Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội Nghiên cứu đa dạng loài thuộc chi aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn hà nội
Trang 1BO Y TE
TRUONG DAI HOC DUOC HA NOI
NGUYEN THI HOAI THU
NGHIEN CUU DA DANG LOAI THUOC CHI ASPERGILLUS TREN CAC VI THUOC HAT CAU VA CAT SAM DANG LUU HANH O CAC HIEU THUOC DONG DUOC THUOC DIA BAN
HA NOI
KHOA LUAN TOT NGHIEP DUOC SI
Trang 2MỤC LỤC
ĐẤT VĂN HH ccesemsncnvarcnesnneersonsmnrnrensanancensnensonsannnavesnnennronennentaneiecesninvisisiaasaieaes
ng TT TT ẳẰ-naraareaerrreeeeneeeessraeee 2
1.1 Tầm quan trọng trong kinh tế và y học của 4spergillus 2
1.1.1 Tam GUAM TONS ORS THAN VEE P TOE 2 sa srnnsnsssensssnrsisisiesnvensasewassanane 2
1.1.2 Tam quan trọng trong lĩnh vực kinh tẾ ceceeevsexcseesercecee 3 1.1.3 Những tác động bất lợi với nơng nghiỆp -.:-ccccccccecccccccxes 4
1.2 Một số nét chính về đặc điểm sinh học va phan loai chi Aspergillus4 1.2.1 Các đặc điểm sinh học của chỉ AspergiÏlus - ‹. ce-‹«+ 4
12.2 PROGR (GGE AOC CRE ASPET OUIUS necssansnesereseossssnnnsinialagss osasannns eanansenaaia T 1.3 Cac mycotoxin quan trong do các lồi của chi Aspergillus sinh ra 9 L5 Ì E1 1: CÚ HẰ ca cqgtaooudboiaodaa6ioasnadargslagceeaskbiae 10
I2 1.08 0,22 Tnanma Ả 1]
L339 ACU CRAIC PNABONG concvssecsseescensucsureccicesssnancccenssciusnamscecmeessenseuenaees II
1.3.4 Déc SỈ 00 TH KUÃ -cxxovcuonranagsoubsgxecagtaixycoswiliasvsbiisoisowii 12
1.4 Bénh do Aspergillus (asperglllosis) gầy ra ở người và động vật l2 1.5 Nghiên cứu đa dang loai cua chi Aspergillus trên được thảo ở Việt TT TT ae enu ae nen 0000466101 4ã014L04664eoL0161013856lkc344sxGlax3gã9i2sk8Gã5iã0823 3ú 13
Chương 2: ĐĨI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu, thiẾt bị s23 SE 3E xxx 16
211 DOF Oe MBTIEM COU sseciecccccxrsccsdsuecssrecsecuianserainunnamunniunesies 16 2.1.2 Mơi trường phân lập và xác định nắm Imốc -.: :- 16
ee, ee ee aeons eee seve 16
Trang 32.2.2 Phân lập, phân loại các chủng nâm nhiêm trên I0 mâu của vị OGG CCST SII IEE uauesesserrsnsensnisesemoreereeenemessrsisvesonnnnorgsramsee L7
2.3 Phương pháp HghIÊN EỨN caoneeaenariiairaaaaeiaaanasrossrssseeel-E
Ð.3!, Fluasin phân lêt KÃN, caaugaaigtanhibsiiBitiio880Si80201010801405080071miia 17
2.3.2 Phương pháp xác định hàm ẩm được liệu - - <5: 17
2.3.3 Phương pháp phân lập HÃM HIỐC 55c St ctececcictexervsrrserrvd 17
2.3.4 Phương pháp phân loại nắm ImỐc -2-+-©-<©-++©cce++++xse£x 18
Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 19 5-1 Hệ vĩ năm! trên 'vị (hước TÍN COW ssscccstssesiccsvescecrcesssccrccocasamomecconavn 19 %2, HỆ vi nhai trên TO CAE SID srcscncecscssnsscsscnntnnssnnrrenaserernneananoonansns 25 oO Wiehe, Mo r E bededeeeedeeeaedeeedteedaoeererree 31
Trang 4DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIET TAT
DĐVN IV : Dược điển Việt Nam IV
A flavus : Aspergillus flavus A aculeatus : Aspergillus aculeatus A niger : Aspergillus niger A fumigatus : Aspergillus fumigatus A ustus : Aspergillus ustus
A tamaril : Aspergillus tamarH
A parasiticus : Aspergillus parasiticus
A oryzae : Aspergillus oryzae
A soye : Aspergillus soye A terreus : Aspergillus terreus A carbonarius : Aspergillus carbonarius A.awamori —: Aspergillus awamori
PDA : Potato Dextrose Agar
AFPA : Aspergillus flavus and parasiticus Agar
CMA : Corn Meal Agar
Trang 5DANH MUC CAC BANG
Bang 3.1 : Cac loai cua chi Aspergillus phan lập được từ 10 mẫu vị thuốc hạt CữẪ! HETIÊN CỬ Net dành igagkiốt6i0g40i2ist9013)8i20942402108.066 00 6.40064480852930 331000441182 gG6aik04u0i 21 Bang 3.2: Cac loai nam phan lap duge thudc chi Aspergillus tir 10 mau thuốc
ba ng HE acne ee 27
DANH MỤC CÁC ẢNH
Ảnh 1.1: Cấu trúc sinh khối conidi đặc trưng của chỉ 41spergillus 7 Ảnh 3.2: Lồi 4 miger nhiễm trên vị thuốc hạt cau - - - 23
Anh 3.3: Loai A flavus nhiém trén vi thuốc hạt cau «- 5s<-<-: 24
Ảnh 3.4: Lồi 4 earbonarius nhiễm trên vị thuốc hạt cau - -5-5- 25
Ảnh 3.5: Lồi A4 Ømigafus nhiễm trên vị thuốc cát sâm - 29
Trang 6LOI CAM ON Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới:
ThS Trần Trịnh Cơng
Giảng viên bộ mơn VI sinh - Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội -
người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tơi những kiến thức quý báu
trong quá trình thực hiện và hồn thành khố luận
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Bộ mơn Vi sinh - Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã nhiệt tình giúp đỡ tạo mọi điều
kiện cho tơi thực hiện đề tài
Nhân dịp này, tơi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường cùng tồn thê các thầy cơ trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị
kiến thức, giúp đỡ tơi trong suốt thời gian học tập tại trường
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã luơn
giúp đỡ, động viên tơi trong suốt thời gian qua
Hà Nội, ngày IŠ tháng 05 năm 2010 Sinh viên
Trang 7ĐẶT VÁN ĐÈ
Dược liệu nĩi chung và các sản phẩm làm thuốc cĩ nguồn gốc thực vật
nĩi riêng, thường dễ bị nắm mốc xâm nhiễm và phát triển, nhất là trong điều
kiện khí hậu nĩng ầm như ở nước ta Khi bị nắm mốc xâm nhiễm và phát
triển, các sản phẩm này ngồi việc bị giảm chất lượng do bị biến đổi thành
phân hố học, biến màu, sinh các mùi vị khĩ chịu, thường bị nhiễm các độc
