Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội

Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu hệ vi nấm trên các vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội

Trang 1

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYEN THI HUYEN

NGHIEN CUU HE VI NAM TREN CAC VI THUOC CAM THAO BAC

VA HUYEN SAM DANG LUU HANH

O CAC HIEU THUOC DONG DUOC |

THUOC DIA BAN HA NOI

Trang 2

LỜI CÁM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới:

ThS Tran Trinh Cong

Giảng viên bộ mơn Vị sinh — Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội - người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tơi những kiến thức quý báu trong quá trình thực hiện và hồn thành khố luận

Tơi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Bộ mơn Vi sinh — Sinh học,

trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã nhiệt tình giup đỡ tạo mọi điều

kiện cho tơi thực hiện đề tài

Nhân dịp này, tơi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường cùng tồn thể các thầy cơ trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị kiến thức, giủp đỡ tơi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã luơn

giúp đỡ, động viên tơi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Trang 3

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BÁNG LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHU’ VIET TAT DANH MỤC CÁC HÌNH T7: ga tararararrraaarrrrrgatiaraosuasttoroortotaosaank I Efiiơep li: TONG OUR siccsassissauscscananmcnesnaccnmesammacunu neuen 2

1.1 Các nhĩm nắm thường gặp trên các sản phẩm c6 nguon goc thuc NV nnanererorggi000100710000005109000000000800010009008000010000010274/0000400109Y0509/010016000630370039 3:0 2

1.1.1 Ngành nấm tiếp hợp — ZÿyØ0my€ota - 5c size 2

Lid, Cúc Hi"Ê HH G0GR WORD occas 2

1.1.1.2 Nuơi cấy để nhận Mien oo ccccccccccececcscsesseneecseecseeveseseseeseveseeneess 4

1.1.2 Ngành nắm túi — ,4S€Ø/HJŒØf 52 cSvcv+se£szvrvrxeesreea 5

liái, - CHẾ đặc [HỦI G10 (ORE ccsncumacmmanmamacnaniaune 5

I.I.2.2 Nuơi cấy để nhận điện -ccc+ci<s<scvea 6

Leldeds BROW DRG [OfÍcssoesoaaaeansenaerrnnenrrrnreensnnseseisressentrrmrsee 6 1.1.3 Nhĩm nắm bất tồn — Deuteromycetes - . -5: 5+: 7 1.1.3.1 Chi Aspergillus Micheli ex Fries 7

LLZ2, Cheb Pentcillizm Linkcsex TIÌS eeeeieseeeseeess=es 1]

Trang 4

2„⁄zÌNOI dung nghiềN! CỨU :: -:ccccoccscciccirncccii22064600000653661630053666160816360/0000120 54 20

2.2.1 Phán lập, phán loại các chúng nắm nhiễm trên I0 mẫu của vị thuốc cam thảo bắc nghiên CỨ - e555eScseseeeeeeersezerrrrszeeecrrce 2Ơ

2.2.2 Phân lập, phân loại các chủng nâm nhiễm trên 10 mẫu của vị

thuốc huyễn sâm nghiÊH GỨN - s5 - sec HS 1 1012161 11144 20

3.3 Phương pRáp hghiêu cứu ciddouGonasgtsie 21

2.3.1 Phương pháp Ïấ HHẪM . 5225 2t 222 test srrrrrervrrrred 2] 2.3.2 Phương pháp xác định hàm ẩm dược liỆH - 5: 21

2.3.3 Phương pháp phân lap natn me cccccccceccccsscssesessessessesssvesesessseess 21 2.3.4 Phương pháp phân loại nữm mốc -. 2- ©5+5+5<<5++s55 2I

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KÉT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Hệ vi nắm trên vị thuốc cam thảo bắc -. . «<< i 3.2 Hệ vi nấm trên vị thuốc huyền sâm 6: 5c 5< se 30

Trang 5

DDVN III A flavus A, niger A fumigatus A, parasiticus A oryzae S.racemosum PDA AFPA CMA L.O DK DG18 HA KL CYA CREA MEA

DANH MUC CAC KI HIEU, CAC CHU VIET TAT

: Dược điển Việt Nam II : Aspergillus flavus : Aspergillus niger : Aspergillus fumigatus : Aspergillus parasiticus : Aspergillus oryzae : Syncephalastrum racemosum : Potato Dextrose Agar

: Aspergillus flavus and parasiticus Agar : Corn Meal Agar

: Lan Ong : Đường kính

: Dicloran 183% Glycerol Agar : Hay infusion Agar

: Khuẩn lạc

Trang 6

DAT VAN DE

Ở nước ta thuốc y học cổ truyền và các chế phẩm đơng dược đa số cĩ

nguồn gốc thực vật [9] Hiện nay việc sử dụng các sản pham nay phuc vu nhu

cầu chữa bệnh và chăm sĩc sức khỏe của người dân ngày cảng tăng Bên cạnh

đĩ, các phương pháp, phương tiện chế biến, bảo quản dược liệu cịn nghèo

nàn lạc hậu, cùng với điều kiện khí hậu nhiệt đới nĩng ẩm ở nước ta Điều đĩ

làm cho các loại dược liệu, các vị thuốc đơng dược rất dễ bị nắm mốc xâm

nhiễm và phát triển Ngồi việc làm giảm chất lượng thuốc do bị biến đổi

thành phần hĩa học, bị biến màu, sinh mùi vị khĩ chịu, nam mốc cịn sinh

ra các độc tơ (mycotoxins) [17]-đây là những sản phẩm chuyên hố thứ cấp

độc của nấm, gây nguy hại cho sức khoẻ người tiêu dùng Các độc tơ nắm này

gây ra nhiều loại bệnh khác nhau cho con người và động vật gọi chung là các bệnh do độc t6 nam (mycotoxicoses), với các tác động từ cấp tính đến mãn

tính, cĩ thể dẫn đến quái thai, ung thư [4, 17]

Qua những vấn đề đã nêu trên chúng tơi thây nắm là nhĩm vi sinh vat cĩ ảnh hưởng quan trọng đối với chất lượng và độ an tồn của được liệu Tuy

nhiên các loại nắm khác nhau cĩ vai trị và ảnh hưởng khác nhau đối với dược

liệu Do vậy việc điều tra hệ vi nấm trên từng cơ chất là một bước hết sức

quan trọng, mang tính quyết định trong việc tìm ra các biện pháp hữu hiệu đề

phịng tránh các tác hại nêu trên Với mục đích, ý nghĩa đĩ chúng tơi tiễn hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hệ vì nắm trên các vị thuốc cam thảo

bắc và huyền sâm dang lưu hành ở các hiệu thuốc đơng dược thuộc địa

bàn Hà Nội” với mục tiêu :

Trang 7

Chương 1: TƠNG QUAN

1.1 Các nhĩm nắm thường gặp trên các sản phẩm cĩ nguồn gốc thực vật

Các cơ chất cĩ nguồn gốc thực vật như các loại hạt lương thực, cơ

chất thực vật chết „ thường cĩ mặt các nhĩm nắm quan trọng như nhĩm nắm

bất toan (Fungi Imperfecti hay Deuteromycetes), nganh nam tiép hop

(Zygomycota) và nganh nam túi (4seomyeota) Sau đây chúng tơi xin trình

bày một số nét chính của các nhĩm nắm kẻ trên

1.1.1 Ngành nắm tiếp hợp - Zygomycota

lLILILI Cac dac tinh quan trong

Đây là nhĩm nẫm khá phổ biến trên lương thực, được thảo Đặc điểm

chung của nhĩm này là cĩ hệ sợi nắm cong bao, bao tu tiép hợp được hình thành từ các hệ sợi hữu thụ, bào tử cĩ vách dày, chắc được gọi là bào tử tiếp hợp (zygospore)

