Sắc ký ái lực tinh sạch protease - Lê Văn Việt Mẫn

Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1. Enzym protease phân loại và đặc điểm các loại enzym protease Protease là một trong những enzyme quan trọng nhất trong công nghiệp, có tác dụng xúc tác cho phản ứng phân giải protein, được sử dụng trong nhiều thế kỷ, lĩnh vực sử dụng đầu tiên enzyme này là ngành sản xuất sữa. Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase. * Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại: + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. + Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide. * Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: + Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 1 Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn + Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. + Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. + Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: - Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhưng ít thấy ở vi khuẩn. - Protease trung tính có pH 7-8 như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa, ficin từ Ficus sp là những protease có nguồn gốc từ động vật. Những protease này là cystein protease, papain là protease ổn định với nhiệt độ nhất. Vi khuẩn Clostridium histolyticum sản xuất ra enzyme clostripain và Streptococcus spp sản xuất ra enzyme streptopain, đều là cysteine protease. - Protease kiềm có pH 9-11. * Ngoài ra có thể phân thành 2 loại khác: Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 2 Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn Enzyme protease nội bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc ngoại biên màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kỹ thuật trích ly Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men, như quá trình lên men trên môi trường rắn. Enzyme được thu nhận khi quá trình lên men hoàn tất hoặc ngay khi quá trình lên men đang diễn ra. Sử dụng chất làm sạch không có tính chất ion như Triton X-100, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80… để lọc các enzymes. Nhìn chung quá trình diễn ra trong khoảng từ 50-60 phút, tỷ lệ dung môi và chất rắn là 1:8, nếu giá trị này cao hơn thì nhiều chất rắn sẽ được hòa tan, khi đó dịch thu được sẽ chứa nhiều phân tử không cần thiết Nhiệt độ trích ly trong khoảng 30 o C, nhưng ở nhiệt độ 4-10 0 C sẽ giảm sự biến tính, sự thủy phân và sự phát triển của sinh vật. Sự trích ly được tiến hành ở pH=7, tuy nhiên để tránh xảy ra sự kết tủa thì pH gần pI. 1.2. Ứng dụng sắc ký ái lực trong tinh sạch protease Sự tinh sạch enzyme nói chung và protease nói riêng là một quá trình phức tạp và có nhiều phương pháp đã được ứng dụng. Mục đích của quá trình tinh sạch là tăng độ tinh sạch, hoạt tính và khả năng tái sử dụng của enzyme. Sắc ký là một trong những phương pháp tinh sạch, trong đó enzym tách ra khỏi hỗn hợp ngay khi được đưa qua matrix. Các matrix sử dụng trong sắc ký có tính chất vật lý và hóa học có khả năng tương tác với các enzym do đó nó giữ lại enzym. Ví dụ như protease có tính acid sẽ tương tác với một matrix base nhiều hơn một protease trung tính. Do vậy một matrix base có thể được sử dụng để tách các protease mang tính acid vì nó sẽ tương tác với matrix và bị giữ lại, còn những Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 3 Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn protease không mang tính acid sẽ chảy qua matrix. Các protease bị giữ lại sẽ được loại bỏ hoặc tách ra khỏi matrix bằng cách phá vỡ liên kết giữa chúng hoặc làm yếu dần các liên kết. Hạn chế chủ yếu của các phương pháp sắc ký là thiếu tính đặc hiệu cụ thể đối với mỗi loại protease, ví dụ như là các matrix base có khả năng giữ lại các protease khác ngoài protease mang tính acid. Sắc ký ái lực là có thể khắc phục được hạn chế này bằng cách bổ sung một ligand gắn lên matrix để tạo ra tương tác đặc hiệu với phân tử cần tách. Đây là một phân đoạn hữu ích và có hiệu quả nhất để tinh sạch các protease bằng sắc ký ái lực đơn. Mỗi loại cơ chất tương tác với một ligand tương ứng như bảng 1. Bảng 1: Cơ chất và ligand tương ứng trong sắc ký ái lực Cơ Chất Ligand Enzyme Substrate, cofactor Antibody Antigen, Virus, Cell Polysaccharide, glycoprotein Lectin Nucleic acid binding protein Nucleic Acid Hormone receptor Hormone Đối với protease, ligand thường sử dụng nhất là các chất ức chế của nó. Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 4 Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ÁI LỰC TRONG TINH SẠCH PROTEASE 2.1. Cơ sở khoa học  Nguyên lý Đầu tiên là các ligand liên kết đồng hóa trị với các matrix không hòa tan, như các hạt agarose, sau đó matrix được cho vào cột sắc ký. Hỗn hợp dung dịch chứa protein cần tinh sạch sẽ được cho vào cột khi đó sẽ xảy ra sự tương tác giữa protein với các ligand được cố định trên matrix, do đó protein sẽ bị giữ lại trên matrix, những chất không tương tác với matrix sẽ chảy qua cột. Sự tương này có tính đặc thù và thuận nghịch. Protein được tách ra khỏi matrix bằng cách làm yếu liên kết giữa chúng bằng phương pháp giửa giải khác nhau. Sự tương tác sinh học giữa ligand và phân tử tinh sạch có thể là kết quả của liên kết tĩnh điện hoặc tương tác kỵ nước, lực van der Waals hoặc là liên kết hydro. Để rửa giải có thể sử dụng ligand cạnh tranh đặc trưng, hoặc là không cạnh tranh bằng cách thay đổi pH, nồng độ ion hoặc là sự phân cực để phá vỡ liên kết. Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 5 Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn  Qui trình thực hiện Hình 1: Các bước trong sắc ký ái lực Buớc 1: Chọn môi trường ái lực Chọn môi trường có sẵn (ligand liên kết sẵn với matrix). Nếu không có thì phải chọn ligand thích hợp để tạo môi trường ái lực đặc hiệu. Ổn định môi truờng ái lực trong dung dịch đệm liên kết (binding buffer). Buớc 2: Chuẩn bị môi trường và dung dịch đệm Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 6 Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn Các dung dịch và chất bảo quản cần phải rửa trước khi sử dụng. Nước và các hoá chất sử dụng phải có chất lượng cao. Dung dịch phải được lọc qua lưới lọc 0.45 µm hoặc 0.22 µm. Việc tái sử dụng môi trường ái lực cần phải phụ thuộc vào bản chất của mẫu. Lưu ý tránh những chất béo. Bước 3: Chuẩn bị mẫu và chạy mẫu Chuẩn bị mẫu: Mẫu cần được làm sạch trước khi chạy sắc ký. Nếu có thể nên kiểm tra ái lực của ligand với protease cần tách. Sau đó, hiệu chỉnh pH mẫu và loại bỏ các thành phần gây gián đoạn liên kết. Chạy mẫu: Chạy mẫu dưói điều kiện tối ưu cho quá trình liên kết các phân tử cần tách với ligand. Cần phải kiểm soát tốc độ dòng chảy, thể tích mẫu không ảnh hưởng đến hiệu quả liên kết. Bước 4: Rửa giải Thu hồi protease mục tiêu bằng cách thay đổi các điều kiện thích hợp cho quá trình rửa giải. Có nhiều phương pháp rửa giải, không có phương pháp chung nhất định. Có thể tiến hành quá trình rửa giải đặc hiệu bằng cách sử dụng một ligand cạnh tranh hoặc quá trình rửa giải không đặc hiệu bằng cách thay đổi pH, lực ion hoặc độ phân cực. Kết quả thu được protease ở dạng tinh sạch hoặc cô đặc.  Phương pháp 1: Thay đổi dung dịch đệm  Phương pháp 2: Thay đổi pH hoặc nồng độ tác nhân cần cho quá trình rửa giải. Phương pháp này có thể gây hại cho ligand. Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 7 Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn  Phương pháp 3: Thêm một chất cạnh tranh liên kết. Phương pháp này có thể cải thiện tính đặc hiệu của môi trường mà sử dụng các nhóm ligand đặc hiệu. Các phương pháp rửa giải có tính chọn lọc được ứng dụng kết hợp với các nhóm ligand đặc hiệu. Rửa giải pH: Sự thay đổi pH sẽ có ảnh hưởng đến mức độ ion hoá của cac nhóm trên ligand và protease liên kết. Sự thay đổi này có thể tác động trực tiếp đến vị trí liên kết, hoặc tác động gián tiếp đến sự thay đổi ái lực do thay đổi cấu hình. Giảm pH là phương pháp thường sử dụng nhất để rửa giải. Tuy nhiên việc thu các phân đoạn phải được tiến hành ở điều kiện pH trung tính (ví dụ Tris-HCl 1M, pH 9). Rửa giải lực ion: Thường sử dụng NaCl (dung dịch đệm) để làm tăng lực ion. Các enzym thường được rửa giải với nồng độ thấp hơn hoặc bằng 1M NaCl. Rửa giải cạnh tranh: Thường sử dụng để tách những chất liên kết trên môi trường đặc hiệu nhóm hoặc khi ái lực liên kết giữa protein mục tiêu với ligand tương đối cao. Chất rửa giải có thể cạnh tranh liên kết với protein mục tiêu hoặc ligand. Có thể sử dụng cơ chất với nồng độ tăng theo gradient hoặc dạng xung. Thường sử dụng nồng độ xấp xỉ với nồng độ của ligand. Nếu cơ chất liên kết yếu hơn thì sẽ phải sử dụng với nồng độ cao hơn. Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 8 Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn Rửa giải với chất rửa giải có độ phân cực thấp: Thường sử dụng dioxane (≤10%) hoặc ethylen glycol (≤50%). Rửa giải chaotroptic: Chỉ sử dụng khi không dùng được phương pháp khác. Phương pháp này làm thay đổi cấu trúc của protein được rửa giải. Các tác nhân thường dùng là guanidin hydrocloride, ure. Bước 5: Ổn định lại môi trường ái lực trong binding buffer. 2.2. Các matrix thường dùng Matrix ái lực thường được chuẩn bị bằng liên kết đồng hóa trị của một ligand với chất rắn hỗ trợ. Agarose hay Sepharose, Sephadex và tinh bột là những chất rắn hỗ trợ tốt bởi vì chúng dễ tạo dẫn xuất với các ligand khác nhau. Tuy nhiên gel agarose là được sử dụng nhiều nhất vì có độ bền cao và cho phép các đại phân tử xâm nhập dễ dàng. Để chuẩn bị cột ái lực, matrix phải được hoạt hóa để có thể gắn ligand bằng các liên kết đồng hóa trị. Trong một số trường hợp, một spacer arm được dùng trong quá trình hoạt hóa, và sau đó ligand có thể liên kết đồng hóa trị. Liên kết này có thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp. Bảng 4.10 đưa ra những tác nhân thường dùng để hoạt hóa matrix và cố định ligand. Tuy nhiên, các matrix hoạt hóa đã được thương mại hóa và có thể sử dụng rất tiện lợi phù hợp với những ligand được chọn. Sản phẩm thương mại thường gặp nhất là: Sepharose 4B, 6B: chỉ agarose được liên kết ngang 4%, 6% tương ứng. Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 9 Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn AH Sepharose: Sepharose có nhóm amine tự do. CH Sepharose: Sepharose có nhóm carboxyl tự do. CNBr-activated Sepharose: Sephaose được hoạt hoá bằng CNBr… Bảng 2: Một số tác nhân hoạt hóa matrix và cố định ligand phổ biến 2.3. Ligand sử dụng để tinh sạch protease trong sắc ký ái lực Với mỗi protease khác nhau sẽ có một ligand tương ứng. Trong sắc ký ái lực để tinh sạch/phân tách protease từ các nguồn khác nhau, ligand thường sử dụng nhất là các polypeptide antibiotics gramicidin S hoặc các bacitracin. Ngoài ra người ta còn nghiên cứu tổng hợp các ligand ái lực đặc hiệu mới từ các dẫn xuất của polypeptide. Các peptide này có cấu trúc giống cấu trúc các cơ chất của enzym, đồng thời chứa các liên kết kháng lại sự thuỷ phân protein. Bảng 3: Một số ligand thường sử dụng trong sắc ký ái lực Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 10 Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang [...].. .Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn Một số cơ chất tổng hợp tương ứng với các protease khác nhau:  Subtilisin và thermitase: Z-Ala-AIa-Leu-pNA (p-nitroanilide)  Subtilisin-like serine protease: Ala-Ala-Leu-pNA  Enzyme từ rễ cây bồ công anh kininase X: Glp-Ala-Ala-Leu-pNA  α-Chymotrypsin: Suc-Phe-pNA  Kallikrein: Z-D-Ala-Leu-Arg-pNA  Leu-aminopeptidase: Leu-pNA ... Bz-D,L-Arg-pNA  Protease PC và papain: Glp-Phe-Ala-pNA  Carboxypeptidase PC: DNP-Ala-Ala-Leu Tổng hợp một số ligand: * Boc-Leu-N(CH2 CH2) 2O Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Trang 11 Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn HOBt (1-hydroxybenzotriasol) (0.69 g, 5.16 mmol) được hoà tan trong 5ml hỗn hợp THF (tetrahydrofuran)-DMF (1:10) (1) Boc-Leu-OH... 29 0-3 06 và 31 0-3 30 ml là phần A và B của enzyme Bảng 5: Kết quả tách protease II Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Trang 22 Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn Cột AH-Sepharose dùng N-acetyl-D-arginine dùng để thu nhận protease II từ Escherichia coli Sắc ký ái lực thực hiện sau khi DEAE-Sephadex ( quy trình làm sạch truyền thống) Quá trình tinh. .. trí C-1 (đối với oligosaccharide là C-1OH của đường khử) thường tham gia vào liên kết này Hình 8: Phản ứng của AH-Sepharose Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Trang 25 Sắc ký ái lực tinh sạch protease Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn Trang 26 Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn. .. potassium phosphate pH 7.6 Sắc ký ái lực trong 220mM potassium phosphate pH 7.6 bằng CH-Sepharose 4B có gắn L-arginine, tách enzyme không đáng kể, trong khi đó dùng AH-Sepharose Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Trang 20 Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn 4B gắn N-acetyl-D-arginine giữ được nhiều hơn Vì vậy dùng N-acetyl-Darginine để sử dụng là... 21 Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn ml dung dịch đệm vào mỗi cột Rửa bằng dung dịch đệm cho đến khi họat tính enzyme ít hơn 10 units/ml Dung dịch đệm có bổ sung vào 150 mM KCl cho vào mỗi cột và tổng họat độ enzyme nhận được Dòng chảy tốc độ 6 ml/giờ Đo ở bước song 280 nm (●) Họat tính đo với Bz-Arg-ONAn (○)d Hình 6: Sắc ký ái lực sử dụng N-acetyl-D-arginine gắn với AH-Sepharose... lực đến hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của enzyme protease 2.5.1 Ảnh hưởng của bản chất enzym cần phân tích Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Trang 34 Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn Hình 12: các đồ thị sắc ký thu được bằng cách cho chạy một số enzym qua cột Sepharose có gắn α -amino caproyl-D-tryptophan methyl ester (0.5x5 cm)... Trang Trang 28 Sắc ký ái lực tinh sạch protease Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn Trang 29 Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn Hình 10: Hoạt hóa matrix bằng Tosyl/ Tresyl Chloride Sự hoạt hoá: Sự hoạt hoá nên đưụơc tiến hành trong thiết bị kín có van thông hơi tốt 1 Sử dụng phễu thuỷ tinh gắn với thiết bị chân không,... NaCl 0.1M trong 20mM acetate Enzym sau tinh sạch được phân tích và xác định hoạt tính Kết quả như bảng 4 và hình 3 Bảng 4: Tổng hợp độ tinh sạch ISP qua các công đoạn: Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Trang 18 Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn Hình 3: Kết quả rửa giải ISP từ insulin-agarose Mũi tên bên trái: thêm enzym vào; mũi tên bên phải:... 27 Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn Ligand cố định ổn định hơn isourea được tạo ra bằng cyanogen-bromide Nhược điểm: Ở pH trung hoà, liên kết amine thứ hai tích điện duơng Quy trình thực hiện: Tác nhân: 1 Tosyl chloride/ tresyl chloride (Aldrich) 2 Pyridine 3 Sepharose 4B hoặc 6B Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Trang 28 Sắc ký ái lực tinh . 5 Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn  Qui trình thực hiện Hình 1: Các bước trong sắc ký ái lực Buớc 1: Chọn môi trường ái lực Chọn. Glp-Ala-Ala-Leu-pNA.  α-Chymotrypsin: Suc-Phe-pNA.  Kallikrein: Z-D-Ala-Leu-Arg-pNA.  Leu-aminopeptidase: Leu-pNA.  Trypsin của bò và cua: Bz-D,L-Arg-pNA.  Protease PC và papain: Glp-Phe-Ala-pNA thường sử dụng trong sắc ký ái lực Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 10 Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn Một số cơ chất tổng