều đẻ tài sử dụng phương pháp HPLC để phân tích nồng độ các thuốc chống lao trong máu [9] [10]
Trang 2315
pháp đĩ để đảm bào phương pháp đĩ đạt yêu cầu khi ứng dụng phân tích các
mẫu thực tế Cĩ 3 mức độ về thâm định phương pháp trong dịch sinh học:
- Thẩm định đây đủ: áp dụng với phương pháp PTSH mới, thuốc mới - Thâm định 1 phần: khi cĩ sự thay đổi trong phương pháp PTSH đã được thâm định Khi tiễn hành cĩ thể chỉ xác định tính đúng, tính chính xác hoặc phải làm lại hết các tiêu chí trong thẩm định đầy đủ
- Thâm định chéo là so sánh các thơng số thâm định khi 2 hay nhiều
phương pháp phân tích được sử dụng để cung cấp dữ liệu cho cùng một nghiên cứu hoặc cho các nghiên cứu khác Thẩm định chéo thường dùng để xác lập độ tin cậy giữa các phịng thí nghiệm khác nhau hoặc các phương pháp phân tích khác nhau [1], [18]
1.5.2 Các nghiên eứu về phân tích nồng độ 3 thuốc chống lao trong máu: Trong điều trị, đa số các bệnh nhân cĩ đáp ứng tốt với phác đồ điều trị khi được dùng đúng và day đủ Mặt khác, những nghiên cứu về dược động học gần đây cho thấy cĩ sự đao động lớn giữa các cá thể về nơng độ RMP, INH và PZA: đặc biệt là RMP [21], [22] [33] [35] Trong lâm sàng, cĩ một số trường hợp nồng độ thuốc trong máu của bệnh nhân dưới nồng độ điều trị
đối với RMP (nơng độ đạt 8-24 mcg/m]) tại thời điểm sau 2h dùng thuốc, đối với INH (nồng độ đạt 2-5 mcg/ml) Kết quả định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương giúp cho thầy thuốc cĩ thể chỉnh liều, lựa chọn loại thuốc để đảm
bảo đạt nồng độ điều trị
Tuy nhiên, khơng phải tắt cả các bệnh nhân đều được giám sát nồng độ thuốc trong máu để tối ưu hĩa trong điều trị Theo Peloquin (2002) [25], những đối tượng cần phân tích nồng độ thuốc trong huyết tương đề điều chỉnh liều: bệnh nhân đáp ứng điều trị kém sau 4 tuần điều trị, bệnh nhân lao phối
hợp HIV và một số trường hợp lao phỏi thất bại hoặc tái phát Thời điểm
,
huơc Tại Việt
Trang 2416
Nam, đã cĩ một số đề tài triển khai phân tích nồng độ thuốc lao trong huyết
tưỡng ở một số bệnh nhân từ đĩ cĩ những điều chỉnh phù hợp Triển khai dé
Trang 2517
Chuong 2
ĐĨI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2,1 ĐĨI TƯỢNG NGHIÊN CỨU:
Các bệnh nhân cĩ chẩn đốn lao phổi người lớn điều trị nội trú tại khoa
Hơ hấp bệnh viện Bạch Mai và khoa À5 bệnh viện TWQ@B 168 từ tháng 04
đến tháng 05 năm 2010
2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ: Tiêu chuẩn lựa chọn:
- Tuơi từ 18 trở lên
- Cĩ chân đốn lao phổi, lao màng phổi dựa vào một trong các tiêu + AFB đờm hoặc dịch phé quần dương tính
+ Cĩ tơn thương gợi ý lao phơi màng phối trên X quang và/ hoặc cắt lớp vi tính phổi
+ Hình ảnh mơ bệnh học cĩ tổn thương viêm lao trên các bệnh phẩm lấy qua sinh thiết phổi, phế quản, sinh thiết màng phổi