Sinh sản vơ tính bằng các bào tử nang (sporangiospore), được nội sinh

trong các nang hình cầu hoặc hình quả lê cĩ hoặc khơng cĩ bọng hoặc phần

trung tâm bên trong nang (colummella), được tiếp nối bởi một cuống nang

(sporangiphore), hoặc các bào tử vơ tính được sinh ra trong các nang bào tử chuỗi (chúng được phân ra thành một hàng các bào tử chuỗi-merospore) Nang bào tử chuỗi (sporangium) khơng cĩ colummella Sporangiole (các

nang bào tử thường cĩ hình cầu, với một hoặc một số ít bào tử và colummella

bị tiêu biến) bắt gặp ở các ho Thamnidiaceae, Cunninghamellaceae va

Choanephoraceae Một số chi được đặc trưng bởi cấu trúc apophysis ( phản

phơng lên của cuống nang, ngay sát bên dưới nang) Sợi bị (Stolon) cĩ thé

xuất hiện-là các sợi đặc biệt năm trên bề mặt thạch và sinh các cuỗng nang

Trang 8

gọi là rễ giả-rhizoid [hình I1] Một số lồi sinh các bào tử thành dày-

chlammydospore, hoặc các bào tử thành mỏng-oidium thường cĩ hình câu,

chúng cĩ thể được sinh ở cuối sợi, xen kẽ, đơn độc hoặc thành chuỗi

Cac bào tử nang, bào tử thành dày-chlammydospore, bào tử thành

mỏng-oidiun nảy mầm sẽ tạo thành hệ sợi mới

Sinh sản hữu tính xuất hiện bằng sự hồ trộn các nang giao tử đa nhân,

đơn bội-gametagium và kết quả cho ta một bào tử tiếp hợp-zỳospore thành dày, màu vàng tới nâu hoặc đen, thường được bao phủ bởi một lớp các gai nhọn và các cấu trúc lỗi ra khác Hai phần sợi ở hai đầu kết thúc của bào tử được gọi là cuống nỗn-suspensor Các cuống nỗn này cĩ thể giống nhau hoặc khơng giống nhau về kích thước và hình dạng Đơi khi cuống nỗn hình thành các phần phụ hay mấu (như ở một số loai ctia chi Absidia) Sporanduun — spares ~ cotumeila~ FT sporangrophores ` chizords

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái của chi Rhizopus

Ré gia (rhizoid), soi bị (stolon) và nang bào tử (sporangium)

( Sharma, 1998)

Hầu hết các thành viên của nhĩm này là các sinh vật hoại sinh, tuy

Trang 9

thuc vat Bénh do nam Mucorales gap chi yéu 6 cac chi Rhizopus Rhizomucor, Cuninghamella, Cac chi Mucor, Absidia it gap hon

1.1.1.2 Nudi cay để nhận diện

Các chủng của nhĩm nắm này thường được nuơi cấy trên mơi trường

MEA (Malt Extract Agar 4%) trong cac dia Petri nhua Déi véi chi Mucor, việc nuơi cây như vậy sẽ tạo ra sự phát triển khơng bị xáo trộn do phát triển

quá mức (Schipper, 1973) Nhiệt độ nuơi cấy thay đổi từ 20°C đối với chỉ

Mucor, dén 20-30°C đối với các chỉ Rjizopus và Syncephalastrum và xâp xỉ

36°C đối với chỉ 4bsiđia Tất cả các lồi được nuơi cấy trong mơi trường tối

trong vịng một tuần Đề tạo điều kiện cho sự phát triển bào tử tiếp hợp, mơi trường và nhiệt độ thường được luân phiên

Khố phân loại một số chỉ phố biễn trên các loại hạt lương thực: Hesseltine va Ellis (1973) chia ho Mucoraceae thành 20 chi trong đĩ

chi Rhizopus va chi Mucor 1a quan trong nhat

la Bào tử nang được hình thành trong các nang chuỗi bào tử- merosporangium bao phủ xung quanh một bọng ( phần cuối phơng lên của giá

PAIS SPEAR OT OES sascameresancarrrcmmenueernmemnenenmanenins Syncephalastrum

1b Bào tử nang được hình thành trong các nang hình câu hoặc quả lê G101 Hgf0£-GHWDNHIEN: vs bseii9106ãã00E0608566E©058300GE56308I0fa4800d0 2

2a Các nang và giá nang cĩ màu tối, giá nang hầu như khơng phân

nhánh, thường xuất hiện thành nhĩm Đường kính (ĐK) nang thay đổi từ 50-

20U 107: Bi LỪ [HữUNG WO NĨ (vo pusac ndog0011a0)V40000 G3 ID4A338y0S0tcxag Rhizopus

2b Các nang và giá nang khơng cĩ màu hoặc chỉ cĩ màu nhạt, thường phân nhánh nhiều ĐK các nang khơng bao giờ vượt quá 100 um Bao tir thường KHƠNG GƠ RÙ cai 0624000161465 6565650606 G4014S40G0E4UAGXSOR'0532XE994938%/48 3

3a Các nang hình quả lê với một apophysis đặc trưng, ĐK 10-40 um

Trang 10

3b Các nang hình cầu khơng cĩ apophysis, hầu hết cĩ đường kính lớn

1.1.2 Nganh nam tui— Ascomycota 1.1.2.1 Các đặc tinh quan trọng

Hệ sợi của nấm túi cĩ vách ngăn va don bội Sinh sản hữu tính bang

các túi bào tử (aseus), thường được hình thành bằng việc tiếp hợp của hai

nhân từ hai túi giao tử khác nhau (giao tử đực-antheridium, giao tử cái-

aScogonium)

Thường cĩ 8 (đơi khi 2 hoặc 4) bào tử túi được hình thành trong các túi

sau quá trình giảm phân Các túi bào tử thường được bao bọc trong thê quả túi

(ascomata hay ascocarp) Các thể quả này xuất hiện đơn độc hoặc kết tụ lại

thành cụm trong hoặc trên một đệm (stroma), câu tạo bởi hệ sợi dinh dưỡng

Hình thái của các thể quả cĩ ý nghĩa quan trọng trong việc phân loại Chúng

thường cĩ dạng như cĩc (apothecia), dạng cầu hoặc gần câu, khơng cĩ lỗ mở

(cleistothecia), hoặc các thể quả hình bình (perithecia) Các túi bào tử cũng cĩ thê phát triển trong các ơ của các lớp đệm (stromata), hoặc mọc lên từ các cầu

trúc gidng goi dém (pseudothecia)

Trạng thái sinh túi bào tử hay teleomorph thường được kẻm theo một hoặc nhiều các trạng thái sinh sản vơ tính-anamorph Đa số nắm bất tồn Deuteromycetes (Eungi 1mperfecti) cĩ trạng thái anamorph trong các chu ky

sng cla nam tui Ascomycetes Tat cả các chỉ nắm túi được nĩi đến ở đây đều thuộc bộ Eurofiaies, các thể quả túi cĩ đặc trưng là các túi bào tử nhỏ hình

Trang 11

1.1.2.2 Nuơi cấy để nhận diện

Các chủng phải được nuơi cấy trên các mơi trường thích hợp Các chỉ Byssochlamys, Monascus, Emericella, Talaromyces va Neosartorya hinh

thành bào tử tốt nhất trên các mơi trường MEA, OA ở 24-30°C Các chủng

cia chi Eurotium phát triển chậm trên các mơi trường này và tạo ra các

conidiophore khơng điền hình, các thể quả lép Để Eurotium hinh thành bào

tử tơi ưu, phải nuơi cấy trên các mơi trường MEA, Czapek bố sung thêm 20-

40% đường kính hoặc 10-30% NaCl Dé phan lap nén ding mơi trường DG18 (Dichloran 18% Glycerol agar) Hầu hết các lồi nấm túi được nĩi tới đây

chín sau 10-14 ngày Lưu ý rằng một số lồi nấm túi của các chỉ như Talaromyces và Neosarforya, dạng vơ tính đơi khi khĩ tìm thấy và chúng chỉ

xuất hiện trên mơi trường già hoặc khi nuơi cây trên mơi trường nghèo như

Potato Carrot hoac HA (Hay infusion Agar) 1.1.2.3 Khố phân loại

la Thể quả túi cố cuéng đặc trưng cuống cầu tạo bởi một sợi đơn Dạng vơ tính anamorph là arsi2efOsDOFđ - - - Monascus