tố nắm (mycotoxins) Các độc t6 nay co thé gay ra nhiéu bénh cho con người và động vật gọi chung là các bệnh do độc tố nắm (mycotoxicoses), với các tác động từ cấp tính đến mạn tính, cĩ thê dẫn đến quai thai, ung thu, [4, 5, 18,
19]
Aspergillus là một chỉ nắm lớn, cĩ nhiều lồi sinh độc tố, lại chiếm tỷ lệ
cao về số lồi trong hệ nắm bảo quản (storage fungi) trên các sản phẩm sau
thu hoạch Trong một số các cơng trình nghiên cứu về hệ nâẫm nĩi chung và
các lồi nắm sinh độc tố va aflatoxin nĩi riêng trên một số vị thuốc cho thấy: trong các lồi nấm phan lap duge thi chi Aspergillus chiém ty 1é cao nhat đặc
biệt trong các vị thuốc cĩ nguồn Ốc qua, hat [5, 6, 7, 9, 10, 11, 16] Do vay việc xác định mức độ nhiễm các lồi của chi nắm này trên các loại cơ chất
khác nhau (các vị thuốc hay các dược liệu khác nhau) cĩ một vai trị quan
trọng trong việc phịng tránh các tác hại nĩi trên Tuy nhiên số vị thuốc được
nghiên cứu va mire d6 nhiém nam méc néi chung va chi Aspergillus noi riêng
cịn rất ít
Với mục đích, ý nghĩa đĩ, chúng tơi đã thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu đa dạng lồi thuộc chỉ Aspergillus trên các vị thuốc hạt cau và
cát sảm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đĩng dược thuộc địa bàn Hà Nội ”
Với mục tiều sau:
Phân lập và xác định các lồi thuộc chi 4spergi/s nhiễm trên hai vị thuốc
Trang 8Chương 1 : TONG QUAN
1.1 Tam quan trong trong kinh té va y hoc cia Aspergillus
Chi Aspergillus di dugc P.A.Micheli, một nhà nam hoc- linh muc xtr
Florence-Phap, m6 ta đầu tiên năm 1729, Ơng đã đặt tên như vậy bởi cầu trúc
sinh bào tử của chi giống aspergillium [19], một dụng cụ dùng trong các nhà thờ thiên chúa giáo để rảy nước thánh Sự giống nhau đĩ là tình cờ từ khi
nhiều thành viên của chi thực sự đã mang lại phước lành cho lồi người Tuy
nhiên một số lồi khác cũng trở thành mối nguy hại với con người như: là làm giảm phẩm chất của sản phẩm nơng nghiệp, sinh các sản phẩm chuyên hĩa
độc và gây ra nhiều bệnh cho con người và động vật Một số ân phẩm trong
thời gian gần đây đã đề cập tới các khía cạnh khác nhau về tầm quan trọng
kinh tế và y hoc cua chi Aspergillus (Bossche va cOng su, 1988; Bennet va Klich, 1992; Powell va céng su, 1994; Smith, 1994)
1.1.1 Tam quan trọng trong lĩnh vực y hoe :
Chi Aspergillus là một trong số các sinh vật phơ biến và phân bố rộng nhất trên trái đất Đề thích nghi với sự đa dạng về vị trí địa lý như vậy, chúng
đã sinh ra vơ số các chất chuyên hĩa Một số đã được con người khám phá
Jong & Birmingham (1992) đã tĩm tat 147 bang phát minh ở Mỹ, liên quan tới chất chuyền hĩa của chi Aspergillus trong thoi gian 20 nam tir 1971-1991
Nhiều phát minh khác cĩ liên quan tới chỉ Aspergillus di được cơng nhận trước và sau khoảng thời gian đĩ
Mét so bang phat minh lién quan tdi chi Aspergillus di céng bố các hợp chất dùng trong y học :
Trang 9- Một số chất kháng khuẩn, kháng nắm, chống khối u cĩ nguồn gốc từ các chất chuyển hĩa của 4søergillus như: thuốc kháng nam Candida thực nghiệm cinlofungin - một thuốc bán tơng hợp, cĩ nguồn gốc enchinocandin B, do Emerieella nidulands hoặc E rugulosa tạo ra (Huang và cộng sự, 1990)
1.1.2 Tâm quan trọng trong lĩnh vực kinh rễ
Lợi ích kinh tế lớn nhất của chỉ Aspergillus la su khai thac cdc enzym
và acid do một số lồi của chỉ nắm này tạo ra Hai sản phẩm cơng nghiệp
quan trọng nhất được tạo ra bởi các lồi của 44s/2¿rgilus là amylase và acid
citric
* Amylase là lồi mốc “koji” gồm A oryzae, A soye va A awamori
được dùng dé san xuất một số thực phầm và đồ uống như rượu sake, nước
chấm (soy sauce) Koji là một sản phẩm răn thu được khi nuơi cây nắm sợi ( thường là 44 oryzae) trên hạt (ngũ cốc và đậu tương) đã được dé chin Nam sé sinh ra amylase thủy phân tỉnh bột, tạo mùi vị và màu đặc trưng của sản phâm
( Hara và cộng sự, 1992)
Việc sản xuất anpha-amylase ttr A oryzae da dugc cap bang sang ché đâu tiên ở Mỹ cho một người Nhật là vào năm 1984 Bằng phat minh nay da thành điểm mốc quan trọng cho sự khởi đầu của ngành cơng nghiệp sinh học
từ nấm ở Hoa Kỳ
Ngày nay sản phẩm enzym nguồn gốc vi sinh vẫn được dùng để
thủy phân tính bột từ các loại hạt như ngơ thành đường Gia tri mat hang nay ở thị trường Mỹ ước đạt 100 triệu USD mỗi năm (Berka và cộng sự, 1992)
“+ Acid citric được dùng tạo vị ưa thích cho nhiều loại thực phẩm và
Trang 10và ngày nay vẫn được sản xuất vào khoảng 500 ngàn tấn mỗi năm (Roehr và cộng sự, 1992)
1.1.3 Những táe động bất lợi với nơng nghiệp
Các lồi Aspergillus ít khi gây bệnh trực tiếp trên các loại cây trồng ở ngồi đồng ruộng, trang trại Mặc dầu lồi 44 #aw„s đã được thơng báo là tác nhân gây bệnh ở lạc đang nay mam, hat sen & hé [5] va loai A niger la tác
nhân gây thối ngọn của cây lạc [4] Tác động chủ yếu của các thành viên chi
nắm này làm giảm phẩm chất, gây hư hỏng các sản phẩm sau thu hoạch và tạo ra mycotoxin trén cdc sản phẩm này
Do cac loai cla Aspergillus cé kha nang chiu nhiệt và khơ cao hơn các
chỉ nâm khác nên chúng là các vi sinh vật thường gây hư hỏng các sản phẩm
cĩ nguồn gốc thực vật như lương thực, dược thảo Hầu như các lồi phổ biến
của chỉ đều được phân lập trên các sản phẩm nơng nghiệp (Domsch và cộng
sự, 1980; Pitt & Hocking, 1997; Samson và cộng sự, 2000; Trần Trịnh Cơng,
2003)
1.2 Mot số nét chính về đặc điểm sinh học và phân loại chi Aspergillus
1.2.1 Các đặc điểm sinh hoc cia chi Aspergillus