+ PCR-BK và/ hoặc cây MGIT tim vi khuan lao dương tính ở các bệnh phẩm dịch màng phổi và/ hoặc dịch phế quản
- Chức năng gan, thận bình thường khi vào viện, biểu hiện bằng chỉ số sinh hĩa mau (AST, ALT, creatinin, bilirubin, ure,glucose) trong gidi han bình thường, protein va glucose niéu am tinh
Trang 26- Điều trị nội trú tại khoa hơ hấp Bệnh viện Bạch Mai và khoa A5 bệnh viện TWQB 108
Tiêu chuẩn loại trừ:
—_ Phụ nữ cĩ thai và cho con bú - HIV(+)
- Mac cdc bệnh mãn tính khác như xơ gan, đái tháo đường 2.1.2 Số lượng bệnh nhân nghiên cứu:
Cỡ mẫu ước tính số lượng bệnh nhân đáp ứng được yêu câu của nghiên
cứu từ 20-30 bệnh nhân
Tuy nhiên vì thời gian và điều kiện khơng cho phép nghiên cứu chỉ dừng lại ở cỡ mẫu thực tế là 9 bệnh nhân
2.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.2.1 Thuốc nghiên cứu:
Dựa theo thuốc sử dụng thực tế tại khoa Hơ hấp bệnh viện Bạch Mai và khoa AŠ bệnh viện Trung ương quân đội 108
Rifampicin 150 mg/300 mg Isoniazid 50 mg/150 mg Pyrazinamid 500 mg
Viên phối hợp RH: 150 mg RMP+ 75 mg INH
Vién phoi hop Turbezid: 150 mg RMP +75 mg INH +400 mg PZA
2.2.2 Máy mĩc thiết bị:
Nghiên cứu sử dụng hệ thống máy mĩc thiết bị của phịng thí nghiệm bộ mơn Dược lâm sàng, trường đại học Dược Hà Nội
- Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu nâng cao Spectra system * (Thermo Finigan, Mỹ) gồm:
Trang 2719
+ Bộ phận tiêm mẫu tự động autosampler và lị cột AS3000
+ Detector UY 6000LP, + Phần mém ChromQuest 4.0 - Máy l¡ tâm Hermle Z200A (Đức) - Máy siêu âm Branson (Mỹ)
- Cân phân tích Presia XB220A (Thụy Sỹ)
- Tủ lạnh sâu -40°C SANYO (Nhật) để bảo quản mẫu huyết tương và dung dịch gốc mẹ
- Máy đo pH
- Bộ phễu lọc hút chân khơng
- Màng lọc dung mơi xenlulose aeetat Satorius đường kính lễ lọc 0.45 um
- Màng lọc mẫu Satorius sử dụng 1 lần, đường kính lỗ loc 0.45 ym - Các dụng cụ khac: pipet tu déng 200 mcl, 1000 mel, pipet thuy tinh chính xác đũa thủy tính, bình định mức 10 ml, bộ vial, insert va cdc dung cu thủy tinh khác
2.2.3 Nguyên liệu, hĩa chất, dung mơi:
- Chất chuẩn đối chiếu: RMP (hàm lượng 99.4%), INH (hàm lượng
100.1%), PZA (hàm lượng 99.2%) (Viện kiểm nghiệm thuốc TW) - Hĩa chất, dung mơi:
+ Methanol (MeOH), aeetonitril (MeCN) loại dùng cho HPL€ (Merck - Đức)
+ Natridihydrophosphat lại dùng cho phan tich (Merck - Đức) + Cinnamaldehyd (PA-Merck)
Trang 2820
+ Huyét tuong tring (Vién huyét hoc truyén mau)
+ Các hĩa chất thí nghiệm khác
2.2.4 Dụng cụ lẫy mẫu và vận chuyển mẫu: - Kim và bơm tiêm loại 5 ml str dung 1 an - Bơng cơn, băng, gạc, găng tay
- Ơng nghiệm thủy tỉnh ly tâm loại 10 ml đựng mẫu máu
- Ơng nghiệm cĩ nút và đán nhãn loại 5ml đựng mẫu huyết tương