Ib Thể quả túi khơng cĩ cuống, dạng vơ tính là Penieilium, PORCUOMVCES NOG ASPOPO Nie ccs sisi: csvarecnsess renee SăN BỀN Hi LTNN Eăb6©x S246 0 Z

2a Thể quả túi khơng cĩ vách đặc trưng Dạng vơ tính là

POSCHOMYCES ssnctsccstcsevisnteenstsvectvarmnevereses cedesanemneaen Byssochlamys

2b Thé qua tui cé mot lép vach ao Dang v6 tinh 1a chi Aspergillus

PRs PAI ois candi nnnik stats nainn Sessa SAS aRe RENEE Me NeR REL ANNIVER 3

3a Dạng vé tinh 1a chi Penicillium Thé qua tui cd lép vỏ bọc đặc

trung, mau vang déi khi chuyén thanh mau hoi do Talaromyces 3b Anamorph 1a Aspergillus Thé qua tii cĩ các tế bào Hủille, hoặc cĩ

Trang 12

conidi (conidial head) Conidi ở dạng chuỗi khơ cĩ thể hình thành dạng cột (columnar) hoặc dạng phân kỳ (radiate) Conidi (conidium) chỉ gom một tế bào, bề mặt nhăn hoặc xù xì, cĩ gai, khơng màu hoặc cĩ màu Một số lồi cĩ thể sinh tế bào Hiille (Hiille cell) cĩ thành nhăn, dày đơn độc hoặc thành chuỗi, các hạch nắm (selerotia) là các khĩi sợi thường cĩ hình cầu cứng

Cac trang thai hitu tinh: Ewrotium, Emericella, Neosartorya và các chì

khac

Các lồi của chi Aspergillus la nhitmg tac nhan lay nhiễm phơ biến trên

các cơ chất khác nhau [18] Ở các vùng nhiệt đới (như Việt Nam) và cận nhiệt

đới, sự xuất hiện của chúng phơ biến hơn rất nhiều so với các lồi của chi

Penicillium M6t s6 loai da thu hút được sự quan tâm đặc biệt do chúng là

những tác nhân gây bệnh ở người và động vật hoặc khả năng sinh các chất

chuyền hố thứ cấp độc Thể nhiễm nam được chú ý nhiều nhất là u nắm phổi

do Aspergillus Loai gay bénh nhiều nhất là 4spergillus ƒumigafus Một SỐ lồi khác cĩ tầm quan trọng trong việc lên men các sản phẩm truyền thơng

phương đơng, hoặc các ứng dụng trong cơng nghệ sản xuất acid hữu cơ hoặc cac enzym [18, 21]

Trang 13

Việc phân loại chỉ Aspergillus chủ yêu dựa trên các đặc điểm hình thái Raper & Fennell (1965) đã chia chi này thành I8 nhĩm (group) và da chấp nhận 132

loai voi 18 thir Raper& Fennell (1965) da chia nho chi Aspergillus thành các

nhom (group) Sự phân chia dưới chi này khơng cĩ vị trí trong mã danh pháp

thực vật quốc tế, bởi vậy Gams & cộng sự (986) đã thay các đơn vị “group”

bằng các “Subgenera” và “Section”

Trong phạm vi cơng trình này, chúng tơi chỉ giới thiệu ngắn gọn và đưa vào khố phân loại các lồi phổ biến nhất, đặc biệt là các lồi thường nhiễm

trên lương thực, sản phẩm cĩ nguồn gốc thực vật Do vậy để cĩ thể nhận diện

chính xác các chủng quan trọng cần tham khảo thêm các tài liệu khác ( Raper

& Fennell 1965, Samson 1992, 1994a &b) Như đã nĩi ở trên, các lồi của chi

Aspergilius là những tác nhân lây nhiễm rất phơ biến, do vậy khơng cĩ một danh sách cụ thể các cơ chất mà mỗi một lồi được phân lập Các dữ liệu về

phân bĩ của nhiều lồi đã được Domsch và cộng sự liệt kê 1993,

Các chỉ dẫn đề nhận diện các lồi ⁄1sperg¿//zs chủ yếu dựa trên các đặc tính hình thái khuẩn lạc đã được nhiều tác giả cơng bố như Pitt & Hocking

(1985), Klich & Pitt (1988a), Tzean & cong sự (1990)

Nhơi cấy để nhận điện:

Các chủng đựơc cấy tại 3 điểm trên mơi trường Czapek và MEA 2% và ủ ở 25C Đối với các lồi nắm ưa khơ như 4 penicilloides, một số lồi khác

và trạng thái Zurofium cĩ thê sử dụng các mơi trường Czapek và MEA với

20-40% đường kính Nuơi cấy các chủng tại 3 điểm trên các mơi trường, sử

dụng đĩa Petri thuỷ tỉnh tốt hơn các đĩa Petri bằng chất đẻo Hầu hết các lồi hình thành bào tử trong vịng 7 ngày Màu và cấu trúc của khơi conidi (dạng

cột hoặc phân kỳ) được quan sát tốt nhất bằng kính hiển vi phân tích Do một

Trang 14

10

Khố phân loại các lồi của chi thường gặp trên lương thực và các sản pham cĩ nguồn gĩc thực vật khác:

la Khuan lac ( KL ) cĩ màu trăng, đen, vàng, nâu hoặc xám 2

1B: 1L 165 TH xũnh lỗ Cay cuc enagta Cua G031 65ã5668120266264008i64635 8

3ø Khối eonldi rnẰ TOR, WO các v21 vo 6g06 64x 02666x4 -A candidus

2b Khối conidi màu vàng, một sĩ ngä màu nâu hoặc đen 3 3a Khối conidi cĩ màu nâu tối đến màu đen A.niger 3b Khối conidi khơng cĩ màu nâu, tối hoặc màu đen nhưng cĩ màu

Ợïu, au Vane hodC NEA MAU NAUsisesscvavevserrscecevssescseraseversvesscovescereund

4a Khơi conidi dạng cột thường cĩ màu nâu qué đến màu nâu hong §Ìhrlk:aaadđaiaiiaiaiiiiaiiâẳ A, terreus

4b Khối conidi khơng cĩ dạng cột màu vàng hoặc nâu Š

Sa Khoi conidi mau ơliu đến nâu sáng, cuống khơng màu hoặc vàng nhạt thường sinh tế bào Hũile -.- - << 2 << 2< z2 =<<<5< s2 A ustus

5b Khối conidi khơng cĩ màu ơliu đến nâu sáng, stipe khơng màu hoặc

vàng nhạt khơng sinh tế bào Hũlle - :ccccc cccc c2 n2 n3 căi 6

6a Khối conidi cĩ màu vàng rong, conidi nhan đến rap

1:0 A, ochraceus

6b Khối conidi mau nau vang, conidi khéng nhan hay rap min 7 Ja Conidi duoc tơ điểm rõ nét băng các mụn cĩc và mấu nhỏ, vách

ngồi và trong cĩ thể phân biệt rõ - A, tamarii

7b Conidi hầu hết ráp, vách trong và ngồi khơng thể phân biệt

CƯ Ơ th ga GD v4 066441663) EVEKLVKETEGGGSEKEEEeA“Zdserees eeessasexeesuulfx“HIDHEEE 8a Conidiophore mau nau điển hình, cĩ mặt tế bào Hũlle và dạng hữu

tinh ErmeriCellA « «sàn HH kh nu A, nidulans

8b Conidiophore khéng cé mau nau dién hinh, khéng cĩ dạng hữu tính

Trang 15

11

9a KL trên Czapek hoặc MEA hầu như bị giới hạn (đường kính KL

thường < 1,5 em trong 1 tuân) ‹scc +32 vs về ca 10

9b Khuẩn lạc phát triển nhanh hơn, đ0 kinh > 1,5 GÌ Il

10a KL cĩ màu thay đổi, khối conidi 2 tầng, đơi khi cĩ tế bào

TT ga on can GHI G(40600/8461034632000315006910/2186809/4G010085000/406000011/4/00000950056010340 giai A, versicolor 10b KL mau xanh lá cây xám, khối conidi | tang, trén MEA, Czapek phat triển rất giới hạn, nghèo bào tử, trên các mơi trường nước hoạt tính thấp,

phát triển tốt hơn, tế bào Hủlle khơng cĩ - - A penicilloidles 11a Trên mơi trường nuơi cấy già hoặc các mơi trường nước hoạt tính thấp, cĩ giai đoạn hữu tính Zuro/ium màu vằng A, glaucus

