Định lượng bạc sulfadiazine bằng phương pháp đo nitrit

đường tiết niệu của những sản phẩm chuyển hoá, chỉ thuận lợi cho dùng ngoài...Những năm gần đây một số sulfamid tác dụng kéo dài được đưa vào sử dụng : sulfamethoxypyridazin SMP, sulfame

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 2001 - 2006)

Ngưòi hướng dẫn Nơi thực hiện Thòi gian thực hiện

Sau năm năm học dưới mái trường đại học dược Hà Nội, dược sự quan tâm của tbầỵ cô giáo trong ban giám hiệu nhà trường, phòng Dào tạo và các phòng ban, cùng

sự nhiệt tình giẳng dạ/ của các thểỵ cô ỏ cốc bộ môm trong trường dã truỵềỉi đạt cho

em không những vổ kiến thức chuỵên môn phục vụ cho công việc mà còn truỵền dạt cho em đạo áức, và nhiều điều quý giá khác trước khi ra trường Em xin chân thành cẵm ơn.

Dặc biệt vói lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, cm xỉn bả/ tổ íời cẫm ơn tói :

D ỗ Nguỵễũ Dỉũh Hiển

là người thẩỵ đã tận tình hướng dẫn vầ chĩ bảo, giúp đõ em trong suốt quá trình làm kboá luận.

môn ỉĩoá Dược và tập th ể cán bộ Thư Viện dã tạo điều kiện thuận lợi, gmp đõ em trong suốt quá trình học tập vầ hoàn hành kboá luận tốt nghiệp này.

Ảm cảm ơn cấc bạn dã giúp đõ và động viên, kbuỵến khích tôi về mặt tinh thẩn trong thòi gian íàm khoố luận.

Em xin chân thành cẳm ơn !

ỉỉà Nội, tháng 05 năm 200Ó.

MỤC LỤC

Trang

Đặt vấn đề 1

Phần 1: Tổng quan 2

1.1 Lịch sủ ra đời của sulfamide 2

1.2 Sulfadiazine 3

1.2.1 Công thức 3

1.2.2 Điều c h ế 3

1.2.3 Tính c h ấ t 4

1.2.4 Đặc điểm tác d ụ n g 5

1.2.5 Chỉ định .8

1.2.6 Chống chỉ định .8

1.2.7 Kháng thuốc .8

1.3 Bạc - Sulfadiazine 8

1.3.1 Công thức 8

1.3.2 Điều c h ế 8

1.3.3 Đặc điểm tác d ụ n g 9

1.3.4 Kiểm nghiệm 10

1.4 Áp dụng phương pháp đo thế phát hiện điểm tương đương 13

1.5 Đề cương nghiên cứ u 16

Phần 2 : Thực nghiệm và kết quả 17

2.1 Xác định hàm lượng Ag trong bạc - sulfadiazine 17

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất, thuốc th ử 17

2.1.2 Xác định hàm lượng A g 17

2.1.3 Kết quả thực nghiêm 18

2.2 Định lượng bạc - sulfadiazine bằng phương pháp đo bạc 20

2.2.1 Nguyên liệu, hoá chất, thuốc th ử 20

2.2.2 Định lượng Ag - sulfadiazine 20

2.2.3 Kết quả thực nghiệm 21

2.2.4 Nhận x é t 21

2.3 So sánh độ chính xác giữa chỉ thị màu và đo điện th ế 22

2.4 Định lượng bạc - sulfadiazine bằng phương pháp đo nitrít 23

2.4.1 Nguyên liệu, hoá chất, thuốc th ử 23

2.4.2 Định lượng Àg - sulfadiazine 24

2.4.3 Khảo sát các điều kiện thích hợp cho phép định lượng 24

2.5 So sánh phương pháp đo nỉtrit với phương pháp đo bạc 34

2.6 Đề x u ấ t 35

Phần 3 : Kết luận và đề xuất 37

3.1 Kết lu ậ n 37

3.2 Đê x u ấ t 37

Tài liêu Tham khảo

ph X m 1 TỔNG QUAN

Năm 1932 Mietsch và Clarer gắn nhóm -SO2-NH2 vào phẩm nhuộm crysoidin được protonsil (4 - sulfonamido crysoidin), có màu đỏ, có tác dụng kháng khuẩn