Chi Aspergillus nam trong ho Moniliceae (Nam bơng), là một trong bon ho thudc b6 Hyphomycetes thuéc nhém nam bat toan (Deuteromycetes hay Fungi imperfecti) cha gidi Nam (Fungi) Chi Aspergillus do P.A.Micheli mơ tả đầu tiên năm 1729, được Eries chấp nhận năm 1832 và theo luật quốc tế về danh pháp thực vat, chi Aspergillus chinh thitc mang tên Aspergillus Micheli ex Fries Chi Aspergillus c6 nhittng dac diém sau:
Trang 11dày của các conidilophore thăng đứng Conidiophore được câu tạo bởi một
cuống (stipe) khơng phân nhánh, với phân phình to gọi là bọng (vesicle)
- Hệ sợi nắm: gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, khơng màu, vàng nhạt hoặc trong một số trường hợp trở thành nâu hay màu sẫm ở các vùng
khác nhau của khuẩn lạc
- Bộ máy mang bào tử trần: phát triển từ một tế bào đường kính lớn
hơn, thành tế bào đày hơn các tế bào lân cận của sợi nắm (tế bào chân -food
cell)
- Giá bào tử trần: phát triển từ tế bào chân, như là một nhánh của sợi nấm, gần như thắng gĩc với trục của tế bào chân và thường ở trên bề mặt cơ chất Giá bào tử khơng phân nhánh, khơng cĩ hoặc cĩ vách ngăn
- Bọng đỉnh giá: là phần phình to ở đỉnh của giá bào tử trần, thường cĩ dạng hình chùy, hình elip, hình gần cầu hay hình cầu, khơng cĩ vách ngăn
Bọng hữu thụ này mang các thê bình
- Thể bình (phyalide) : là tế bào trực tiếp sinh conidi năm trên các bọng đỉnh giá Các thê bình hoặc song song, hoặc hợp thành cụm ở phần đỉnh
bọng, hoặc xếp thành hình tia sát nhau trên tồn bộ bề mặt bong Thé bình
hoặc chỉ cĩ một tầng (uniseriate) hoặc hai tâng (biseriate) Trong các trường
hợp 2 tầng mỗi thể bình cấp một (cuống thể bình -metula) mang một cụm gom 2-3 (hoặc nhiều hơn) thể bình cấp hai ở phần đỉnh
- Các bào tử trần: được tạo thành noi tiếp nhau trong miệng thể bình, thành chuỗi hướng gốc (bào tử gần miệng bao giờ cũng non nhất, càng xa càng già) khơng phân nhánh Bào tử trần khơng ngăn vách thay đổi về hình
đạng kích thước, màu sắc, dâu vết ở mặt ngồi tùy từng lồi
- Khối bào tử trần (conidial head) : tất cả các chuỗi bào tử trần tạo
Trang 12Khối bào tử trần đỉnh bọng cĩ thể cĩ hình cột, hình câu hoặc hình tỏa trịn
(anh 1.1)
Ảnh 1.1 : Câu trúc sinh khối conidi đặc trưng của chỉ ⁄4spergilius
- Conidi (conidium) chi gom một tế bào, bề mặt nhẫn hoặc xù xì, cĩ
gai, khơng màu hoặc cĩ màu Một số lồi cĩ thé sinh té bao Hiille (Hiille cell)
cĩ thành nhẫn, dày, đơn độc hoặc thành từng chuỗi
- Sự hình thành Conidiophore cé thanh dày, cĩ phần đỉnh phình to gọi
là bọng là đặc trưng của chỉ 4spergilus Đặc điểm này của cho giúp phân biệt
với chỉ Penieillium và các chi khac cung nhom cua chi Penicillium
- Phân biệt các lồi của chỉ Asøergillus cơ bản dựa trên cầu trúc khối
conidi (conidial head), co sw hinh thanh ca cuống thể bình và thể bình, hoặc
chỉ hình thành thể bình, màu sắc conidi Màu sắc khuẩn lạc các lồi của chỉ
Aspergillus do mau co lién quan coi cac lồi cụ thé,
Trang 131.2.2 Phan loai hoc chi Aspergillus
- Nghiên cứu phân loai hoc chi Aspergillus dén nay da nhận diện được trên 200 lồi, Cơng trình đáng cha y nhat vé cho Aspergillus la cia Raper & Fennell (1965) Đã trải qua trên 40 năm song cơng trình vẫn luơn là câm nang quan trọng với nhiều nhà nấm học Đặc biệt là các nhà phân loại chi Aspergillus Tiếp theo phải kể đến là các cơng trình tĩm tắt những nét quan trong về phân loại học của 90 lồi thuộc chi Aspergillus cua Samson (1979) Viéc phan loai chi Aspergillus chu yéu dya trên các đặc diém hinh thai
- Nuơi cấy để nhận điện:
Các chủng được cấy tại 3 điểm trên mơi trường Czapek và MEA 2% và
ủ ở 25C Đối với các lồi nắm ưa khơ như 4 penicilloides, mot số lồi khác
va trang thai Eurotium co thê sử dụng các mơi trường Czapek và MEA với 20-40% đường kính Nuơi cấy các chủng tại 3 điêm trên các mơi trường, sử dung dia Petri thuỷ tỉnh tốt hơn các đĩa Petri bằng chất đẻo Hầu hết các lồi hình thành bào tử trong vịng 7 ngày Màu và cấu trúc của khối conidi (dạng cột hoặc phân kỷ) được quan sát tơt nhất băng kính hiền vi phân tích Do một số lồi của chỉ 4spergillus cĩ thể gây bệnh ở người, đặc biệt là A fumigatus nên cân cĩ biện pháp phịng tránh hít phải bào tử
- Khố phân loại các lồi cua chi thường gặp trên lương thực và các sản phâm cĩ nguơn gồc thực vật khác:
la Khuan lac ( KL ) co mau trang, den, vang, nau hoac xam 2
LD: Rois Tie as Ren HÀ EÊ:sscscseccossica664668445eu6sGossssas4gisa480ad4i 8
2a Khối conidi màu trắng, ướt A candidus
2b Khối conidi màu vàng, một số ngả màu nâu hoặc đen 3
3a Khối conidi cĩ màu nâu tối đến màu đen - - - A.niger 3b Khơi conidi khơng cĩ màu nâu, tơi hoặc màu đen nhưng cĩ màu
Trang 144a Khối conidi dạng cột thường cĩ màu nâu quế đến màu nâu hồng
HH vs vv 6o i:6 G5 ki L0C64G( 30295 EE OR A, terreus
4b Khối conidi khơng cé dang cột màu vàng hoặc nâu 3 5a Khối conidi màu ơliu đến nâu sáng, cuống khơng màu hoặc vàng nhật thường sinh tÊ bảo HUỦ :.ccc co 62c cn g0 02619 003601042 2ả5534 A, ustus
5b Khối conidi khơng cĩ màu ơliu đến nâu sáng, stipe khơng màu hoặc
vàng phát khổhg sinh Tổ bao LÀN ồn nga Ga 0A 626106016186 00ái 0s ải 6
ĩa Khối conidi cĩ màu vàng rong, conidi nhan dén rap min ar lic Sl a ay Re CN RRR NOC ARNEL CN Rar A, ochraceus
6b Khéi conidi mau nâu vàng, conidi khơng nhan hay rap min 7
7a Conidi được tơ điểm rõ nét băng các mụn cĩc và mau nho, vach
ngồi và trong cĩ thể phân biệt rỡ - ‹. -‹ << << <<: A, tamarii 7b Conidi hầu hết ráp, vách trong và ngồi khơng thể phân biệt được