11b Khéng cé dang hitu tinh uzofiuzm màu vàng 12 12a Khơi conidi màu xanh lã cây-vàng tới màu xanh lá cây-vàng

12b Khối conidi xanh da trời tới màu xanh lá cây tối 15

13a Khoi conidi cha yéu | tang, conidi mau xanh lá cây-vàng tơi, cĩ

BAN FU eeeceseansvenysenecenensrberdidynseehi pate ss Niassa TERT A, parasiticus

13b Khối conidi 1 hoặc 2 tầng -. - 2S SS s32 14 14a Conidi co gai nho, xanh là cây VÀnG.: eva scccecocces.s-ea A flavus 14b Conidi ráp hoặc nhắn khơng cĩ quy luật, mau ơliu-xanh lá cây

"1: 00111313 A, oryzae

15a Khéi conidi hình cột, bọng hình chuỳ rộng, conidi ráp đến cĩ Thun 0n v20 n6 66006500000C0606304G3348455)VSSSIGSGWNSSVGWHSMEQuNESssp A, fumigatus

15b Khéi conidi khơng cĩ dạng cột, bọng hình chuỳ hẹp, thành

MAAN eee e cece cee ce cee sceeeuceecceuecaceeeeeeeeeeeeesegeeeeeeereeens A, clavatus

1.1.3.2 Chi Penicillium Link ex Fries

Trang 16

12

Chỉ Penicillium được đặc trưng bởi các đặc điểm sau :

Khuẩn lạc thường phát triển nhanh, thường ngả màu xanh lá cây, đơi khi cĩ màu trắng, chủ yếu cấu tạo bởi một lớp dày các conidiophore

Conidiophore cĩ thể mọc lên từ cơ chất, từ các sợi khí sinh, từ các sợi bị lan trên mặt thạch, hoặc các bĩ sợi thăng đứng chặt hay lỏng

Conidiophore khơng màu thành nhẫn hay ráp, chúng cĩ thể đơn độc hoặc kết

thành bĩ, câu tạo gồm một stipe đơn và được kết thúc hoặc bằng một vịng

xoắn của các thể bình (phialide), đây là câu trúc chỗi 1 vong (mono

verticillate) hoặc bằng các chỗi đa vịng, cĩ các nhánh và metulae (các nhánh gần đoạn cuối mang một vịng phialide) Tất cả các tế bào giữa metulae va stipe được xem như là các nhánh

Kiểu phân nhánh: cĩ thé một giai đoạn phân nhánh (biverticillate), 2 giai đoạn phân nhánh (terverticillate) hoặc 3 (quaterverticillate) tới nhiều hơn

các giai đoạn phân nhánh Các thể bình thường cĩ hình chai, với phần đáy

hình trụ và phần cơ đặc trưng hoặc dạng mác, phần đáy hẹp nhiều hay it, thon

nhỏ tới một đỉnh khá nhọn (Acerose) Conidi sắp xếp thành dạng chuỗi dài,

khơ, phân ly hay dạng cột, cĩ dạng hình câu, elip, hình trụ hoặc hình thoi,

khơng màu, hoặc hơi xanh lá cây, thành nhẫn hoặc ráp Một số lồi tạo hạch

nam (Sclerotia)

Trang thái hữu tính : Eupenicillium, Talaromyces, Hamigera va cac chi

khac

Nhiều lồi của chi Đenicillium là những tác nhân lây nhiễm phố biến

trên nhiều cơ chất khác nhau và đồng thời tiềm ân khả năng sinh độc t6 nam mốc Do vậy việc nhận diện chính xác là vấn đề quan trọng khi nghiên cứu

khả năng lây nhiém do chi Penicillium Viéc nhan diện các lồi của

Penicillium da duoc Raper va Thom (1949) thực hiện, chủ yếu dựa trên cơ sở

Trang 17

15

khá dễ thay đổi Các đặc tính hình thái thuần chủng cĩ thể được dùng cho việc

phân loại, ngồi ra các đặc điểm như tý lệ phát triển, nước hoạt tính ở các mơi

trường và nhiệt độ khác nhau cũng hỗ trợ cho việc xác định lồi ( Pitt, 1979), Việc sử dụng các dữ liệu về các chất chuyên hố thứ cấp cũng cho thấy cĩ giá

tri cho viéc nhan dién (Frisvad, 1981, 1985; Frisvad va Filtenbord, 1983;

Lund & Frisvad, 1994 ) nhiều mơ tả chi tiết và các khố phân loại của

Penicillium cũng đã được cơng bố ( Pitt 1985),

Hinh 1.3: Cau tric sinh conidi dang chéi cia chi Penicillium

Một số lồi tạo các chất tiết và mùi sẽ giúp nhận ra vị trí phân loại của chúng, nhưng một điều cần lưu ý là hít phải bào tử và các chất bay hơi cĩ thé

bị stress, gây ảnh hưởng tới sức khoẻ Tuy nhiên gây bệnh ở người chỉ một

lồi duy nhất của chỉ gây bệnh cơ hội là P zarnefei [4 22]

Nuơi cấy để nhận diện :

Samson va Pitt (1985) dé xuất nên cấy các chủng ở 3 điểm trên mơi

trường CYA (Czapek Yeast Agar) và MEA (2%) ủ ở 25C, tối hoặc sáng Tuy

Trang 18

Penicillium trên CYA và Czapek cĩ thê xuất hiện, thường là do thiếu các vết

kim loại nặng, đặc biệt là đồng Khĩ khăn cĩ thê được giải quyết khi bỗ sung

thêm dung dịch đồng hoặc kẽm Các đĩa Petri thuỷ tinh cho kết quả tốt hơn so

với các đĩa Petri nhựa, khi nuơi cây bằng các chủng khơ (bào tử khơ) Hầu hết

các lồi hình thành bào tử sau 5-7 ngày Một số lồi thuộc nhĩm

Terverticillate Penicillium, khi su dung moi truong CREA (Creatine Sucrose

Agar) cũng rất hiệu quả trong việc phân biệt các lồi cĩ mối quan hệ rất thân

thudc Cac loai Penicillium Terverticillate thudc chỉ P aurantiogriseum/ verrucosum complex la rất khĩ xác định khi chỉ dựa trên cơ sở các cấu trúc

hình thái của chúng Khĩa phân loại dưới đây sẽ trợ giúp bỗ sung cho sự nhận

điện lồi

Khố phân loại các lồi phổ biến của chỉ Đenicillium trên các cơ chất

chết cĩ nguồn gốc thực vật như các loại hạt lương thực :

1a Khuẩn lạc màu trắng ( hoặc xanh lá cây xám nhạt) « 2

Ib KL ngả màu xanh lá cây, đơi khi hệ sợi khí sinh màu vàng 3 25, KODIMOD ROE CG SUPE II: ona ncacensensxwnmnnnnwewenewnaee P, camemberti