- Bình đựng nước đá đẻ bảo quản mẫu trong quá trình vận chuyên 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu:
Nghiên cứu tiến cứu, mơ tả trên nhĩm các bệnh nhân lao phổi, lao màng phổi (bệnh nhân lao mới) được điều trị bằng ít nhất 3 thuốc RMP, PZA va INH
Tai thoi diém nghiên cứu bệnh nhân đang được điều trị bằng 3 thuốc RMP, PZA và INH > 5 ngày Dựa vào số liệu Tmax trên lý thuyết, xác định thời điểm lấy mau dé định lượng nồng độ 3 thuốc trên tại thời điểm 2h sau khi uống đồng thời cả 3 thuốc
2.3.2 Mơ tả phương pháp nghiên cứu nồng độ RMP, INH và PZA trong huyết tương bệnh nhân
2.3.2.1 Thu thập dữ liệu lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhân:
Sinh viên đã trực tiếp thu thập các dữ liệu của bệnh nhân nghiên cứu dựa trên bệnh án điều trị Các dữ liệu thu được ghi theo Phiếu theo dõi bệnh nhân nghiên cứu (phụ lục 1) bao gồm:
- Đặc điểm lâm sàng: +Tên, tuơi, giới
Trang 2921
- Phân loại thể lao: tất cả các bệnh nhân lao phổi hoặc lao màng phổi
die aoa - Ê
điều trị nội trú tại ếe khơa hơ hấp đều là bệnh nhân lã mới
- Đặc điểm điều trị: ghi nhận phác đồ điều trị bệnh nhân được chỉ định Theo quy định của chương trình chống lao quốc gia [12] [37] liều dùng của các thuốc trong giai đoạn tấn cơng như sau:
RMP:8-12 mg/kg /ngay Liều tối đa: 600 mg/ngảy [NH:4-6 mg/kg/ngày Liều tối đa: 300 mg/ngày PZA: 20-30 mg/kg/ngày
- Các chỉ số cận lâm sàng ghi trong Phiếu theo dõi bệnh nhân nghiên Cứu
2.3.2.2 Quy trình lấp mẫu, vận chuyển và bảo quản mẫu:
Đề đảm bảo tính chính xác của số liệu, sinh viên trực tiếp theo dõi việc lấy mẫu và thực hiện việc vẫn chuyên, bảo quản mẫu chặt tuân theo quy trình
sau:
- Bệnh nhân được thơng tin 1 ngày trước khi lấy mẫu
- Bệnh nhân đã điểu trị ít nhất 5 ngày Vào ngày lấy mẫu, bệnh nhân nhịn ăn sáng, uống đồng thời 3 thuốc vào 7-8 h sáng với 200 ml nước, lấy máu ở thời điêm 2h sau khi uống
- Số lượng máu cần cho mỗi mẫu là 4 ml máu tĩnh mạch Máu được
dựng trong ống chống đơng đã được tráng bằng heparin,
- Ơng nghiệm đựng mẫu được mã hĩa, dán nhãn và nút kin, boc băng
giấy bạc Các ống nghiệm được để trong phích đá vận chuyển về nơi bảo quản
Trang 302.3.2.3 Phân tích nơng độ 3 thuốc RMP, INH và PZA bằng phương pháp HPLC:
Tại thời điểm nghiên cứu, cĩ khá nhiều phương pháp và chương trình
sắc ký khác nhau để định lượng nồng độ 3 thuốc PZA, RMP và INH trong huyết tương Trong nghiên cứu này, sinh viên dùng quy trình HPLC đã được chuyền giao từ phịng thí nghiệm trung tâm trường đại học Dược Hà Nơi Quy trình gốc đã được thâm định và đạt được các yêu cầu về phân tích sinh học Dõ quá trình chuyên øiã quy trình giữa các phịng thí nghiệm khác nhau, sinh viên đã tiến hành điều chỉnh một số yếu tố cho phù hợp với điều kiện thi nghiệm và thầm định một phần để đảm bảo phương pháp đạt thu được kết quả cĩ gid tri tin cay [1], [18] Qua tinh phan tích 3 chất được chia thành 2 chương trình sắc ký: một chương trình dành cho phân tích RMP, PZA; một chương trình để phân tích INH bằng phương pháp tạo dẫn xuất hĩa trước cột là phương pháp cĩ độ nhạy cao và kết quả khá tin cậy