áS\6ÿ46G0(G0840ã06884388ÿ6808G6006GI60X1S5SEX§GXNGBEGWR€WittibšiDESSIGIESSESSGiNsìiqœã A, wentii 8a Conidiophore mau nau điền hình, cĩ mặt tế bào Hũille và dạng hữu
LÍ: EYHIEGFT BÊ: is bisbcasGG004440060)0%ã0010s9)8G%8514420882004664Ä22/.king A, nidulans Sb Conidiophore khơng cĩ màu nâu điện hình, khơng cĩ dạng hữu tính DI IDI GENEatioaaabiekosuecuiOboCiekitegesiea “7 ọ
9a KL trên Czapek hoặc MEA hầu như bị giới hạn (đường kính KL t6 G15 gi Hữ6 ÍHDIẾÌ,.‹‹«««cccesceeoceckedictiSsavsididDanikodinbisxasaso tsasgsid 10
9b Khuẩn lạc phát triển nhanh hon, đường kính > 1,5 cm Il
10a KL co mau thay déi, khdi conidi 2 tang, déi khi cé té bao
DOUG icsiconavemareweauacsa panes DERSIOOIUS
Trang 1511a Trên mơi trường nuơi cấy già hoặc các mơi trường nước hoạt tính thấp, cĩ giai đoạn hữu tính „roi màu vàng A, glaucus
I1b Khơng cĩ dạng hữu tính Ezofiizm màu vàng 12
12a Khoi conidi mau xanh lá cây-vàng tới màu xanh lá câầy-vàng
I2b Khối conidi xanh da trời tới màu xanh lá cây tối ES 13a Khơi conidi chu yéu | tang, conidi màu xanh lá cây - vàng tơi, cĩ
107 A, parasiticus
13b Khối conidi 1 hoặc 2 tâng ‹ .-ccccccccccccccc 14
[4a Conidi cé gai nhỏ, xanh lễ cây VẬN co cao A, flavus I4b Conidi ráp hoặc nhãn khơng cĩ quy luật, màu ơliu-xanh lá cây
HỆ HE gọn nến an tu E8 Go GA GGSi24 331 CbSISA474001806kã4001240006AG:00883/10/2860261A%104440608 A oryzae 15a Khéi conidi hinh cét, bong hinh chuy réng, conidi rap đến cĩ ess tp am ese le cs pcr nasa ees nN Yeoman see A fumigatus
15b Khéi conidi khéng c6 dang cét, bong hinh chuy hep, thanh NI Gconeononerisebntandbeidtioliibibiesibidoouasiantasonlleskscaled A clavatus
1.3 Cae mycotoxin quan trọng do các lồi của chỉ Aspergillus sinh ra
Các mycotoxin la cdc san phẩm chuyển hố thứ cấp Khơng giống như các chất kháng sinh kháng khuân chúng khơng chỉ độc đối với các vi sinh vật mà cịn độc với cả người và động vật Các tài liệu về mycotoxin rất phong phú trong phạm vi của khố luận, chúng tơi chỉ đề cập tĩm tắt về các mycotoxin chu: yéu cia chi Aspergillus, di được tham khảo từ các tài liệu của
các tác giả như: Richard & Thurston, 1968; Frivad & Samson, 1991;
Golinski, 1991; Smith & Henderson, 1991; Pier & Richard, 1992; Etzel,
Trang 1610
Penicillium nhung trong pham chi cơng trình này chúng tơi chỉ liệt kê các lồi của chi Aspergillus
1.3.1 Dée to Aflatoxin
Aflatoxin là mytocoxin cĩ tầm quan trọng nhất về mặt kinh tế và y hoc
Trong các mycotoxin thì aflatoxin là độc tố được phát hiện sớm nhất và
nghiên cứu kĩ lưỡng nhất Đây là một nhĩm các độc tố, chủ yêu do hai lồi A flavus va A paraciticus tao ra Trong đĩ cĩ 4 chất quan trọng nhất được đặt
tên là a/afoxin B,, B,, Œ,, Œ„ Ngồi ra, cịn cĩ các sản phẩm chuyền hĩa
mà đáng quan tâm nhất la: aflatoxin M, va aflatoxin M, Dang déc nhat ctia aflatoxin 1a aflatoxin B, Cac aflatoxin it hoac kh6ng bi phan hty khi đun nấu
binh thuong
Aflatoxin thường được tạo ra trong các loại hạt cĩ dầu, hạt bơng, ngơ,
lạc và các loại quả hạch, trong điều kiện khơ hạn trên đồng ruộng và trang trại [4 15, 18, 25] Độc tố này cĩ thê được hình thành hầu như trên bất kỳ các loại hạt bảo quản, cĩ điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nam (Diener va
cộng sự, 19&7) Sự lây nhiễm trong và sau thu hoạch thường do khơng được làm khơ nhanh chĩng, cũng như bao quan cĩ hàm am quá mức cho phép Sự
phá hoại của các lồi gặm nhâm và cơn trùng (sâu, mọt, .) cũng là yếu tổ thuận lợi cho sự xâm nhiễm của nấm mốc đối với quả, hạt trong giai đoạn bảo
quản
Sự phát triển của nấm và sự lây nhiễm aflatoxin là hậu quả của sự tương tác giữa nấm, cơ chất và mơi trường Tác động thuận lợi của mơi trường với từng chủng nắm và những nhân tố khác sẽ quyết định đến loại và
hàm lượng aflatoxin được sinh ra Sự phù hợp của cơ chat cho nam phat trién
Trang 171]
những nhân tơ tác động tích cực giúp nấm mốc xâm nhiễm, phát triển và sinh
độc tố
Đây cũng là một trong số ít các độc tổ được cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ giám sát chặt chẽ và là độc tố được nghiên cứu nhiều nhất,
trong số các độc tơ nắm Một mycotoxin được biết rõ nhất về các khía cạnh
sinh học và sinh tơng hợp
Khả năng gây bệnh của aflatoxin là rất nguy hiểm, với hàm lượng lớn
chúng cĩ thể gây ngộ độc cấp với các biểu hiện như: nơn, đau bụng, tiêu chảy, dị ứng, mắn ngứa, hoại tử tế bào gan, xuất huyết và thường dẫn đến tử vong Ở mức độ thấp hơn làm giảm tốc độ phá triển và gây tốn thương hệ
thơng miễn dịch cơ thê Gan là tơ chức nhạy cảm nhất đối với aflatoxin, sự
phơi nhiễm mãn tính aflatoxin dẫn đến ung thư gan ở người và động vật [2] Năm 1988, với những bằng chứng thuyết phục về mối quan hệ giữa aflatoxin chế độ ăn và ung thư tế bào gan của các điều tra dịch tế học ở châu Á và châu Phi tổ chức nghiên cứu ung thu quéc té (International Agency for Research on Cancer) da xép Aflatoxin B , vao danh sach cac chất ung thư ở người [2]
1.3.2 Độc tố Sterifmatocystin
Độc tố %erigmafoeystin khơng được cho là phơ biến trên lương thực, thực phẩm và thức ăn, gia súc tuy nhiên nĩ là một tiền chất trong con đường sinh tơng hợp của aflatoxin Tương tự aflatoxin nĩ là một chất độc với gan và
gây ung thư
Các lồi đã được cơng nhận cé kha nang sinh déc t6 nay 1a Emericella nidulans, E quadrilineata, E rugulosa, A versicolor
1.3.3 Acid cyclopiazonic