2b Conidiophore cĩ stipe nhẫn - - : - : - -:-‹- P nalgiovense

3a KL trên mơi trường Czapek phát triển và hình thành bào tử nghẻo

nàn, conidiophore ngắn với phialide lớn đặc trưng (dài 12-20 wm, conidi hinh

elip đến hình trụ là căn nguyên gây thối lụi quả họ cam chanh P digitatum

3b KL trên Czapek phát triển và hình thành conidi phong phú, conidiophore với stipe dài đặc trưng và phialide bé hơn (5-12 wm) 4

4a Conidiophore một vịng (đơn giản, khơng phân nhánh) P giabrum 4b Conmdiophore phan HHˆDDN:cccscoaicviiávxceecci462464646684406448634 60 5

5a Phialide hình kim, conidiophore chủ yêu kết thúc bằng vịng

metulae và phialide (biverticillate) đơi khi cĩ chổi 3 vịng (terverticillate) 6

Trang 19

l§

6a Khuan lac phat trién nhanh, đường kính lớn hơn 1.,Š cm trong | tuần

trên mỗi trƯỜN: NA koeeveoeeeceo ni iuebiboiciGesast6biovio li043020630 P funiculosum

6b KL bị giới hạn, ĐK < 1,5 cm trong I tuần trên mơi trường

TH Na gqgagqudggqtrdqaodaerdrredrdoaodidd8GiA0SE00 ERNE 7

7%, OTEIH TM, HÙNH ĐT ĐT ca các sang gàng uy Hơ KGIA 4 tá a208/2946đ8 P rugulosum 7b Conidi nhẵn hoặc ráp thường cĩ hình thoi P variabile

8ä Cohniđlophofe chủ yêu 2 VỒ HD visesssscevewcncsccneecesusacuvenvensannsin 9 TT H110 6 ngeetreendaaessassselssaebsesssdsesatds I0

9a Khuân lạc bị giới hạn trên MEA, hầu hết cĩ ĐK < 1,5 cm trong |

bưu, mộ re) 60 TARY VIE er seca sewn sexcesecarawseracaxcovsmmenmeveqanvan: P.citrinum

9b Khuẩn lạc cĩ ĐK > 1,5 em trên MEA trong | tuân, mặt trái xanh lá cay tOi toi den nhat cccecceeeceecececceeeeceeseeceececeee: P corylophilum

10a Conidiophore cĩ stipe nhẵn trên Czapek & MEA; đơi khi cĩ thành

Tập trên Nga Bhng bi D D4 QGXEDDDERISNENGSERSIGAIE%SIGBSIEDIEISSEEEIEESSIEEVGER iI

10b Conidiophore cé stipe hoi rap téi rap nhiéu hodc g6 ghé (mun lla Conidiophore lon, cdc stipe réng 4-6 um kết dày chắc, khuẩn lạc

hau hét Dị BIỂI DĐ z8 26724601503 001 N09 5001660520000 000185888 P brevicopactum

11b Conidiophore với các stipe rộng 2,5-4 cm, khuẩn lạc phát triển

tương đối nhanh .- c c 22222211222 2223121282111 1 152x153 eg 12

12a Khuẩn lạc dạng nhung, thường cĩ giọt tiết và mặt trái màu vàng,

conidi cĩ đạng hình cầu tới elip - -‹ P chrysogenum 12b Khuẩn lạc cĩ conidi kết cụm, khơng cĩ giọt tiết màu vàng, conidi Hình:s 3y eên, cll tổi BẦN PP cua võng vi gũ 000904 986XESNM.GISSSARD0A30001-034848088 13

13a Thể bình ngắn, chiều dài < 6,5 um, conidiophore thường cĩ cầu trúc 4:vịng (quatorVErtIGIIBĂE so cossscseeebseveaekeaniesaerienasravise P griseofulvum

Trang 20

16

14a Khuẩn lạc cĩ DK 4-5 cm sau 14 ngay, conidi hinh cau dén elip, tac

Oem CNN rece conencenneceemenemnst RED

14b Khuẩn lạc cĩ DK 2-2,5 cm sau 14 ngày, conidi cĩ dạng hình elip đến hình trụ, tác nhân gây thối quả họ cam chanh - /#alicum

13a, Cond! G6 Gal (BGHITIIREET:scesavasscdssacssaaswucese P echilulatum

15b Conidi nhẫn đến hơi ráp (ráp mịn) - -. -‹ 16 lĩa Conidiophore với stipe gồ ghê mụn cĩc, conidi hình cầu ĐK 4-5

um, khuan lạc dạng nhung, khơng tạo mùi, mặt trai khuân lạc xanh lá cây tối

Be Fi ếố ẽẽ ốc P roqueforti

lĩb Comidiophore với stipe ráp nhưng khơng xù xì dạng mụn cĩc,

conidi hình cầu tới elip, DK 3-4,5 um, khuẩn lạc kết cụm, thường tạo mùi,

TiSt trải Khơng bố Triển xinh lỗ Đầy TƠ acid co bo ni Go 02XEGA 00046920155 068.0022d9584 17

17a Khuan lac voi hé soi mau vang, giot tiết màu vàng cam

AG puva ca che t0 090122 40 00009 24449028087061816:60800606.0205606/66 ee P, hirsutum

I7b Khuân lạc khơng cĩ hệ sợi màu vàng và giọt tiêt màu vàng cam

18a KL trên các mơi trường thơng dụng Czapek & MEA , ở 25C, 7

ngay co DK < 10mm, mau vàng-xanh lá cây nhạt, conidi cĩ ĐK (2,5)2,8- 3,2(3,5) pm, Ít khi lớn hơn kích thước trên ‹-:-‹ P verrucosum

18b KL trén Czapek & MEA 6 25°C, 7 ngay, DK > 10mm Í 9

19a Conidi cĩ DK tương đơi bé (2,5)2,8-3,2(3,5), hình elip cĩ chiều

đài tới 3,5(4,0)um, phát triển yếu trên mơi trường CREA, tạo acid, khơng tạo

19b Conidi tương đối lớn cĩ ĐK 3-4(5)um, dạng hình elip cĩ chiêu dai

tới 4,5-6 um; phát triển tốt trên CREA, thường tạo cả acid và base 2

20a KL màu xanh lá cây xám trên MEA Conidi hình gần câu tới elip,

Trang 21

18

biết độ âm tương đối tơi thiểu cần thiết cho sự phát triển của hệ vi nấm được

liệu ở kho là 75%

Một cơng trình khác mang ý nghĩa thăm dị của tác giả Nguyễn Hữu Tuấn về sự cĩ mặt của lồi 4 /avus và khả năng tạo aflatoxin trên dược liệu

đã cho thấy tỷ lệ nhiễm A flavus kha cao (90%) Tuy nhiên do thiếu chất

chuan aflatoxin tac gia chi phát hiện được aflatoxin G; trên các mẫu dược liệu

nàn nghệ và ngưu tất đã nghiên cứu

Cơng trình nghiên cứu gần đây nhất (1/2003) của tác giả Trần Trịnh Cơng [2] nghiên cứu về mức độ nhiễm nắm mốc và aflatoxin Bị trên một số

vị thuốc đơng dược đang lưu hành trên địa bàn Hà Nội Kết quả của cơng

trình đã cung cấp cho chúng ta những bằng chứng cụ thể về mối đe dọa tiêm

tàng của nằm mốc và độc tổ aflatoxin, nhất là các vị thuốc cĩ nguồn gốc quả và hạt Trong số 6/15 vị thuốc cĩ nguồn gốc quả, hạt mà tác giả nghiên cứu đã phát hiện thấy 4 vị thuốc là nguồn cơ chất rất phù hợp cho các lồi nâm sinh