NH2

•N = N- SO2NH2

Nhóm S u lfon am id Crysoidin

Khoảng đến năm 1935 Domagk, Trefouel và Levaditi thí nghiệm thấy

in vitro protonsil không có tác dụng trên liên cầu {streptococus) mà chỉ có tác

dụng in vivo.

Sau đó một loạt nghiên cứu tiếp theo chứng minh rằng khi vào cơ thể protonsil bị men khử thành 2 c h ấ t:

enzym Protonsil

(màu đỏ)

(màu trắng)

Nhưng chỉ có sulfaninamid có tác dụng trên vi khuẩn cả in vitro và in vivo

Từ đó bắt đầu thời kỳ sản xuất và sử dụng sulfamid

Từ kết quả nghiên cứu tính kháng khuẩn của sulfaninamid, hàng loạt dẫn chất S u lf o n a m id được nghiên cứu và đưa vào sử dụng : sulfacetamid natri, sulfathiazol, sulfadimidin, Sulfadiazin .v.v

Sau một thời gian sử dụng các sulfamid này bộc lộ nhiều nhược điểm trong quá trình điều trị : liều 24h cao (6 - 8g / 24 giờ), nguy cơ kết tinh cao ở

đường tiết niệu của những sản phẩm chuyển hoá, chỉ thuận lợi cho dùng ngoài

Những năm gần đây một số sulfamid tác dụng kéo dài được đưa vào sử dụng : sulfamethoxypyridazin (SMP), sulfamethoxazol (SMZ) Các sulfamid này khắc phục nhược điểm của các sulfamid kinh điển : liều dùng 24h thấp (1

- 2g / 24h ), n g u y cơ kết tinh ở đường tiết niệu giảm, được dùng uống hoặc tiêm (dung dịch muối Na), để điều trị nhiễm khuẩn toàn thân Sulfadoxin còn

là thuốc phòng và điều tiỊ sốt rét

Sulfadiazine là một sulfamid ra đòd sớm, tuy có nhược điểm toàn thân, nhưng dùng ngoài lại có nhiều lợi thế : hiệu lực cao, không để lại vết màu saukhi lành vết thương, ở dạng muối với Ag (bạc - sulfadiazine) có hiệu lực cao

đối với trực khuẩn mủ xanh {P.aeruginosa), rất lành tính Vì vậy các dạng bào

chế từ Ag - sulfadiazine được dùng điều trị vết thưcíng trên da diện rộng như

- Dạng bột kết tinh hay tinh thể màu trắng hoặc trắng ngà vàng hay

hồng, Dưới tác dụng của ánh sáng sẽ sẫm dần thành nâu

- Hầu như không tan trong nước (lg/125ml), aceton Tan trong dung dịch acid vô cơ loãng và dung dịch kiềm loãng (lưỡng tính)

- Nhiệt độ nóng ch ả y khoảng 255°c, kèm phân hu ỷ.

H2N- 0 - S O - N ^ p ) —

NaOH

+ Cũng do H linh động nên sulfadiazine tạo muối với ioii kim lo ạ i:

- Tạo phức m àu với dung d ịch CUSO4 c ó m àu b iến đ ổ i từ xanh rêu sang nâu sám

- Tạo tủa trắng vói AgNOg

♦ Nhóm amin thơm bậc I cho phản ứng tạo phẩm màu nitơ (đ ỏ ):

- Tác dụng trên nhiều vi khuẩn gram (+) (liên cầu, tụ cầu, phế cầu),

gram (-) (lậu cầu, màng não cầu), trực khuẩn than, Vibrio cholera , shigella,

tĩực khuẩn Hansen, E.coli,

- ít hoặc tác dụng không có tác dụng trên một số vi khuẩn : liên cầu

khuẩn yếm khí, trực khuẩn lao, Ricketchia.