Trang 18thận ảnh hưởng tới chuyển hố của acid béo và gây tử vong ở liều cao Các lồi được quan tam 1a A flavus, A oryzae, A tamarii
1.3.4 Déc t6 ochratoxin A
Độc tố oehrzfoxin 4 xuất hiện chủ yếu trên ngơ, dai mach va lúa mỳ,
đặc biệt ở các nước xa xích đạo như Canada, Đan Mạch Ở các vùng này độc
tơ được tạo ra chủ yếu là do các thành viên của chỉ Perieilium trong đĩ ở các vùng nhiệt đới sự xuất hiện của độc tố thường liên quan tới lồi A ochraceus
Độc tố này cĩ khả năng gây quái thai, ung thư và mục tiêu đầu tiên bị
tân cơng là thận Đối với gia cầm gà, vịt nuơi độc tơ này cũng gây tác động tới hệ thần kinh trung ương Với liều thấp ở gia cầm xuất hiện các triệu chứng
như giảm độ phát triển, giảm sản lượng trứng đồng thời cũng gây khả năng
tạo kháng thể Ở người ochratoxin A4 đã từng được cho là căn nguyên của sự phát bệnh thận ở vùng Balkan [20]
Các lồi đã được cho là cĩ khả năng sinh độc tố này là A alliaceus, A melleus, A ochraceus, A ostianus, A sclerotiorum, A niger, A carbonarius
1.4 Bénh do Aspergillus (aspergillosis) gay ra ớ người và động vật Hầu như các bệnh ở người gây ra do Aspergillus (aspergillosis) đều liên quan tới hiện tượng ức chế miễn dịch Các bệnh nhân này thường là dẫn đến tử vong Do số người bị ức chế miễn dịch ngày một tăng lên trong cộng đồng, sự lây nhiễm do nam Aspergillus cé mét vai tro quan trong trong cac bénh co hội trong đĩ khoảng 90% các trường hợp nhiém Aspergillus 1a liên quan đến A ƒfumigafus, một lồi phân lập được với tỷ lệ khá cao trên dược thảo ở địa
ban Ha Ndi [5, 12, 14] Tiép sau la cac loai A flavus, A terreus, A niger, A
nidulans va A ochraceus Cac truong hop it de doa tới tính mạng hơn là các trường hợp viêm xoang , viêm mũi khơng do x4m lan do Aspergillus va cac
Trang 19các đối tượng cĩ biểu hiện liên quan tới thâm quyền miễn dịch (Bossche và céng su, 1988; Young, 1990; Dixon va Walsf, 1992; Latge, 1999) [17, 25]
Mot nhém loai eta chi Aspergillus vira gay cdc bénh & ngudi déng thdi cũng gây các bệnh o dong vat trong dé A flavus la căn nguyên chủ yéu Cac
bénh do Aspergillus gay ra ở lớp chim thường ở hệ hơ hấp Một thống kê ước
tính cĩ khoảng 10% tổn thất đối với gà giị (gà 10-12 tháng tuổi) do các bệnh
của Aspergillus gây ra và việc cải thiện điều kiện vệ sinh ở các lị ấp trứng đã làm giảm đáng kê tỷ lệ bệnh này Tỷ lệ sảy thai ở gia súc do nắm cũng là căn nguyên chủ yếu tác động tới 10% số lượng bị chửa trong một đàn (Pier &
Richarf, 1992) Các bệnh ở người do phơi nhiễm trong nhà đã trở nên càng
ngày càng quan trọng hơn Các điều tra về mơi trường bên trong các nhà ở
(indoor) cho thay hau như luơn cĩ mặt các thành vién cia chi Aspergillus Danh sách các lồi nắm phé bién nhất phân lập được trong nhà ở đã được Samson & cộng sự cơng bố năm 2000 và 2002 Trong số đĩ rất nhiều lồi của chỉ Aspergilus phố biển ở mơi trường bên ngồi nhà ở (outdoor) như 4 niger, A terreus, A fumigatus, A flavus, va nhiều lồi nắm ưa khơ khác
nhu A restrictus, A penicilloides, Eurotium herbariorum, F chevalieri,
nhiều người đơi khi bị các triệu chứng khơng giống với các hiện tượng dị ứng
Điều đĩ đã được dự đốn là do sự đáp ứng của cơ thê đối với các mycotoxin
hoặc các hợp chất hữu cơ bay hơi từ nắm mốc nhưng vẫn chưa cĩ một bằng
chứng khoa học dé hé tro cho gia thuyét nay (Burge, 2001)
1.5 Nghiên cứu đa dạng lồi của chỉ 4spergiH„us trên dược thảo ở Việt Nam
Sự phát triển của ngành y học cỗ truyền ngày càng lớn mạnh đã làm
cho khối lượng và chủng loại dược liệu đặc biệt là các dược liệu cĩ nguồn gốc
thảo dược ngày càng tăng cả về lượng tiêu dùng cũng như lượng bảo quản,
Trang 2014
tiêu dùng cho thấy các loại được liệu rất dễ bị nhiễm nắm mốc nhất là trong
điều kiện khí hậu nĩng 4m và cơng tác giám sát cịn chưa được chặt chẽ như ở nước ta hiện nay
Tuy nhiên các cơng trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nắm mốc và độc
tố nấm trên dược liệu cịn rất ít Mặc dầu vậy cũng đã cĩ một số cơng trình đáng chú ý Đĩ là cơng trình nghiên cứu về hệ nắm mốc đặc trưng trên dược liệu ở kho của tác giả Nguyễn Thị Sinh năm 1984 [12] Một số dẫn liệu quan trọng giúp định hướng cho các cơng trình nghiên cứu tiếp theo về nắm mốc và
mycotoxin trên dược liệu mà tác giả đã cơng bố là: hệ vi nằm đặc trưng trên
được liệu bảo quản trong đĩ nỗi bật là sự cĩ mặt các lồi của 2 chỉ Aspergillus
va Penicillium, dic biét là sự xuất hiện ctia loai A flavus trén 80% dược liệu nghiên cứu Ngồi ra tác giả cũng cho biết độ âm tương đối tối thiểu cần thiết cho sự phát triên của hệ vi nấm được liệu ở kho là 75%
Cơng trình nghiên cứu về hệ vi nắm trên các vị thuốc đơng được trên địa bàn Hà Nội của các tác giả như : Trần Thị Huyền [7], Trần Thị Nguyên [10], Nguyễn Đình Hịa [6] và một SỐ cơng trình khác của các tác giả như Nguyễn Thị Lý [9], Phan Thị Bích Vân [16] nghiên cứu về sự đa dạng lồi
của chỉ Aspergilius trên một số vị thuốc đơng duoc cho thay chi Aspergillus la
chỉ xuất hiện nhiều nhất, trong đĩ lồi xuất hiện phỏ biến nhất là 4 /avws, A parasiticus, A niger va A fumigatus
Một cơng trình khác mang ý nghĩa thăm dị của tác giả Nguyễn Hữu
Tuan [13], Mai Thi Anh [1], Trần Ánh Phượng [1 1] về sự cĩ mặt của lồi 4
flavus và kha năng tạo aflatoxin trên dược liệu đã cho thay tỷ lệ nhiễm A
flavus \a kha cao
Cơng trình nghiên cứu gân đây của tác giả Trần Trịnh Cơng [5] va
Phùng Kế Toại [14] nghiên cứu về mức độ nhiễm các lồi của chỉ Aspergilus