Xử lý mẫu:
- Mẫu huyết tương bệnh nhân được bảo quản ở tủ lạnh sâu -40°C, lấy ra
đề tan đơng trong điều kiện nhiệt độ phịng
- 500 mcl huyết tương bệnh nhân thêm 1 ml MeCN Lac xoay trong 5 phút Ly tâm 15000 vịng/phút trong 15 phút Lọc địch lọc nối qua màng lọc 0.22 mem Chia làm 2 phân: một phân phân tích PZA va RMP, phan kia dan xuất hĩa để phân tích INH
Trang 3123 Chương trình sắc ký - Chitong trình T: phần tích RMP và PZA: + Cột sắc ký: Inersil OSD-3 (250P x 4.6 mm; 5 mem) bảo vệ cột (12 x 4.6 mm; 5mem)
+ Pha động: MeCN- đệm phosphat pH 7.ŠS với tỉ lệ dung mơi như sau; Bang 2.1 Chương trình pha động trong định lượng RMP và PZA bằng phương pháp HPLC Thời gian (phút) |0 4 3 tl L2 13 MeCN (%) 5 5 50 50 5 5 Dém pH 7.5(%) | 95 95 50 50 95 95 + Lưu lượng dịng 1.3 ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 100 Hi + Bước sĩng 265 nm
+ Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phịng - Chuong trình 2: phan tich INH
+ Cột sic ky: Zorbax SB-CN
+ Lưu lượng dịng: 1.2 ml/ phút Thê tích tiêm mau 20 ul + bước sĩng 330 nm
+ Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phịng
2.3.2.4 Các tiêu chuẩn của phương pháp định luong RMP, INH va PZA da được thấm định:
Sau khi được chuyển giao quy trình định lượng 3 chất trong huyết tương băng phương pháp HPLC, trước khi chính thức sử dụng, sinh viên đã tiền hành thâm định một sĩ tiểu chuẩn cần thiết của phương pháp cho phù hợp
với yêu cầu thâm định phương pháp phân tích thuốc trong địch sinh học theo
Trang 3224
* Tính đặc hiệu của phương pháp:
Pie của các chất cĩ hình dạng rõ ràng, cân đối Tại vị trí của từng pic
trên sắc kí đồ khơng xuất hiện các pic khác khi nghiên cứu * Tính đúng: Phương pháp cĩ độ đúng cao: độ lệch chuẩn tương đối RSD < 3.5% * 1ịnh chính xác: Độ chính xác cao với độ lệch chuẩn tương déi RSD < 1% * Dé tuyén tinh:
Với mỗi chất, lập đường chuẩn với 8 nồng độ khác nhau khảo sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ từng chất
* Giới hạn định lượng đưới (LLOQ):
Tiến hành sắc ký 5 lần mẫu LLOQ của từng chất, độ đúng trung bình của các chất đều nằm trong khoảng 80-120% và cĩ độ lặp lại năm trong yêu cầu < 20% Đáp ứng của các mẫu chuẩn cao gấp trên 5 lần đáp ứng mẫu trắng
2.3.3 Phân tích các dữ liệu thu được từ nhĩm bệnh nhân nghiên cứu: Dựa trên các dữ liệu về lâm sàng, cận lâm sàng và nồng độ các thuốc trong huyết tương đề phân tích các nội dung sau :