- Hầu như không tác dụng với virus.

1.2.4.2 Cơ ch ế tác dụng [1]

Theo cơ chế chung của các sulfamid :

* Ngăn cản tổng hợp acid folic của vi khuẩn

Năm 1940, Woods-Fider đưa ra thuyết về tác dụng của sulfamid và dùng thực nghiệm chứng minh được chất kháng sulfadiazine là acid p-aminobenzoic

(PAB) vă câc chất có thể chuyển hoâ thănh PAB trong cơ thể Cơ chế tâc dụng năy như sau :

Vi khuẩn cần tổng hợp acid folic vă chuyển hóa acid folic thănh nucleoprotein (cẩn thiết cho sự nhđn lín của tế băo vi khuẩn), theo sơ đồ :

OH

Pterin

PAB ( vitamin H ')

N H - C H - C H 2 - C H 2- COOH COOH

Theo SƠ đồ trín sulfadiazine cạnh tranh với PAB trong quâ trình tổng hợp acid folic của vi khuẩn, lăm cho việc tổng hợp acid folic bị giân đoạn, ngưng trệ Sự cạnh tranh năy tuđn theo quy luật khối lượng, nín cần duy trì nồng độ sulfadiazine trong mẫ cao, kĩo dăi

Thuyết Wood cũng phù hợp với thuyết ion hoâ (theo đó anion sulfadiazine cũng cạnh tranh thuận nghịch với anion PA B):

Anion PAB

0

N \ R Anion Sulfadiazin

sở dĩ có sự cạnh tranh này là do sulfadiazine và PAB giống nhau về hình dạng, kích thước và nhóm chức hoá học :

Đa số vi khuẩn tự tổng hợp acid folic nên nhạy cảm với sulfadiazine Người và động vật lấy acid folic từ bên ngoài vào như một vitamin nên không

bị ảnh hưởng bởi sulfadiazine.Vi vậy khi dùng sulfadiazine để chữa bệnh thì thuốc chỉ có tác hại chọn lọc trên vi khuẩn

* ức chế enzym chuyển hoá acid folic :

Do sulfadiazine mang gốc 2- (p - aminobenzensulfonamido) - pirimidin nên còn thêm tác dụng ức chế enzym chuyển hóa acid folic (enzym dihydrofolat synthetase) ngăn chặn giai đoạn chuyển acid folic thành acid dihydrofolic

1.2.4.3 Dược động học [1],[8]

- Hấp thu : Sulfadiazine được hấp thu nhanh ở đường tiêu hoá khi uống

- Phân bố : Sau khi vào máu sulfadiazine gắn với các protein huyết tương (albumin) ở mức độ vừa và thuận nghịch (đạt nồng độ trong máu 40mg/100ml máu), dễ khuyếch tán vào các mô kể cả dịch não tuỷ

- Chuyển hóa : Sulfadiazine chuyển hóa bằng cách acetyl hoá rồi liên hợp với acid glucuronic

- Thải trừ : chủ yếu qua đường thận-nước tiểu dưới 2 dạng chính : nguyên dạng và sản phẩm chuyển hoá - acetyl Ti/2 = 10 giờ

1.2.5 Chỉ định [1]

Các nhiễm khuẩn do các vi khuẩn nhạy cảm với sulfadiazine trong các bệnh như viêm họng, viêm bàng quang, bể thận, viêm não, bệnh lậu và các vết thưcỉng nhiễm khuẩn

1.2.6 Chông chỉ định [1],[8]

- Người mẫn cảm với sulfamide

- Thiếu hụt men G6DP

- Suy gan thận nặng

- Phụ nữ có thai (3 tháng cuối) và phụ nữ cho con bú

- Trẻ sơ sinh, trẻ đẻ non

1.2.7 Kháng thuốc [1],[8]

Giống như các sulfamid khác, vi khuẩn có thể tạo ra nhiều PAB hơn hoặc

sử dụng PAB hiệu quả hơn để kháng lại sulfadiazine Cũng có thể vi khuẩn tạo

ra con đường chuyển hoá khác không cần đến PAB để thích nghi

- Sau khi tạo tủa, rửa tủa nhiều lần bằng nước để loại hết sulfadiazine - Na thừa.