Trang 2115
bàn Hà Nội Kêt quả của cơng trình đã cung câp cho chúng ta những băng
chứng cụ thể về mơi đe dọa tiêm tàng của các lồi thuộc chi này và độc tơ
Trang 2216
Chương 2: ĐĨI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
20 mẫu của các vị thuốc hạt cau và cát sâm được thu thập từ các hiệu
thuốc đơng được thuộc địa bàn Hà Nội (chủ yêu là phố Lãn Ơng) chuyển về phịng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phịng trước khi phân lập và phân loại nấm Thời gian thu hoạch mẫu trong khoảng từ tháng 1 1/2009 - 3/2010
2.1.2 Mơi trường phân lập và xác định nắm mĩc
- Mơi trường PDA (Potato Dextrose Aøar) (g/]): Glucose : 20g; thach :
15g ; Dich chiét khoai tay : Ilit Khử trùng ở 121C trong 15 phút
- MG6i truong Czapek-Dox (g/l): Sacarose: 30g; NaNO;: 3,0g; KCI: 0,5g; K;ẴHPO:: 1,0g; MgSO¿.7H;O: 0,5 g; FeSO¿.7H;O: 0,01g; Thạch: 17,5g; Nước cất vừa đủ 1000ml Khử trùng ở 121C trong 15 phút, pH = 6,2 + 0,2
- Mơi truong AFPA (Aspergillus flavus and parasiticus Agar):
Peptone: 10g; Cao nam men: 20g; Sat amoni citrat: 0,5g; Chloramphenicol:
0,1ø; Thạch: 15g; Nước vừa đủ Llit Khir tring 6 121°C trong 15 phit
- Mơi trường CMA (g/I): Bột ngơ :60g: Thạch: 15g: Nước cất vừa đủ
I lít Khử trùng ở 121°C trong 15 phut
2.1.3 Thiết bị thí nghiệm
- Kính hiên vi Axiostar plus (Carl Zeiss-Đức , gắn máy chụp ảnh kĩ thuật số SONY-Nhật Bản)
- Tủ cây vơ trùng BIOAIR, Cộng hịa liên bang Đức
Máy đo độ âm Precisa (Thụy Sĩ)
Nồi hấp tiệt trùng Cân kĩ thuật
Trang 2317
2.2 Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Phản lập, phán loại các chủng nắm nhiễm trên 10 mẫu của vị
thuốc hạt cau nghiên cứu
2.2.2 Phán lập, phân loại các chủng nắm nhiễm trên 10 mẫu của vị thuốc cát sâm nghiên cứu
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp lẫy mẫu
Phương pháp lây mẫu dựa trên cơ sở phương pháp của FAO [20] Mẫu dược liệu được trộn đều,chia theo phương pháp đường chéo, lây khoảng 0,5-
Ikg làm mẫu đại diện Mẫu đại diện lại được trộn đều, lấy một phần tư theo
phương pháp chia theo đường chéo để nghiên cứu
2.3.2 Phương pháp xác định hàm am dược liệu
xác định bằng máy đo độ âm Precisa: được liệu được nghiền thơ, đường kính khơng quá 3mm, sau đĩ cho khoảng 1g được liệu đã nghiền vào đĩa cân, đậy nắp cân chờ ồn định và đọc kết quả
2.3.3 Phuong phap phan lap nam moc
Phương pháp phân lập nấm mốc dựa trên dược liệu được áp dụng trên cơ sở của phương pháp Samson và cộng sự [24] Mức độ nhiễm nam mốc được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa số chủng nắm của các lồi nhiễm từ bên trong các vị thuốc so với tơng số chủng nam phân lập được Các mẫu dược liệu được phân lập nắm mốc bằng phương pháp đặt trực tiếp trên mơi trường
PDA hoặc CMA Với hạt cau số lượng hạt đặt đề phân lập là khoảng 40-60g trên một mẫu, với cát sâm số lượng để đặt là 10-30 ø/mẫu,được cắt nhỏ thành
các mẫu cĩ kích thước khoảng I-1,Sem (hạt cau cĩ thể giữ nguyên hạt) Các mẫu dược liệu được khử trùng hệ nâm bên ngồi bằng cách ngâm trong dung, dich Natri hypochlorid 1% mới pha trong 2 phút Sau đĩ rửa sạch bằng nước
cất khử trùng Đề ráo nước và đặt nhanh các mẫu dược liệu vào đĩa Petri đã
Trang 2418
cĩ mơi trường PDA hoặc CMA bằng kẹp vơ trùng Mỗi đĩa đặt 5-10 mẫu tùy
theo kích thước của từng vỊ.Sau đĩ các đĩa được ủ ở nhiệt độ 25”C, cùng với
các đĩa đối chứng (khơng cĩ dược liệu) Sau 3-5-7 ngày, tiễn hành phân lập các chủng nắm mốc chuyển sang cấy vào mơi trường Czapek-dox, ủ ở 25°C,
sau 3, 5 va 7 ngay tiên hành các bước phân loại và kết luận Trên cơ sở đĩ
tính %4 mức độ nhiễm các lồi nắm nĩi riêng của từng vị thuốc so với tổng số
chủng nắm phân lập được (chỉ số cĩ mặt của lồi)
2.3.4 Phương pháp phân loại nắm mốc
Cơ sở chủ yêu của phương pháp phân loại là so sánh các đặc điểm hình thái vi học, khuẩn lạc của các chủng nắm trên các mơi trường nuơi cấy chuẩn:
- Phân loại các lồi của chỉ Aspergillus dua theo mé 1a chỉ tiết của các
loai, khéa phan loai cua Raper & Fennell, 1965 [23], Pritt & Hocking, 1985 [22], Samson va cac cong su, 1995 [24]
- Xác định hai lồi A4 /avus, A parasiticus theo phuong pháp hố sinh của Pitt & Hocking [22]: cac chung cua 2 loai A flavus va A parasiticus khi
cay trên mơi trường AFPA và ủ ở nhiệt độ 30C sau 42-48h sẽ xuất hiện màu
Trang 2519
Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Hệ vi nắm trên vị thuốc hạt cau
Hạt cau (Semen Arecae catechi) tên thường gọi là Binh lang, tân lang là hạt đã phơi hoặc sấy khơ lấy từ quả chín của cây cau (Areca catechu L.) thuộc họ cau (Arecaceae) Yêu cầu về hàm 4m cia DDVN IV (2009) là khơng quá
10,0% Thành phần hĩa học của hạt cau là: alcaloid (arecolin, arecallin,
guvaxin va guvacolin), tanin catechin, lipid, glucid, alcaloid va muối vơ cơ
[8] Theo y học cỗ truyền, hạt cau cĩ tính: ơn, vị: tân, khổ, quy vào kinh vị,
đại trường Cơng năng, chủ trị: Sát trùng, tiêu tích, hành khí thơng tiện, lợi
thủy, chủ trị: trừ giun sán, sốt rét, tiêu bí, buốt rắt, bụng đây trướng, đại tiện
táo kết [2]
Chúng tơi đã tiễn hành điều tra phân lập, phân loại các chủng nắm của
lồi thuộc chi 4sergi//zs nhiễm trên 10 mẫu của vị thuốc hạt cau, được thu
Trang 2620
Bang 3.1 : Cac loai cia chi Aspergillus phan lập được từ 10 mẫu vị
thuốc hạt cau nghiên cứu
Hàm âm Số lượng chúng nam phan lip được
TT| Dia Diem của hat A, A A A A, Ae Tong ‘