- Mơ tả dữ liệu về nồng độ từng thuốc RMP, PZA, INH ở thời điểm 2h: giá trị trung bình nơng độ, mức độ dao động nơng độ, tỷ lệ bệnh nhân theo khoảng nơng độ Khoảng nồng độ được chia theo bảng 2.2
Trang 332
- Phan tích liên quan nồng độ thuéc RMP, PZA va INH va một số yếu tố: giới, liều từng thuốc (tính theo mg/kg cân nang)
2.3.4 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu:
Sinh viên trực tiếp tiến hành thống kê, xử lý tồn bộ số liệu nghiên cứu
Trang 3426
Chương 3
THUC NGHIEM, KET QUA VA BAN LUAN
3.1 THÁM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG:
Phương pháp định lượng RMP, PZA và INH nhu đã nêu được thâm định các chỉ tiêu sau: độ chọn lọc, độ đúng, độ chính xác, hàm đáp ứng giới hạn
định lượng của mẫu trong huyết tương
3.1.1 Độ chọn lọc của phương pháp:
- Đối với chương trình I(định lượng RMP và PZ4): chuân bị lần lượt
các mẫu sau:
+ Mẫu l1: huyết tương trắng
+ Mẫu 2: mẫu RMP trong huyết tương với nồng độ 15 ug/ml + Mẫu 3: mẫu PZA trong huyết tương với nồng độ 40 uig/ml
+ Mẫu 4: mẫu RMP (nơng độ 15 pg/ml) va PZA (nồng dé 40 pg/ml) trong huyết tương
+ Mẫu 5: mẫu RMP (nơng độ 15 \ig/ml) và PZA (nồng độ 40 ng/ml) trong huyết tương với sự cĩ mặt của [NH (nồng độ 4 ug/ml)
Tất cả các mẫu được xử lý và tiến hành như ở ở mục 2.3.2.3 Sắc ki đà được thể hiện như trong øhự lực 3
Qua sắc kí đồ ta thấy:
- Thời gian lưu của PZA là 6,0 phút Thời gian lưu của RMP là 10.5 phút
- Trên sắc đồ của huyết tương trăng khơng cĩ pic tai vi tri cla RMP va PZA Trên sắc đồ của mẫu cĩ RMP hoặc PZA cĩ pic của RMP hoặc PZA gon, rõ, cân đối Trên sắc đồ cĩ chung 2 chất RMP và PZA khơng cĩ pic của
Trang 35a - _ Trên sắc đồ của mẫu 5 khơng cĩ sự xuất hiện pic khác tại vị trí pic cua RMP va PZA - _ Đối với chương trình 2 (định lượng INH): chuân bị lần lượt các mẫu sau:
+ Mẫu [I: mẫu huyết tương trăng
+ Mẫu II: mẫu INH trong huyết tương với nồng độ 4 tig/mI
L Mẫu III: mẫu INH trong huyết tương với nồng độ 4 tig/ml với sự cĩ mat cua RMP (15 ug/ml) va PZA (40 pg/ml)
Tất cả các mẫu đều được xử lý theo quy trình ở mục 2.3.2.3: Qua sắc đồ ta thay:
- _ Thời gian lưu của INH là § phút Pic cĩ hình dạng gọn, rõ, cân đối - _ Trên sắc đồ của huyết tương trắng khơng cĩ pic tại vị trí pic của INH
- _ Trên sắc đồ của mẫu cĩ thêm PZA va RMP, tai vi tri pic cla INH
khơng cĩ pic của các chất khác
3.1.2 Xây dựng đường chuẩn:
Trang 3729
Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy cĩ sự tương quan tuyến tính
chặt chẽ giữa diện tích pic và nỒng độ RMP, PZA và INH trong khảo sát với
các hệ số tương quan lần lượt là R”=0.9987; 0.9964; 0.9878 3.1.3 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Phân tích các mẫu trắng và mẫu chuẩn cĩ nồng độ thấp nhất trong khoảng tuyến tính của từng chất Xác định đáp ứng pic của mẫu chuẩn và mẫu trắng Tính nồng độ từng chất trong mẫu chuân từ diện tích thu được và đường chuân Bảng 3 I Giới hạn định lượng dưới (LLOO) của phương pháp