- Tiếp theo hút kiệt nước, sấy ở khoảng 90 - 95°c đến khô, thu được bạc - sulfadiazine

Chú ý : Lượng sulfadiazine - Na phải quá thừa để tránh thừa Ag^ dễ bị oxy

+ Thuốc có hiệu quả trên p aeruginosa là mầm bệnh thường gặp trong

bỏng nhiễm khuẩn gây tử vong

+ Thuốc ức chế sự phát triển của Entorobacter, Klebsiella, Escherichia

coli, Proteus, Staphylococus, nhưng không dùng để điều trị nhiễm khuẩn sâu.

+ Bạc trong chế phẩm được giải phóng ra từ từ, cũng có tác dụng kìm khuẩn

- Phòng và điều trị nhiễm khuẩn vết thưoỉng bỏng độ 2 và độ 3

- Thuốc được dùng hỗ trợ trong thời gian ngắn, điều trị nhiễm khuẩn các

v ết lo é t ở c h ỗ da bi x â y sát (vết lo é t ở chân, nơi tì c ọ s á t .)•

- Hỗ trợ phòng nhiễm khuẩn tại chỗ ở người cho mảnh ghép da hoặc xây xước da diện rộng

- Thuốc được chỉ định điều trị bảo tồn các tổn thưoỉng ở đầu ngòn tay như mất móng, mút ngón, hoặc mất một phần các đốt cuối.

- Dạng bột kết tinh hay tinh thể màu trắng Bị hỏng khi để ngoài ánh sáng

hoặc dưới tác dụng của nhiệt độ

- Không tan trong nước, etanol, ether, cloroform

Phần cắn được rửa bằng nước và sấy khô ở 105°c trong 1 giờ

Lấy dịch và cắn thu được ở trên đem định tính theo các phép thử của sulfadiazine như :

- Phổ hồng ngoại phải phù hợp với phổ hồng ngoại của sulfadiazine chuẩn ( = 570)

- Cho phản ứng đặc trưng của nhóm amin thơm bậc I (phản ứng tạo phẩm màu nitơ )

B : Hoà tan 0,1 g nguyên liệu trong 2ml HNO3 và 20ml nước Thêm acid HCl vào, tủa xuất hiện Tủa này tan trong dung dịch NH3, song tủa lại xuất

hiện khi cho acid HNO3 vào.

c : Phổ hồng ngoại phải phù hợp với phổ hồng ngoại của bạc - sulfadiazine chuẩn ( = 572)

1.3.4.3 Độ acid

Đun Ig nguyên liệu bằng 50ml nước đến 70°c trong 5 phút, sau đó làm lạnh ngay, rồi lọc Phần dịch lọc phải có pH = 5,5 - 7,0 (theo phụ lục VIII H của dược điển Trung Quốc)

1.3.4.4 M ất khối lượng sau làm khô [13]

Khi làm khô đến khối lượng không đổi ở 80°c, không được quá 1,0% (theo phụ lục VIII L của dược điển Trung Quốc)

Xác định hàm lượng theo lượng Ag gắn vào bạc - sulfadiazine

Chế phẩm/HNOg —> Sulfadiazine + Ag"^ + NO3“

đều tan hếtĐịnh lượng Ag^ trong dung dịch thu được bằng CNS“ Thêm vào dung dịch phân tích (có ion Ag^) từng giọt dung dịch chuẩn CNS”, kết tủa AgCNS được tạo thành :