(%) flavus fumigatus niger HSHS carbonarius | tamarii 1 10 L.O a 3 4 | 2 2 13 2 52 L.O 9.11 0 13 27 0 | 2 43 3 57 L.O 14,49 2 5 16 0 2 l 26 4 30 L.O 8.39 0 2 2 2 0 0 6 5 38 L.O 12,48 0 l 2 0 0 0 3 6 36 L.O 14.59 2 3 34 0 2 0 41 7 12 L.O 13,77 3 2 9 0 3 0 17 8 33 L.O 10.54 0 2 4 3 0 2 IÍ 9 53 L.O 11,94 2 6 3 0 0 0 II 10 41 LƠ 8.69 0 0 7 0 0 8 Tong 12 38 105 6 T 7 179 Tỷ lệ chúng phân lập được(1%) 6,7 21,2 58,7 3,4 6,1 3,9 100
Qua kết quả phân lập các lồi nam thudng gap cla chi Aspergillus duoc trình bay 6 bang 3.1 cho thay:
“+ Tat ca 10 mẫu vị thuốc hạt cau nghiên cứu cĩ hàm âm dao động từ 7,71 - 14,59%, đều bị nhiễm các lồi nấm bảo quản phổ biến của chỉ Aspergilius Kết quả này cho thấy sự phù hợp với các kết quả của nhiều tác giả khi phân lập các lồi của chỉ nắm này trên các sản phâm sau thu hoạch nĩi
chung và dược thảo nĩi riêng [Š, 6, 7, 9, 10, II, 16] |
Trang 2721
A earbonarius Kết quả này cho thây sự lây nhiễm phổ biến của chỉ nam này
trên các cơ chất dược thảo sau thu hoạch, nhất là các loại quả và hạt
Trong 6 lồi nắm phân lập được, chiếm vị trí số một là loai A niger [ảnh 3.2], cĩ số chủng là 105 trong tổng số 179 chủng nam phân lập được, với
số chủng dao động 1-34/ mẫu dược liệu
% Xếp thứ hai là lồi ⁄1 /migarws, xuất hiện 9/10 mẫu nghiên cứu, với sơ chủng dao động 1-13/mẫu dược liệu Cĩ số chủng phân lập được là 38, trong số 179 chủng của chỉ phân lập được, chiếm 21,2%
s* Lồi 4 Ølavus [ảnh 3.3] chiếm vị trí thứ ba về số chủng nắm phân lập được (12 trong tổng số 179 chủng của lồi thuộc chi đã phân lập được)
chiếm tỷ lệ 6,7% Xuất hiện 5/10 mẫu nghiên cứu, với sỐ chủng dao động 2-
4/mẫu nghiên cứu
s* Ngồi 3 lồi chủ yếu trên, chúng tơi cịn phân lập được ba lồi khác
Trang 2822
| Linh
CỬA HÀNG 36 LÀN ƠNG
Chuyên bán thuốc : Nam - Bắc Sam, Tam that, Linh chi
Các loại thuốc ngâm rượu
ĐT : 04.3923 0893 NR: 04.3927 4657 DĐ: 0981 555 1964
Cửa hang: 36 Lan Ong
Nha riéng: 39 Lan Ong
Anh 3.2: Loai A aiger nhiém trén vị thuốc hạt cau:
A: vị thuốc hạt cau trước phân lập B: khuẩn lạc nắm nhiễm trên dược liệu
(mơi trường PDA)
Trang 2923 D Anh 3.3: Lồi A flavus nhiém trên vị thuốc hạt cau:
A: khuẩn lạc nắm(màu xanh hơi vàng) nhiễm trên vị thuốc(mơi trường PDA) B, D: Cấu trúc sinh conidi 1 tầng và 2
tầng của lồi
C: Hình thái conidi(bao tử vơ tính) của
Trang 3024
Ảnh 3.4: Lồi A.carbonarius nhiém
trên vị thuốc hạt cau:
A: khuẩn lạc nắm nhiễm trên vị thuốc
hạt cau(mơi trường PDA)
B, C & D: conidi và cấu trúc sinh
conidi đặc trưng của lồi(c uống thể
bình to và các thể bình bé bắt màu
Trang 3125
3.2 Hệ vi nấm trên vị thuốc Cát Sâm
Cát sâm (Radix Millettiae speciosae) là rễ củ đã phơi hoặc sây khơ của
cây cát sâm, thuộc họ Đậu (Fabaceae) Yêu cầu độ ầm của DDVN IV (2009)
đối với cát sâm là khơng quá 12% Thành phần hĩa học chủ yéu 1a alcaloid [8] Cát sâm cĩ vị cam, tính : bình, quy kinh: phế, tỳ Theo y học cổ truyền, cát sâm cĩ cơng năng, chủ trị: sinh tân chỉ khát, nhuận phế, lợi tiểu, chủ trị: tân dịch hao tổn, háo khát, ho do phế nhiệt, đái buốt rắt Sao vàng: bố tỳ, ích khí, tiêu đờm, tâm gừng: ích tỳ, tâm mật: bồi dưỡng cơ thê, chủ trị cơ thể suy
yếu, nhức đầu, khát nước, sốt về chiều, bí tiểu tiện [2]
Chúng tơi đã tiến hành phân lập, phân loại các lồi của chỉ Aspergillus
Trang 3226
Bảng 3.2: Các lồi nắm phân lập được thuộc chỉ Aspergillus tiv 10 mẫu thuơc cát sâm nghiên cứu Ham am Số lượng chúng nắm phân lập được or me của hạt A A A A, A A Tơng nee (%) parasiticus | fumigatus | niger | ustus aculeatus | tamarii 1 | LO 9,95 0 0 4 0 0 0 4 2 | 52L.0 9.47 Ï 2 14 0 0 0 17 3 | 57L.O 9.85 0 2 0 | 5 4 | 30L.0 15,52 0 5 0 0 0 6 § | 38L.0 12,53 0 3 9 0 3 I 16 6 | 36L.0 921 3 2 0 0 l 0 6 7 | BLO 10,34 0 0 0 0 0 0 0 8 33 L.O 9.74 0 3 2 0 2 0 7 9) | 534.0 13,56 2 0 5 2 0 i 10 10 | 41L.0 11,89 0 ] 0 0 3 Tong 8 I 42 4 6 3 74 TY lé ching(%) 10,8 14,9 56,8 5,4 8,1 4,1 100
° Từ các kết quả của bảng 3.2 cho thấy các mẫu cát sâm cĩ hàm
ầm dao động từ 9,21-15,52% đã bị nhiễm các lồi nắm bảo quản của chi
Aspergillus
° Từ 10 mẫu thuốc nghiên cứu đã phân lập được 74 chủng nấm
thuộc 6 lồi của chỉ Aspergillus gém: A niger, A fumigatus, A parasiticus, A aculeatus, A ustus va A tamarii
e Trong 6 loai nam phân lập được, chiếm vị trí số một là lồi 4 niger, xuất hiện 8/10 mẫu nghiên cứu, với số chủng dao động 1-14/mau nghiên cứu Số chủng phân lập được là 42 trong tổng số 74 chủng nắm của cho phân lập được, chiếm tỷ lệ 56,8%
Trang 3327
lập được là I1, trong tổng số 74 chủng của chi phân lập được, chiêm tỷ lệ
14,9%
» Lồi chiếm vị trí thứ 3 về số chủng nắm phân lập được ( § trong
tơng số 74 chủng của các lồi thuộc chỉ đã phân lập được) là 4 parasificus
[anh 3.6], chiém ty lé 10,8%, xuất hiện 5/10 mẫu nghiên cứu, với số chủng dao động từ I-3/mẫu được liệu
° Ngồi 3 lồi trên, chúng tơi cịn phân lập được ba lồi khác là 4
Trang 34B
Ảnh 3.5: Loai A fumigatus nhiém trén
vị thuốc cát sâm:
A: khuẩn lạc nắm nhiễm trên vị thuốc
(mơi trường PDA)
B, C va D: cấu trúc sinh conidi đặc
trưng của lồi
Trang 3529 > Anh 3.6: Loai A.parasiticus nhiém trén vị thuốc cát sâm: A, B: khuẩn lạc nắm trên vị thuốc(mơi trường PDA)
C, D: Cấu trúc sinh conidi 1 tang va
Trang 36B
Anh 3.7: Loai 4 aculeatus nhiễm trên
vị thuốc cát sâm:
A: Khuấn lạc nắm nhiễm trên vị
thuốc(mơi trường PDA)
B, C & D: Conidi và cầu trúc sinh
conidi đặc trưng của lồi
30
Trang 373]
3.3 Một số ý kiến bàn luận