độc tố phát triển Vị thuốc đầu tiên là hạt sen, một loại hạt được dùng phơ

biến từ lâu đời đã bị nhiễm lồi 44 Zzvus trung bình tới 40% trong các mẫu

tác giả nghiên cứu Đặc biệt hơn tác giả đã phát hiện thấy 4/20 mẫu hạt sen

lấy ở các hiệu thuộc đơng dược và các chợ thực phẩm bị nhiễm aflatoxin Bị với hàm lượng dao động 17,5-434 ppb (ng/g) Trong khi đĩ giới hạn toi da của độc tố này trên lương thực, thực phẩm mà ngành y tế cho phép chỉ là IOppb Hai vị thuốc khác trong số 6 vị thuốc cĩ nguồn gốc qua, hạt là ngũ vị tử và phá cĩ chỉ đã bị nhiễm lồi 4 miger với tỷ lệ lần lượt là 91 và 30,6%

Đây là một lồi tuy khơng phải là lồi nguy hiém nhu 4, flavus hay A

parasificus nhưng cũng cĩ khả năng sinh aflatoxin VỊ thuốc cuối cùng trong

số 6 vị thuốc trên là bá tử nhân cũng cho thấy đây là cơ chất đặc trưng của

một lồi nào đĩ thuộc chỉ Đenicilliwm, chì nam mà theo các nhà nghiên cứu

Trang 22

19

ngudi va dong vat [S, 14] Ngoai ra, trong nhirng nam gần đây cũng cĩ một số

cơng trình nghiên cứu cĩ ý nghĩa quan trọng trong việc xác định hệ vi nắm

trên các vị thuốc đơng dược nĩi riêng và dược liệu nĩi chung [1, 2, 3, 7, 8, 10,

I1, 12, 15] Đáng chú ý là cơng trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn Hồng

Liên về mức độ nhiễm các lồi thuộc chỉ Penici/lium trên một số vị thuốc

đơng được [8] và cơng trình nghién ciru vé loai Aspergillus va doc t6 aflatoxin

Trang 23

20

Chương 2: ĐĨI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.L Vật liệu nghiên cứu

20 mẫu cam thảo bắc (Radix Glycyrrhizae) và huyền sâm (Radix scrophulariae) được thu thập từ các hiệu thuốc đơng dược thuộc địa bàn Hà

Nội (phố Lãn Ơng) chuyền về phịng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phịng

trước khi phân lập và phân loại nắm

2.1.2 Mơi trường phân lập và xác định nắm mốc

- Mơi trường PDA (Potato Dextrose Agar) (g/I): Glucose : 20g; thạch :

15g ; dich chiết khoai tây : Ilit Khử trùng ở 121C trong 15 phút

- Mơi trường Czapek-Dox (g/l): Sacarose: 30g; NaNO;: 3,0g; KC]: 0,5g; K;HPO,: I.,0g; MgSOa.7H;O: 0,5g; FeSO¿.7H;O: 0,01g; thạch: 17,5g; nước

cất vừa đủ 1000ml Khử trùng ở 121C trong 15 phút, pH = 6,2 + 0,2

- Moi truong AFPA (Aspergillus flavus and parasiticus Agar): Peptone: 10g; cao nam men: 20g; Sat amoni citrat: 0,5g; chloramphenicol: 0,1g; thach:

15g; nude vira du Llit Khu trang o 121°C trong 15 phút

2.1.3 Thiết bị thí nghiệm

- Kính hiển vi Axiostar plus (Carl Zeiss- Đức, gắn máy chụp ảnh kỹ thuật

số SONY- Nhật Bản)

- Tủ cây vơ trùng BIOAIR, Cộng hồ liên bang Đức

- May đo độ âm Precisa (Thụy Sỹ) - Nồi hấp tiệt trùng

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Phân lập, phân loại các chủng nằm nhiễm trên l0 mẫu của vị

thuấc cam thảo bắc nghiên cứu

2.2.2 Phân lập, phân loại các chủng nấm nhiễm trên I0 mẫu của vị

A a a oA “

Trang 24

2]

2.3 Phương phap nghién ciru

2.3.1 Phương pháp lẫy mẫu

Phương pháp lẫy mẫu dựa trên cơ sở phương pháp của FAO (Food and

Agriculture Organization) [19] Mau dược liệu được trộn đều, chia theo phương pháp đường chéo, lấy khoảng 0,5-Ikg làm mẫu đại diện Mẫu đại diện

lại được trộn đều, lấy một phần tư theo phương pháp chia theo đường chéo để nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp xúc định hàm ẩm dược liệu

Xác định bằng máy đo độ âm Precisa: dược liệu được nghiền thơ, đường

kính khơng quá 3mm, sau đĩ cho khoảng 1g được liệu đã nghiền vào đĩa cân,

đậy nắp cân chờ ồn định và đọc kết quả

2.3.3 Plurơng pháp phân lập nam moc

Phương pháp phân lập nắm mốc trên dược liệu được áp dụng dựa trên cơ sở của phương pháp Samson và cộng sự [19, 21 Khối lượng được liệu nghiên

cứu là 40g/mẫu đối với cam thảo bắc và huyền sâm Các mẫu dược liệu được khử trùng hệ nấm bên ngồi bằng cách ngâm trong dung dịch Natri hypochlorid 1% mới pha trong 2 phút Sau đĩ rửa sạch bằng nước cất khử

trùng Đẻ ráo nước và đặt nhanh các mẫu dược liệu vào đĩa Petri đã cĩ mơi

trường PDA bằng kẹp vơ trùng Ủ ở nhiệt độ 25-30”C, sau 3-5 ngày tiễn hành

phân lập các chủng nâm mọc chuyền sang mơi trường Czapek-Dox, ủ ở s.C, sau 3, 5, 7 ngày tiên hành các bước phân loại và kết luận Trên cơ sở đĩ tính tỷ lệ ?⁄% số chủng phân lập được của các lồi so với tơng số chủng nắm phân lập được

2.3.4 Phương pháp phân loại nắm mốc

- Phân loại các chi nắm theo khố phan loai cua Barnet va Hunter [16]

Trang 25

22

[23] Pit & Hocking 1985 [20], Samson và cộng sự 1995 [21] va K.H Domsch 1980 [22]

- Xác định hai lồi 4 flavus, 4 parasiticus theo phuong phap hoa sinh cua Pitt & Hocking [20]: các chung cua 2 loai A flavus va A parasiticus khi

cấy trên mơi trường AFPA và ủ ở nhiệt độ 30°C sau 42-48h sẽ xuất hiện màu

Trang 26

23

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KÉT QUÁ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Hệ vi nắm trên vị thuốc cam thao bắc

Cam thảo bắc là rễ đuợc phơi, sây khơ của cây cam thao (Glycyrrhiza

glabra L hoặc Glycyrrhiza uralensis Fisher), ho Dau (Fabaceae) [2, 3, 9] Yeu

cầu về hàm ẩm được liệu của DĐVN III là khơng quá 12%

Cam thảo bắc cĩ rất nhiều Glycyrrhizin là một saponin quan trọng nhất

của rễ cam thảo, cĩ vị rất ngọt Ngồi ra cịn cĩ nhiều flavonoid, tính bột 20-

25%, 3-10%% ølucose và saccharose Theo y học cỗ truyền cam thảo bắc cĩ tác

dụng ích khí dưỡng huyết, nhuận phế chỉ ho, tả hỏa giải độc, hỗn cấp chỉ

thống Chủ trị các chứng khí huyết hư nhược, mệt mỏi, thiếu mau, viém hong

cấp, mạn tính, ho nhiều đàm, mụn nhọt đỉnh độc sưng đau, trị đau dạ dày, đau bụng Ngồi ra cam thảo bắc cịn đĩng vai trị dẫn thuốc và giải quyết một số

tác dụng phụ trong đơn thuốc [2]

** Kết quả về mức độ nhiễm nắm mốc trên 10 mẫu của vị thuốc cam thảo

bắc được trình bày ở bảng 3.1 và 3.2

Qua kết quả của bảng 3.1 và 3.2 chúng tơi thấy một số điểm đáng chú ý

Trang 27

24

„ , * ¬" 4 ` a > A A A ` , >

Bang 3.1: Các chỉ, lồi và sơ chủng nâm phân lập được từ các mẫu của vị thuốc cam thảo bắc nghiên cứu kỉ _ | Hàm âm a ;

Dia diém lay Cách chê Tơng sơ chủng | S86

Le % : được liệu w S6 chi

mau bien nam nhiem loai

(%)

Tong 240 8 10

- Tất cả 10 mẫu của vị thuốc nghiên cứu cĩ hàm ẩm dao déng tir 6,92 -

14,79%, đều bị nhiễm nắm, với tổng số chủng nấm phân lập được là 240 thuộc 10 lồi và 8 chi trén mơi trường PIDA

- Trong 10 mẫu vị thuốc nghiên cứu nhiều mẫu cĩ hàm âm đạt yêu cầu

của DĐVN III (<12%), nhưng vẫn bị nhiễm nắm Và cũng cĩ nhiều mẫu tuy

Trang 28

25

Bảng 3.2: Các lồi và số chủng phân lập được từ 10 mẫu cam thảo bắc nghiên cứu 12 | 38 | 33 53 | 36 | 57 | 30 | 52 10 | 24 ở Tỷ lệ Chỉ &lồi lrơ |tơ |uơ | rơ | Lơ | Lơ | Lơ | rơ | rơ | rơ | Tơng | v Aspergillus A niger 9 21} 1 Zizga|2 |r lễ 0/1 72 | 30,0 A flavus 3 |0 |0 |22|0 |1 |0 |!I |0 |0 | 27 | 11,3 A fumigatus Ze 1 0 l ] l 0 12 0 10 8 33 Rhizopus 5 10 | 9 5 7 4 10 14 3 l 48 20,0 stolonifer Absidia 3 0 |6 7 {6 |0 |2 1909 0 12 28 11,7 corymbifera Syncephalastrum 6 0 |5 6 10 5 0 |5 l io 30 12,5 racemosum Mucor sp 2 l 0 l 2 10 | |3 0 | 0 7 2,9 Fusarium sp 4 0 |3 3 |0 |1 |2 |0 0 10 13 5,4 Penicilium sp l 0 | 0 0 10 l 0 l () l 4 Liv Alternaria l 0 0 1 0 0 l 0 0 0 3 1,3 alternata Tong 38 |33|24 |5§|39|15|6 |1l6 |4 |7 |240 | 100

- Với kết quả chỉ tiết từ bảng 2 cho thấy: trong 10 lồi phân lập được đã

cĩ 3 lồi thuộc chi 4spergius, với tơng số chủng nấm phân lập được là

107/240, chiêm 44,6%

- Trong 3 lồi cua chi Aspergillus ma chung t6i phan lap duge, A niger [hình 4] là lồi phổ biến nhất: cĩ tơng số chủng phân lập được cao nhất

(72/240) chiếm 30%, xuất hiện 9/10 các mẫu nghiên cứu, với số chủng dao

động từ 1-23 chủng/mẫu nghiên cứu (40g/mẫu)

- Xếp vị trí thứ 2 của chỉ 4spergillus và thứ 5 trong tổng số 10 lồi là 4 flavus [hinh 5], xuat hiện 4/10 mẫu, với số chủng dao động 1-22/mẫu, chiếm 11,3% (27/240) tổng số chủng nắm phân lập được Đây là lồi nắm sinh độc

Trang 29

26

- Ngồi 2 lồi nĩi trên, chúng tơi cịn phân lập được 8 lồi nắm khác là: Rhizopus stolonifer, Absidia corymbifera, Syncephalastrum racemosum, A funigatus, Alternaria alternata [hình 6], Mucor sp., Fusarium sp.,

penicillium sp

s* Bàn luận

Nét nổi bật của vị thuốc cam thảo là sự xuất hiện của các lồi sinh độc

tơ Đáng chú ý nhat 1a loai 4.flavus va do chúng cĩ khả năng sinh độc tơ

aflatoxin, vì vậy cần phải được quan tâm nghiên cứu tiếp ở giai đoạn tiếp theo, Bên cạnh đĩ cịn cĩ 4.uiger ngồi khả năng gây ra các bệnh nắm cơ hội ở người và động vật, gây dị ứng cịn cĩ khả năng sinh độc tổ gây hại thận ochratoxin A [17]

Mac dầu hàm ẩm của nhiều VỊ thuốc đạt yêu cầu nhưng vẫn bị nhiễm

nắm Điều này cho thây cĩ thể các mẫu của vị thuốc nghiên cứu đã bị nhiễm

nắm trước thu hoạch hoặc giai đoạn thu hoạch Và một số mẫu cĩ hàm 4m cao

nhưng nắm phân lập được lại thấp Nguyên nhân là do các mẫu của vị thuốc

nghiên cứu tuy cùng được thu thu thập ở phố Lãn Ơng, nhưng xuất xứ cĩ

nguồn gốc khác nhau Nĩi cách khác các mẫu dược liệu này chịu tác động của

các yếu tĩ sinh thái khác nhau (điều kiện trịng, thu hoạch, chế biến, bảo quản,

khác nhau) nên sẽ bị nhiễm nắm ở mức độ khác nhau

Trong đĩ đáng chú ý 1a 4 loai Rhizopus stolonifer, Absidia corymbifera,

Syncephalastrum racemosum, Mucor sp Đây là các lồi nấm tiếp hợp chúng

sống hoại sinh mạnh, làm biến đổi các thành phần của dược liệu, làm giảm

Trang 30

28

Hình 3.2: Lồi 4./1avzs nhiễm trên vị

thuốc cam thảo:

A, B: Khuan lac nam nhiễm trên vị thuốc

(mơi trường PDA)

C, D: Cấu trúc sinh conidi | và 2 tầng

Trang 31

29

D

Hinh 3.3: Loai Alternaria alternata nhiễm trên vị thuốc cam thảo

A: Khuẩn lạc nắm nhiễm trên vị thuốc (mơi trương PDA)

B, C và D: Cấu trúc sinh conidi và conidi

Trang 32

30

3.2 Hệ vi nấm trên vị thuốc huyền sâm

Huyền sâm là rễ phơi khơ của cây huyền sâm Scrophularia buergeriana Miq Ho hoa mom cho Scrophulariaceae [2, 3, 9]

Thành phân hĩa học chính của cây là harpagid là một monoterpenoid

ølycosid [3] Theo y học cỗ truyền huyền sâm cĩ tác dụng thanh nhiệt giáng hỏa, sinh tân dưỡng huyết, giải độc chống viêm, tán kết nhuyễn kiên, làm

mềm các u, khối rắn, bỗ thận, tư thận âm, chỉ khát Chủ trị các chứng sốt cao, nĩi mê sảng, hoặc sĩt cao hĩa cuơng, cơ thể bị tồn thương tân dịch, dùng phơi

với bệnh sốt phát ban chan, hoặc viêm họng, viêm tai, dau mắt đỏ, mụn nhọt

hoặc dùng trong các bệnh đởm kết hạch như tràng nhạc, lao hạch hay dùng để

tráng thủy, chế hỏa, trị tiêu khát dùng trong bệnh đái tháo đường [2]

* Kết quả nghiên cứu hệ vi nấm trên 10 mẫu của vị thuốc huyền sâm được trình bày ở bảng 3.3 và 3.4

Trang 33

31

Bảng 3.3: Các chỉ, lồi và số chủng nam phân lập được từ các mẫu của vị thuốc huyền sâm nghiên cứu = a vỀ _ | Ham am 6 :

Địa điêm lây | Cách chê Tơng sơ chủng _.| Sd

ý lý 5 V8 dược liệu s - S6 chi

mau biên nâm nhiềm lồi

(%)

10 | 24LanOng | Phơi khơ 12,98 10 4 4

Tong 102 8 9

- Ham am của các mẫu dược liệu dao dong tu 8,11-18,33% Nhiéu mau

khơng đạt tiêu chuẩn về hàm âm theo Dược điển Việt Nam III (<14%) và 8/10

mẫu bị nhiễm nẫm mốc với tỷ lệ khác nhau Đã cĩ 9 lồi thuộc 8 chi phan lap được từ 10 mẫu huyền sâm ở các hiệu thuốc đơng được trên địa bàn Hà Nội