A g - + C N S - - > A gC H Sị„j„,

Sau khi đạt điểm tứcmg đương lượng (hết Ag"^) thì CNS dư ra sẽ tạo tủa với (chỉ thị) tạo phức có màu đỏ:

Iml kali thiocyanid 0,1M tương đương với 35,7Img CioH9AgN402S

c Phương pháp đo nitrit (phương pháp đề xuất)

Đa số trường hợp, phản ứng giữa amin thơm bậc I và nitrit xảy ra chậm làm ảnh hưởng đến kết quả định lượng Để làm tăng tốc độ phản ứng thêm kalibromid làm chất xúc tác.

* Tiến hành

+ Loại bạc ra khỏi nguyên liệu và hoà tan sulfadiazine trong H C l:

Ag - Sulfadiazine + HCl A gC lị + Sulfadiazine

tan trong HCl+ Chuẩn độ dung dịch thu được bằng dung dịch chuẩn NaNOj 0,1M Phát hiện điểm tưoỉng đương bằng đo điện thế với cặp điện cực Pt - Calomel/KCl bão hoà

^ -V -Iml dung dịch NaNOj 0,1M tương đương với 35,71mg CioH9AgN402S

1.4 Áp dụng phương pháp đo thê phát hiện điểm tương đương

Phương pháp đo nitrit dùng 2 loại chỉ thị phát hiện điểm tương đương :+ Chỉ thị nội : Tropeolin o o với xanh methylen, hoặc đỏ methyl Tại điểm tương đương có sự chuyển màu từ hồng sang xanh lơ

+ Phương pháp đo thế với cặp điện cực : Pt - Calomel hoặc Pt - Ag/AgCl-KCl

Trong 2 phưcmg pháp trên, phương pháp đo điện thế ổn định hơn nên hiện nay tất cả dược điển đều dùng phưcmg pháp đo điện thế

Để xác định đúng điểm tương đương trong phương pháp đo thế chúng tôi

sủ dụng cặp điện cực Pt - Calomel/KCl bão hoà Khi ở điểm tương đương tồntại một một lượng thừa N0 2~ làm thế điện cực Pt thay đổi đột ngột => cho biết

đã đến điểm kết thúc định lượng

Có nhiều cách xác định điểm kết thúc của phản ứng định lượng, dựa vào :

- Đồ thị liên quan giữa : E và V

- Đồ thị liên quan giữa : AE/AV và V

- Đồ thị liên quan giữa : A^E/AV^ và V

- Dựa vào đạo hàm bậc 2

Cách 1 : Dựa trên sự phụ thuộc giữa giá trị E và V.

V (m l)

Đồ thị: Mối liên quan giữa E v à V

- Xác định điểm kết thúc : Từ điểm giữa của đường cong, ta kẻ một đường

thẳng vuông góc với trục V, từ đó xác định được V|^ê( thúc 7,08ml

- Nhận xét : Cách xác định này thương gây tranh cãi do rất khó xác định

được điểm chính giữa của bước nhảy thế trên đường cong chuẩn độ

• Cách 2 ; Đồ thị liên quan giữa : AE/AV và V

Đồ t h ị : Mối liên quan giữa AE/AV và V

- Xác định điểm kết thúc : Từ đỉnh của đường cong, kẻ một đường thẳng vuông góc với trục thể tích cắt trục thể tích tại đâu thì đó là điểm kết thúc Suy

ra Vkếtthúc« 7,07ml

- Nhận xét : Cách xác định điểm kết thúc này dễ mắc sai số nhỏ giọt từ

buret vì ta không thể nhỏ dần dần từng lượng dung dịch chuẩn xuống mà mỗi lần nhỏ ta thương phải thêm khoảng 0,05 ml dung dịch chuẩn Vì vậy giá trị AE/AV lớn nhất (ứng với đỉnh đường cong chuẩn độ trên đồ thị) thường là không ứng với điểm kết thúc Vì vậy ta sẽ mắc sai số giọt từ buret

• Cách 3 : Đồ thị liên quan giữa : A^E/AV^ và V

- Xác định diểm kết thúc : Điểm kết thúc là giao điểm của đường cong với trục thể tích V Suy ra Vj,êt thúc »7,07

- Nhận x é t : Cách này giúp ta dễ dàng xác định được V|,êt thúc với độ chính xác cao hơn cách 1 và 2 Tuy nhiên để có kết quả chính xác hofn thì cần chia trục thể tích nhỏ hơn nữa, khi đó muốn nhìn rõ được vạch chia thì đồ thị phải tương đối lớn Cách này chưa thật thuận tiện

• Cách 4 : Dựa vào đạo hàm bậc 2 (trình bày ỏ phần II).

1.5 Đê cương nghiên cứu

Phương pháp đo nitiit định lượng Ag - sulfadiazine là phương pháp đề xuất thực hiện của đề tài nhằm mục đích đưa thêm một phương pháp định lượng bên cạnh các phương pháp đo bạc, HPLC

Chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp nghiên cứu định lượng nguyên liệu bạc - sulfadiazine (do bộ môn Hoá Dược trường đại học Y Khoa Huế điều chế) theo các bước như sau ;

• Bước 1 : Thăm dò

- Xác định hàm lượng Ag trong bạc - sulfadiazine (theo USP 27)

- Xác định hàm lượng bạc - sulfadiazine trong nguyên liệu (theo dược điển Trung Quốc)

• Bước 2 : Tiến hành nghiên cứu áp dụng phương pháp đo nitrit vào xác định hàm lượng bạc - sulfadiazine bao gồm các nội dung thực nghiệm :

- Xác định nồng độ dung dịch HCl thích hợp để loại hết Ag khỏi bạc- sulfadiazine

- Xác định thời gian đun cách thuỷ để loại hết Ag khỏi bạc - sulfadiazine

- Tiến hành định lượng bạc - sulfadiazine bằng phương pháp đo nitrit

• Bước 3 : So sánh phương pháp đo nitrit với phương pháp đo bạc trong dược điển Trung Quốc

fh X n n THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.

2.1 Xác định hàm lượng Ag trong bạc - sulfadiazine (USP 27)

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất, thuốc thử, dụng cụ

- Nguyên liệu : Bạc - Sulfadiazine (chế tạo tại bộ môn Hoá Dược, trường đại học Y Khoa Huế)

- Hoá chất, thuốc thử (theo tiêu chuẩn D Đ V N III):

Dung dịch HNO3 đặc

Dung dich chuẩn kali thiocyanid 0,1M

- Dụng cụ : Cốc có mỏ, ống đong, buret 25ml

Máy khuấy từ, máy đo điện thế

Cặp điện cực Pt - Calomel/ KNO3 bão hoà

2.1.2 Xác định hàm lượng Ag

* Nguyên tắc

Chế phẩm/HNOg —> ^ulfadiazine + Ag"^ + N O ^

(tan hết)Định lượng Ag^ dung dịch thu được bằng CNS“ :

Ag^+ CNS“ —> AgCNS( kết tủa trắng)Khi hết Ag"^ thì lượng CNS“dư ra làm thay đổi đột ngột điện thế Sự thay đổi này được phát hiện bằng máy đo mV với cặp điện cực Ag — Ag/AgCl Qiúng tôi thay đổi cho phù hợp vód trang thiết bị ở trường :

1- Thay cặp điện cực Ag - Ag/AgCl bằng cặp điện cực Pt - Calomel/KNOg bão hoà

2- Thay kali thiocyanid 0,1N bằng amoni thiocyanid 0,1M.

* Cách tiến hành

Cân chính xác 500mg chế phẩm cho vào cốc dung tích 250iụlỊ|'«au đố thêm 150ml nước cất và 50ml dung dịch HNO3 đặc, khuấy trong Ji^ng 15 phút CỈIỌ