Qua kết quả nghiên cứu đa đạng lồi của chỉ Aspergillus trên 2 vị thuốc
hạt cau và cát sâm, chúng tơi cĩ một SỐ y kiến bàn luận sau:
“_ Lồi 4 miger đều cĩ sơ chủng phân lập được trên 2 vị thuốc, đây là
lồi cĩ khả năng sinh độc tố orchratoxin A, một mycotoxin gây hại thận ở cả
người và động vật, cần được quan tâm nghiên cứu phịng tránh Tuy nhiên ở vị thuốc hạt cau, số chủng phân lập được cao hơn gấp 2.5 lần so với số chủng nắm phân lập được từ cát sâm Điều này cho thấy sự nhạy cảm của các loại
quả, hạt đối với các lồi của chi nắm này
« 4 fumigatus la loai nam sợi gây các bệnh nam cơ hội (aspergillosis) phơ biến cả ở người và động vật trên phạm vi tồn cầu, cần cĩ biện pháp phịng tránh lây nhiễm, nhất là khả năng hít phải bào tử trong quá trình tiếp xúc
= Loai A flavus ( cé mặt 5/10 mẫu hạt cau nghiên cứu, với số chủng dao động 2-3/mẫu) và A parasificus (xuất hiện 5⁄10 mẫu cát sâm nghiên cứu
với số chủng dao động từ I-3/mẫu) là hai lồi cĩ khả năng sinh độc tố
aflatoxin (một chất gây ung thư ở người và động vật) chủ yếu Mặc dù khơng phải là cơ chất thuận lợi cho sự phát triển của hai lồi nẫm này song cũng cần được quan tâm nghiên cứu do tính chất nguy hại của hai lồi này
= Loai 4 famarii tuy chỉ số cĩ mặt (số mẫu cĩ mặt) và chỉ số cĩ nhiều (số chủng phân laaoj được) khơng cao như ba lồi trên, nhưng đây là
một lồi cĩ khả năng sinh acid cyclopiazonic (một mycotoxin gây hoại tử gan
và Ống thận) cũng cần được quan tâm
Trang 3832
da bi nhiém nam 6 giai đoạn trước thu hái hoặc giai đoạn thu hái, bảo quản
hoặc chế biến Do vậy để cĩ các biện pháp phịng tránh nấm mốc và độc tơ
nấm mốc cĩ hiệu quả cần nghiên cứu mức độ nhiễm nấm trên dược liệu ở cả
các giai đoạn trước thu hái và thu hai
» Mot sé mau của hai VỊ thuốc mặc dầu cĩ hàm âm cao hơn, nhưng
lại cĩ số chủng nắm và lồi phân lập được thấp hơn Điều này cĩ thể do các
mẫu dược liệu cĩ nguồn gốc khác nhau (được trồng ở các địa phương khác
nhau, điều kiện thu hái, bảo quản, chế biển khác nhau), bị tác động bởi yếu tố sinh thái khác nhau Hàm ẩm của dược liệu chỉ là một yếu tố thuận lợi cho sự xâm nhiễm va phát triển của nắm Khi hàm ẩm thấp thì sự xâm nhiễm và phát triển của nắm bị hạn chế hoặc khơng phát triển, nhưng khơng cĩ nghĩa hàm
Trang 3933
KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ
Kết luận
Sau khi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa dạng lồi của chi 4spergillus
trên các vị thuốc hạt cau và cát sâm đang lưu hành ở các hiệu thuốc đơng
dược thuộc địa bàn Hà Nội”, chúng tơi rút ra một số kết luận sau:
° 20 mẫu của hai vị thuốc hạt cau và cát sâm được lay từ các hiệu thuốc đơng dược thuộc phố Lan Ong, Hà Nội, đã bị nhiễm 7 lồi nắm của chỉ
Aspergillus gơm: A flavus, A parasiticus, A fumigatus, A niger, A tamarii, A ustus va A aculeatus
° Với vị thuốc hạt cau đã cĩ 179 chủng, thuộc 6 lồi của chỉ Aspergillus phân lập được từ I0 mẫu vị thuốc nghiên cứu, được thu thập từ
các hiệu thuốc đơng dược thuộc địa bàn Hà Nội gồm: 4 ƒlavus, A fumigatus,
A niger, A tamarii, A, ustus va A carbonarius Trong 6 loai nam phân lập được chiếm vị trí số một là lồi 4 øiger, cĩ số chủng là 105 trong tổng số 179
chủng nắm phân lập được, chiếm tỷ lệ 58,7% Lồi này đã xuất hiện 10/10
mẫu nghiên cứu, với số chủng dao động 1-34/mẫu được liệu Xếp thứ hai, là lồi 4 /imigafas., xuất hiện 9/10 mẫu nghiên cứu, với số chủng dao động I- 13/ mẫu dược liệu Cĩ số chủng phân lập được là 38, trong tổng số 179 chủng của chỉ phân lập được, chiếm tỷ lệ 21,2% Lồi 4 /avus chiếm vị trí thứ 3 về số chủng phân lập được (12 trong tổng số 179 chủng của các lồi thuộc chi đã phân lập được), chiếm tỷ lệ 6,7%, xuất hiện 5/10 mẫu nghiên cứu, với số chủng dao động 2-3/ mẫu nghiên cứu Ngồi 3 lồi chủ yếu trên, chúng tơi cịn phan lap duge 3 loai khac la A tamari, A ustus va A carbonarius
Trang 40được, chiếm vị trí số một là lồi 4 niger, xuat hién 8/10 mau nghiên cứu, với
số chủng dao động 1-14/mẫu nghiên cứu Số chủng phân lập được là 42 trong
tơng số 74 chủng năm của chi phân lập được, chiêm ty lệ 56,8% Xếp vị trí
thir hai 1a loai A fumigatus, xuat hién 5/10 mẫu nghiên cứu với số chủng đao động 1-3/mau dược liệu Cĩ số chủng phân lập được là 11 trong tơng so 74 chủng của chi phân lập được, chiếm tỷ lệ 14,9% Lồi chiếm vị trí thứ ba về số chủng nắm phân lập được (8 trong tổng số 74 chủng của các lồi thuộc chi da phan lap duoc) la A parasiticus, chiém ty 1é 10,8%, xuat hién 5/10 mau
nghiên cứu, với số chủng dao động từ 1-3/mẫu Ngồi 3 lồi trên, chúng tơi
cũng phân lập được ba lồi khác là A aculeatus, A ustus và A famari, VỚI tỷ
lệ chủng phân lập được lần lượt là §,1%; 5,4% và 4,1% Kiến nghị:
Qua kết quả nghiên cứu vẻ sự đa dạng lồi của chỉ 4spergilus trên một
số mẫu của hai vị thuốc hạt cau và cát sâm chúng tơi cĩ một số kiến nghị sau: > Với cả hai vị thuốc hạt cau và cát sâm cần được đầu tư nghiên cứu
tiếp về mức độ nhiễm ctia loai 4 niger, déc t6 orchratoxin A va lồi A fiummigatus, bệnh nẫm cơ hội do lồi này gây ra để cĩ biện pháp phịng tránh
> Cấn tiếp tục nghiên cứu về mức độ nhiễm của 2 lồi 4 /lavws và 4 parasiticus nhiém trén 2 vị thuốc hạt cau và cát sâm
> Cần cĩ các biện pháp thích hợp giám sát các giai đoạn trước thu
hoạch, sau thu hoạch, chế biến và bảo quản sau thu hoạch các dược thảo nĩi
chung và hai vị thuốc binh lang và cát sâm nĩi riêng để phịng tránh nhiễm