- Nhĩm nắm tiếp hợp Zygomyce(es cĩ mặt hầu hết các chi thường gap

la Rhizopus [hinh 7], Mucor, Syncephalastrum [hinh 8], Absidia, bắt gặp nhiều nhất trên các mẫu huyền sâm nghiên cứu và chiếm tỷ lệ chủng phân lập

Trang 34

32

Bảng 3.4: Các lồi và số lượng chủng phân lập được từ 10 mẫu huyền

sâm thu thập từ các hiệu thuốc đơng dược thuộc địa bàn Hà Nội 12 38 | 33 53: 1:36 | SJ 130 | S2 10 | 24 , Ty lé Chi |rõ |rõ |rố | tơ | rổ | tổ | ehh 26] | TB) og, Aspergillus A, niger 210) 0 010109 l ] 3,9 A parasiticus 0 1 0 0 | 0 0 l 0 2,9 Mucor sp ~37ololileleloloelaliy— 7 6,9 Rhizopus 6 () 0 6 | 3 |9 9Ð)!” 5SL0 27 26,5 Stolonifer | Absidia corymbifera 2 0 0 s13 /2'101 4 7 |3 28 27,5 Syacephalastrum 0 | 1 Gis (3 121812 160) 8 12 11,8 Racemosum Penicillium sp 0 0 0 ¿| 3) | |Ù | 4 |011 10 98 Paecilomyces 2 0 0 0101010 0 ] 0 3 2,9 variotti Fusarium sp l 1 0 2 | 2 l 0 0 1 0 8 7,8 Tong 16 3 0 |19115| 3 | 0119 117/10] 102 100

- Chi Aspegillus cé 2 loai duoc phan lap 1a A parasiticus xuat hién

3/10 mẫu nghiên cứu, chiếm 2,9% (3/102) tổng số chủng phân lập được Đây là lồi xuất hiện khơng nhiều trên vị thuốc huyền sâm nhưng cĩ khả năng sinh

độc tố aflatoxin nên cần được quan tâm nghiên cứu Bên cạnh đĩ cịn cĩ sự

xuất hiện của lồi 4 ziger bắt gặp 3/10 mẫu nghiên cứu và số chủng phân lập

được 3,9%% (4/102)

- Ngồi ra phải kê đến chỉ Pemicilliưm, một lồi nào đĩ của chỉ

Penicillium sp [hình 9], cĩ mặt 4/10 mẫu nghiên cứu, với số chủng phân lập

được là 10/102, chiếm tỷ lệ 9,8%

*%* Bàn luận

Trang 35

33

với 240 từ vị cam thảo) Điều này cĩ thể do quá trình chế biến đã cĩ tác dụng hạn chế đáng kể sự lây nhiễm nắm của vị thuốc này hay là cũng cĩ thể do thành phần hĩa học của cam thảo bắc phù hợp hơn với sự phát triển của vi

nam

-_ Cũng như vị thuốc cam thảo bắc ở vị thuốc này cũng xuất hiện các loai Aspergillus cé kha nang sinh déc t6 la A.niger va A.parasiticus, A.parasiticus la mét trong hai loai cé khả năng sinh độc tố aflatoxin như đã trình bày ở trên

-_ Nét nổi bật nhất ở vị thuốc này là ngành nâm tiếp hợp nhiễm với tỉ

lệ cao nhất Đây là điểm cần lưu ý trong quá trình bảo quản, bởi bên cạnh vai

trị gây hư hại các sản phẩm sau thu hoạch (do chúng là nhĩm hoại sinh mạnh) chúng cịn là nguy cơ gây ra các bệnh nắm cơ hội (Zygomyeosis) ở các đối tượng bị suy giảm miễn dịch và bệnh tiêu đường

- Cùng với kết quả nghiên cứu của các khĩa luận tốt nghiệp trước

chúng ta thấy chi 4spezgil¿s là chỉ nhiễm với tỉ lệ khá cao, cĩ mặt hầu hết

trên các cơ chất được nghiên cứu Tuy nhiên tùy vào từng loại cơ chất mà lồi

Aspørgilius xuất hiện với tỉ lệ khác nhau .1/lavus và A.parasifieus thường

xuất hiện trên các cơ chất chứa nhiều tinh bột, chất béo, protid, đường và các

cơ chất là quả và hạt thì tỉ lệ nhiễm thường cao [l, 7, 10] Bên cạnh đĩ ngành

Trang 36

34

hình 3.4: Lồi Rhi¿øpus síolonifer nhiễm

trên vị thuốc huyện sâm:

A: Khuẩn lạc nhiễm trên vị thuốc huyền sâm

Trang 37

35 B Hình 3.5: Lồi Syncephalastrum racermosun nhiỀm trên vị thuốc huyền sâm: D

A: khuẩn lạc nắm nhiễm trên vị thuốc

B, C, D: cau tric sinh bao tir kin

(sporangiospore) đạng chuỗi đặc trưng

+ xẻ

Trang 38

36

Hinh 3.6: Loai Penicillium sp nhiém trén vị thuốc huyền sâm:

A: Khuân lạc nắm trên vị thuốc huyền sâm

B,C, D: Cấu trúc sinh conidi đạng chổi 2 & D

Trang 39

Hình 3.7: Lồi Paecilomyces variotii

nhiém trén vi thuốc huyền sâm:

À: khuẩn lạc trên vị thuốc (mơi trường

PDA)

B, C, D: cau tric sinh conidi va conidi dae

trung cua loai

Trang 40

38

KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ

Kết luận

Qua nghiên cứu hệ vi nâm của hai vị thuốc cam thảo bắc và huyền sâm thu thập từ các hiệu thuốc trên địa bàn Hà Nội chúng tơi rút ra các kết luận Sau:

- Nhiều mẫu của 2 vị thuốc khơng đạt yêu cầu về hàm âm theo quy định

cua DDVN III va bi nhiém nam méc voi một dải chi và lồi tương đối rộng

trên các mẫu nghiên cứu

- Với vị thuốc cam thảo bắc hệ vi nắm gồm 10 lồi 8 chỉ với 240 chủng

nắm phân lập được 10 mẫu nghiên cứu trên mơi trường PDA ở 25°C Đã

phân lập được 10 lồi, § chi và 240 chúng, chỉ Aspergillus chiém vi tri cao

nhất ( 44,6%) trong đĩ lồi 4l miger là lồi phổ biến: cĩ tổng số chủng phân lập được cao nhất (72/240) chiếm 30% 4 Zzvus xuất hiện 4/10 mẫu, chiếm I 1,3% (27/240) tổng số chủng nắm phân lập được Ngành nắm

tiếp hợp xuất hiện phong phú với tỉ lệ phân lập được là 113 chủng chiếm

471% gồm lồ Rhizopus stolonifer, Absidia corymbftra,

Syncephalastrum racemosum, Mucor sp M6t s6 nganh nam khác với tỉ lệ thấp A fumigatus 3,3% , Alternaria alternata 1,3%, Fusarium sp.5,4%,

penicillium sp.1,7%

- Hệ vi nắm của vị thuốc huyền sâm gồm 9 lồi 8 chi voi 102 chủng phân

lập được trên mơi trường PDA ở 25°C Nganh nam tiếp hợp xuất hiện với tỉ lệ

cao nhat chiếm 72,5% với 74 chủng phân lập được Chỉ penicilium xếp vị trí

thứ 2, cĩ mặt 4/10 mẫu nghiên cứu, với số chủng phân lập được là 10/102, chiém ty 1é 9,8% Chi Fusarium xép vi tri tiếp theo với 8 chủng phân lập được

Định dạng
Số trang	44
Dung lượng	16,27 MB