LLOQ STT Hàm lượng | Độ đúng so | Đáp ứng so | Thơng kê
Trang 3830
Nhận xét: Kết quả cho thấy độ đúng trung bình của các mẫu LLOQ của các chất đều nằm trong khoảng 80-120% và cĩ độ lặp lại nằm trong yêu cầu <
20% Đáp ứng của các mẫu chuẩn cao gấp trên 5 lần đáp ứng mẫu trắng Như
vậy LLOQ của phương pháp đối với từng chất lần lượt RMP 1a 1.5 pg/ml; PZA 1a 4 ug/ml; INH 1a 0.5 ug/ml 3.1.4 Độ đúng, độ chính xác 3.1.4.1 Độ đúng, độ chính xác trong ngày: Bảng 3.2 Xác định độ đúng, độ chính xúc trong ngày RMP PZA INH HQC | MQC | LQC | HỌC | MQC | LQC | HỌC | MỌC LỌC 22.5 11.25 2 60 30 12 6 4 2 pg/ml | pg/ml | pg/ml | pg/ml | pg/ml | pg/ml | pg/m | pg/ml | pg/ml Độ đúng T.Binh | 109.78 |9779 | 86.3 104.3 | 102.09 | 104.52 | 93.22 | 92.68 | 89.78 (%) SD 5.93 4.73 8.52 3.43 5.71 9.83 2.43 212 4.11 CV(%) | 5.4 4.84 9,1 3.18 5.53 8.99 200 2.68 4.32
Tiến hành phân tích với các mẫu LỌC, MỌC và HỌC với từng chất Mỗi loại mẫu QC làm 5 mẫu độc lập cùng nồng độ, kết quả thu được như bảng 3 2
3.1.4.2 D6 ding, d6 chính xác khác ngày:
Tiên hành phân tích các mẫu LỌC, MỌC, HQC được chuẩn bị tương tự
Trang 3931
dựng, mỗi nồng độ làm 5 mẫu độc lập, trong 3 ngày liên tiếp Kết quả độ đúng độ chính xác khác ngày của phương pháp được trình bày trong bảng 3 3
Nhận xét: kết quả thực nghiệm cho thấy với cả 3 chất ở cả 3 nồng độ HỌC, LỌC và MỌC phương pháp đều cho độ đúng nằm trong khoảng giới hạn cho phép (85-1 15%) và độ chính xác khác ngày với giá trị CV nhỏ hơn 1034, chứng tỏ phương pháp được nghiên cứu cĩ độ đúng, độ chính xác cao, phù hợp với yêu cầu phân tích trong dịch sinh học Bảng 3.3 Xác định độ đúng, độ chính xác khác ngày RMP HỌC 22.5 (ng/ml) MQC (11.25 pg/ml) LỌC(4.5 Jig/ml)
Hàm lượng | Độ đúng ( Hàm lượng Độ đúng Hàm lượng Độ đúng
Trang 4032
Nhận xét chung
Kết quả thâm định một phần độ đặc hiệu, chon lọc, độ đúng, độ chính
xác, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới cho thấy phương pháp đáp ứng đầy đủ yêu cầu phương pháp phân tích trong dịch sinh học
3.2 NONG ĐỘ RMP, PZA VÀ INH TRONG HUYẾT TƯƠNG BỆNH
NHAN LAO PHOI:
3.2.1 Đặc điểm chung của nhĩm nghiên cứu:
3.2.1.1 Phân bơ theo tuỗi và giới
9 bệnh nhân đáp ứng được tiêu chuẩn của nghiên cứu được theo đõi và lấy mẫu vào tháng 4 năm 2010 Bệnh nhân trong nghiên cứu bao gồm cả 2 giới trong đĩ cĩ 4 nữ, 5 nam Độ tuổi trung bình của bệnh nhân là 40.89 tuổi
thập nhất là 21, cao nhất là 64
3.2.1.2 Triệu chứng lâm sàng trước điều trị: *Các triệu chứng lâm sàng chung:
Biểu hiện các triệu chứng lâm sàng chung trước điều trị của nhĩm bệnh nhân được thể hiện trong bảng sau: