Sắc ký ái lực tinh sạch protease - Lê Văn Việt Mẫn

Do vậy một matrix base có thể được sử dụng để tách các protease mang tính acid vì nó sẽ tương tác với matrix và bị giữ lại, còn những... Các protease bị giữ lại sẽ được loại bỏ hoặc tách

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1.1 Enzym protease phân loại và đặc điểm các loại enzym protease

Protease là một trong những enzyme quan trọng nhất trong công nghiệp, có tác dụng xúc tác cho phản ứng phân giải protein, được sử dụng trong nhiều thế kỷ, lĩnh vực sử dụng đầu tiên enzyme này là ngành sản xuất sữa

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhưng ít thấy ở

vi khuẩn

- Protease trung tính có pH 7-8 như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa,

ficin từ Ficus sp là những protease có nguồn gốc từ động vật Những protease

này là cystein protease, papain là protease ổn định với nhiệt độ nhất Vi khuẩn

Clostridium histolyticum sản xuất ra enzyme clostripain và Streptococcus spp

sản xuất ra enzyme streptopain, đều là cysteine protease

- Protease kiềm có pH 9-11

* Ngoài ra có thể phân thành 2 loại khác:

Enzyme protease nội bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc ngoại biên màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kỹ thuật trích ly

Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men, như quá trình lên men trên môi trường rắn Enzyme được thu nhận khi quá trình lên men hoàn tất hoặc ngay khi quá trình lên men đang diễn ra Sử dụng chất làm sạch không có tính chất ion như Triton X-100, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80… để lọc các enzymes

Nhìn chung quá trình diễn ra trong khoảng từ 50-60 phút, tỷ lệ dung môi và chất rắn là 1:8, nếu giá trị này cao hơn thì nhiều chất rắn sẽ được hòa tan, khi đó dịch thu được sẽ chứa nhiều phân tử không cần thiết Nhiệt độ trích ly trong khoảng

30oC, nhưng ở nhiệt độ 4-100C sẽ giảm sự biến tính, sự thủy phân và sự phát triển của sinh vật Sự trích ly được tiến hành ở pH=7, tuy nhiên để tránh xảy ra sự kết tủa thì pH gần pI

1.2 Ứng dụng sắc ký ái lực trong tinh sạch protease

Sự tinh sạch enzyme nói chung và protease nói riêng là một quá trình phức tạp và

có nhiều phương pháp đã được ứng dụng Mục đích của quá trình tinh sạch là tăng

độ tinh sạch, hoạt tính và khả năng tái sử dụng của enzyme

Sắc ký là một trong những phương pháp tinh sạch, trong đó enzym tách ra khỏi hỗn hợp ngay khi được đưa qua matrix Các matrix sử dụng trong sắc ký có tính chất vật lý và hóa học có khả năng tương tác với các enzym do đó nó giữ lại enzym

Ví dụ như protease có tính acid sẽ tương tác với một matrix base nhiều hơn một protease trung tính Do vậy một matrix base có thể được sử dụng để tách các protease mang tính acid vì nó sẽ tương tác với matrix và bị giữ lại, còn những

protease không mang tính acid sẽ chảy qua matrix Các protease bị giữ lại sẽ được loại bỏ hoặc tách ra khỏi matrix bằng cách phá vỡ liên kết giữa chúng hoặc làm yếu dần các liên kết.

Hạn chế chủ yếu của các phương pháp sắc ký là thiếu tính đặc hiệu cụ thể đối với mỗi loại protease, ví dụ như là các matrix base có khả năng giữ lại các protease khác ngoài protease mang tính acid

Sắc ký ái lực là có thể khắc phục được hạn chế này bằng cách bổ sung một ligand gắn lên matrix để tạo ra tương tác đặc hiệu với phân tử cần tách Đây là một phân đoạn hữu ích và có hiệu quả nhất để tinh sạch các protease bằng sắc ký ái lực đơn.Mỗi loại cơ chất tương tác với một ligand tương ứng như bảng 1

Bảng 1: Cơ chất và ligand tương ứng trong sắc ký ái lực

Polysaccharide, glycoprotein LectinNucleic acid binding protein Nucleic AcidHormone receptor HormoneĐối với protease, ligand thường sử dụng nhất là các chất ức chế của nó

PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ÁI LỰC TRONG TINH

Sự tương tác sinh học giữa ligand và phân tử tinh sạch có thể là kết quả của liên kết tĩnh điện hoặc tương tác kỵ nước, lực van der Waals hoặc là liên kết hydro

Để rửa giải có thể sử dụng ligand cạnh tranh đặc trưng, hoặc là không cạnh tranh bằng cách thay đổi pH, nồng độ ion hoặc là sự phân cực để phá vỡ liên kết

 Qui trình thực hiện

Hình 1: Các bước trong sắc ký ái lực

Buớc 1: Chọn môi trường ái lực

Chọn môi trường có sẵn (ligand liên kết sẵn với matrix) Nếu không có thì phải chọn ligand thích hợp để tạo môi trường ái lực đặc hiệu

Ổn định môi truờng ái lực trong dung dịch đệm liên kết (binding buffer)

Buớc 2: Chuẩn bị môi trường và dung dịch đệm

Các dung dịch và chất bảo quản cần phải rửa trước khi sử dụng Nước và các hoá chất sử dụng phải có chất lượng cao Dung dịch phải được lọc qua lưới lọc 0.45

µm hoặc 0.22 µm

Việc tái sử dụng môi trường ái lực cần phải phụ thuộc vào bản chất của mẫu Lưu

ý tránh những chất béo

Bước 3: Chuẩn bị mẫu và chạy mẫu

Chuẩn bị mẫu: Mẫu cần được làm sạch trước khi chạy sắc ký Nếu có thể nên kiểm tra ái lực của ligand với protease cần tách Sau đó, hiệu chỉnh pH mẫu và loại bỏ các thành phần gây gián đoạn liên kết

Chạy mẫu: Chạy mẫu dưói điều kiện tối ưu cho quá trình liên kết các phân tử cần tách với ligand Cần phải kiểm soát tốc độ dòng chảy, thể tích mẫu không ảnh hưởng đến hiệu quả liên kết

Bước 4: Rửa giải

Thu hồi protease mục tiêu bằng cách thay đổi các điều kiện thích hợp cho quá trình rửa giải Có nhiều phương pháp rửa giải, không có phương pháp chung nhất định Có thể tiến hành quá trình rửa giải đặc hiệu bằng cách sử dụng một ligand cạnh tranh hoặc quá trình rửa giải không đặc hiệu bằng cách thay đổi pH, lực ion hoặc độ phân cực Kết quả thu được protease ở dạng tinh sạch hoặc cô đặc

 Phương pháp 1: Thay đổi dung dịch đệm

 Phương pháp 2: Thay đổi pH hoặc nồng độ tác nhân cần cho quá trình rửa giải Phương pháp này có thể gây hại cho ligand

 Phương pháp 3: Thêm một chất cạnh tranh liên kết Phương pháp này có thể cải thiện tính đặc hiệu của môi trường mà sử dụng các nhóm ligand đặc hiệu Các phương pháp rửa giải có tính chọn lọc được ứng dụng kết hợp với các nhóm ligand đặc hiệu.

Rửa giải pH:

Sự thay đổi pH sẽ có ảnh hưởng đến mức độ ion hoá của cac nhóm trên ligand và protease liên kết Sự thay đổi này có thể tác động trực tiếp đến vị trí liên kết, hoặc tác động gián tiếp đến sự thay đổi ái lực do thay đổi cấu hình

Giảm pH là phương pháp thường sử dụng nhất để rửa giải Tuy nhiên việc thu các phân đoạn phải được tiến hành ở điều kiện pH trung tính (ví dụ Tris-HCl 1M, pH 9)

Rửa giải lực ion:

Thường sử dụng NaCl (dung dịch đệm) để làm tăng lực ion

Các enzym thường được rửa giải với nồng độ thấp hơn hoặc bằng 1M NaCl

Rửa giải cạnh tranh:

Thường sử dụng để tách những chất liên kết trên môi trường đặc hiệu nhóm hoặc khi ái lực liên kết giữa protein mục tiêu với ligand tương đối cao Chất rửa giải có thể cạnh tranh liên kết với protein mục tiêu hoặc ligand Có thể sử dụng cơ chất với nồng độ tăng theo gradient hoặc dạng xung

Thường sử dụng nồng độ xấp xỉ với nồng độ của ligand Nếu cơ chất liên kết yếu hơn thì sẽ phải sử dụng với nồng độ cao hơn

Rửa giải với chất rửa giải có độ phân cực thấp:

Thường sử dụng dioxane (≤10%) hoặc ethylen glycol (≤50%)

Rửa giải chaotroptic:

Chỉ sử dụng khi không dùng được phương pháp khác Phương pháp này làm thay đổi cấu trúc của protein được rửa giải Các tác nhân thường dùng là guanidin hydrocloride, ure

Bước 5: Ổn định lại môi trường ái lực trong binding buffer

Để chuẩn bị cột ái lực, matrix phải được hoạt hóa để có thể gắn ligand bằng các liên kết đồng hóa trị Trong một số trường hợp, một spacer arm được dùng trong quá trình hoạt hóa, và sau đó ligand có thể liên kết đồng hóa trị Liên kết này có thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp Bảng 4.10 đưa ra những tác nhân thường dùng để hoạt hóa matrix và cố định ligand Tuy nhiên, các matrix hoạt hóa đã được thương mại hóa và có thể sử dụng rất tiện lợi phù hợp với những ligand được chọn

Sản phẩm thương mại thường gặp nhất là:

Sepharose 4B, 6B: chỉ agarose được liên kết ngang 4%, 6% tương ứng

AH Sepharose: Sepharose có nhóm amine tự do.

CH Sepharose: Sepharose có nhóm carboxyl tự do

CNBr-activated Sepharose: Sephaose được hoạt hoá bằng CNBr…

Bảng 2: Một số tác nhân hoạt hóa matrix và cố định ligand phổ biến

2.3 Ligand sử dụng để tinh sạch protease trong sắc ký ái lực

Với mỗi protease khác nhau sẽ có một ligand tương ứng Trong sắc ký ái lực để tinh sạch/phân tách protease từ các nguồn khác nhau, ligand thường sử dụng nhất là các polypeptide antibiotics gramicidin S hoặc các bacitracin

Ngoài ra người ta còn nghiên cứu tổng hợp các ligand ái lực đặc hiệu mới từ các dẫn xuất của polypeptide Các peptide này có cấu trúc giống cấu trúc các cơ chất của enzym, đồng thời chứa các liên kết kháng lại sự thuỷ phân protein

Bảng 3: Một số ligand thường sử dụng trong sắc ký ái lực

Một số cơ chất tổng hợp tương ứng với các protease khác nhau:

 Subtilisin và thermitase: Z-Ala-AIa-Leu-pNA (p-nitroanilide)

 Subtilisin-like serine protease: Ala-Ala-Leu-pNA

 Enzyme từ rễ cây bồ công anh kininase X: Glp-Ala-Ala-Leu-pNA

 α-Chymotrypsin: Suc-Phe-pNA

 Kallikrein: Z-D-Ala-Leu-Arg-pNA

 Leu-aminopeptidase: Leu-pNA

 Trypsin của bò và cua: Bz-D,L-Arg-pNA

 Protease PC và papain: Glp-Phe-Ala-pNA

 Carboxypeptidase PC: DNP-Ala-Ala-Leu

Tổng hợp một số ligand:

* Boc-Leu-N(CH 2 CH 2 ) 2 O

HOBt (1-hydroxybenzotriasol) (0.69 g, 5.16 mmol) được hoà tan trong 5ml hỗn hợp THF (tetrahydrofuran)-DMF (1:10) (1)

Boc-Leu-OH (1 g, 4.3 mmol) hoà tan trong 5ml THF (2)

Hoà trộn (1) với (2) Hỗn hợp thu được đem làm lạnh đến 0oC Sau đó thêm DCC

đã được hoà tan trong 3ml THF vào Cuối cùng thêm mopholine (473 µL, 5.4 mmol) vào và khuấy 15 phút ở 20oC Dicyclohexylurea kết tủa được lọc ra, tách lấy dung môi

Phần cặn dầu còn lại được hoà tan trong 120ml ethylacetate Dung dịch này sau đó được rửa bằng nước, bão hoà NaHCO3 và nước, làm khô với MgSO4 Cuối cùng bốc hơi dung môi, thu được 0.91g Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O, hiệu suất 81%

* H-Leu-N(CH 2 CH 2 ) 2 O *HCl

Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O (0.91 g, 3 mmol) được hoà tan trong 15ml HCl 3.4M trong dioxane Hỗn hợp được khuấy 3 giờ ở 20oC Sau đó, dung môi và HCl được bốc hơi ở áp suất thấp HCl được tách ra bằng cách rửa lại và bốc hơi với methanol Phần còn lại đem sấy khô chân không, thu được 0.642g H-Leu-N(CH2

CH2) 2O *HCl, hiệu suất 90%

* Z-Ala-Ala-Leu-N(CH 2 CH 2 ) 2 O

0.425g (3.15mmol) HBOt được hoà tan trước trong 5ml hỗn hợp THF-DMF (5:1), rồi được thêm vào (ở 0oC) 0.926g (3.15 mmol) Z-Ala-Ala-OH trong 20ml THF khô Tiếp tục cho vào hỗn hợp trên lần lượt được 0.779 g (3.78 mmol) DCC (đã hoà tan trong 20ml THF), 0.749 g (3.15 mmol) H-Leu-N(CH2 CH2) 2O *HCl với

484 µL (3.46 mmol) triethylamine

Khuấy hỗn hợp trên ở 20oC trong 15 giờ, sau đó lọc dicyclohexylurea ra Dịch lọc bốc hơi ở áp suất thấp, và hoà tan phần cặn dầu còn lại trong 130ml ethyl acetate Dung dịch được rửa với nước, bão hoà với NaHCO3 và được làm khô với MgSO4 Cuối cùng bốc hơi ở áp suất thấp, thu được 0.83g Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O, hiệu suất 56%.

* Ala-Ala-Leu-N(CH 2 CH 2 ) 2 O

508g Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O được hoà tan trong 7ml methanol, sau đó được bài khí với ảgon và thêm 50mg chì vào Dẫn H2 qua dung dịch trong 48 giờ

ở 20oC Rồi thêm HCOOH để hạ pH xuống còn 2-3

Lọc hỗn hợp và bốc hơi dung môi dưói áp suất thấp, thu được 0.33g N(CH2CH2) 2O, hiệu suất 95%

Ala-Ala-Leu-2.4 Một số phương pháp cố định ligand trên matrix

2.4.1 Cố định ligand thông qua tác nhân hoạt hóa cyanogen bromide

Tác nhân phổ biến nhất để liên kết ligand với matrix là cyanogen bromide (CNBr) Nó phản ứng với nhóm hydroxyl của Sepharose ở pH kiềm

Phản ứng:

Phản ứng của CNBr rất phức tạp Hình 4.9 thể hiện cơ chế của việc hoạt hóa Agarose cũng như các matrix chứa hydroxyl khác bằng CNBr ở pH cao (khoảng 11), CNBr phản ứng với nhóm hydroxyl của matrix để tạo ra thành phần hoạt hóa chính, cyanate ester, và các thành phần phụ khác, imidocarbonate (cyclic hoặc acyclic), carbamate và carbonate Tuy nhiên, các vòng imidocarbonate chiếm ưu thế hơn trong việc hoạt hóa các dextran liên kết ngang và cellulose Trong điều kiện kiềm nhẹ (pH 9-10), cyanate ester và vòng imidocarbonate phản ứng dễ dàng

với các nhóm amine cơ bản của ligand, kết quả tạo ra các dẫn xuất isourease và imidocarbonate thay thế tương ứng (hình 2) Các nhóm amino phản ứng như trung tâm của phản ứng này, vì vậy cần thiết phải tiến hành phản ứng ở pH 8 –

10 Ở pH này các nhóm amino vẫn không nhận thêm proton Phản ứng cặp đôi này không nên tiến hành trong một dung dịch đệm chứa các amine cơ bản, như tris, glycine hoặc ethanol amine Vì những tác nhân này sẽ cạnh tranh với các ligand cố định Dung dịch đệm được chọn thuồng là sodium carbonate hoặc bicarbonate, và điều kiện cặp đôi tối ưu là ở pH 8.3 Sau khi ligand được liên kết

và loại bỏ các ligand thừa, các nhóm hoạt hóa còn lai trong matrix có thể bị khóa lại bằng cách thêm vào một lượng dư các amine cơ bản nhỏ như tris, glycine, ethanolamine…

Ưu điểm:

Việc hoạt hóa bằng CNBr thì đơn giản và ôn hòa cho việc liên kết các phân tử sinh học nhạy cảm như enzym, lectin và kháng thể Hoạt hóa CNBr có thể được ứng dụng không chỉ với agarose, dextran hay Sephadex, mà còn có thể ứng dụng cho các polymer tổng hợp chứa nhóm hydroxyl Một khi được hoạt hóa các ligand nhỏ cũng như các ligand có khối lượng phân tử lớn chứa các amine cơ bản

có thể được liên kết

Nhược điểm:

Một nhược điểm chính của các matrix ái lực hoạt hóa bằng CNBr là các ligand đã

cố định bị rơi ra liên tục Liên kết yếu là nguyên nhân chính của sự không ổn định của liên kết isoureas giữa matrix hoạt hóa và ligand

Một nhược điểm khác của matrix này là chúng có thể hoạt động như một chất trao đổi anion yếu, làm thúc đẩy các liên kết không đặc hiệu Điều này làm cho dẫn xuất isourease tích điện dương ở pH trung hòa

Hình 2: Cơ chế hoạt hóa agarose (hoặc các polymer có nhóm hydroxyl) bằng

CNBr.

Quy trình làm việc:

Các tác nhân:

1 Cyanogen bromide (Aldrich, Milwaukee, WI)

2 Sepharose 4B hoặc 6B (Pharmacia)

Sự hoạt hóa:

(Lưu ý: CNBr có độc tính rất cao, phải tiến hành hoạt hóa CNBr trong thiết bị kín

có van thông hơi tốt)

1 Rửa 100ml Sepharose 4B với 1 lít nước đã được de-ion hóa trong phễu thủy tinh và làm khô

2 Tạo huyền phù gel trong 100ml sodium carbonate 2M trong becher

3 Hòa tan 10g CNBr trong 5ml acetonitrile và thêm dung dịch CNBr vào huyền phù gel và khuấy liên tục, sử dụng cánh khuấy overhead paddle

(Chú ý: không dùng cánh khuấy từ để tránh làm vỡ hạt gel)

4 Để phản ứng hoạt hóa tiếp tục trong đúng 2 phút ở nhiệt độ phòng

5. Rửa nhanh các hạt gel đã được hoạt hóa với 1 lít nước đá lạnh, sau đó rửa với dung dịch đệm liên kết lạnh (sodium bicarbonate 0.1M, chứa NaCl 0.5M, pH 8.5)

6 Tiến hành cố định ligand ngay

Cố định ligand:

7. Tạo huyền phù gel đã được hoạt hóa trong dung dịch đệm liên kết (sodium bicarbonate 0.1M, chứa NaCl 0.5M, pH 8.5) chứa protein (5-10mg/ml gel)

Tiếp tục tạo phản ứng liên kết trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng (hoặc qua đêm ở

4oC), khuấy liên tục, sử dụng cánh khuấy paddle

8 Rửa gel đã liên kết với dung dịch đệm liên kết, để loại bỏ các ligand không liên kết

9 Khóa các nhóm hoạt động còn lại trong gel bằng cách tạo huyền phù trong 100

ml ethanolaminr 1M hoặc glycerine 0.2M, pH 8.0 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng

10 Rửa gel với dung dịch đệm liên kết, sau đó rửa với dung dịch đệm acetate 0.1M (pH 4.0) chứa NaCl 0.5M Và rửa lại với dung dịch đệm liên kết

11 Cuối cùng rửa gel với nước Rửa tiếp với dung dịch đệm được chọn cho quá trình sắc ký ái lực

Ví dụ ứng dụng

Tinh sạch enzym protease thủy phân insulin (ISP – Insulin Specific Protease) phân lập từ tế bào xương của chuột, sử dụng sắc ký ái lực trên agarose được liên kết với insulin:

Tổng hợp Insulin-agarose:

Hoạt hóa trước agarose với cyanogen bromide Sau đó cho phản ứng với insulin ở

2 điều kiện khác nhau: dd đệm natri citrate 0.2M ở pH 5 Ở điều kiện pH acid, đầu N của phenylalanin của chuỗi B của insulin sẽ liên kết với agarose

Tinh sạch enzym:

Dịch huyền phù chứa enzym (sau khi qua các công đoạn ly tâm tách tạp chất thô) được tách phân đoạn bằng ammonium sulfate (0.21g rắn (NH4)2SO4 trên 1 ml

dịch huyền phù – bão hòa 30%), thêm NH4OH 0.1M hoặc HCl 0.1M để duy trì

pH 6.2 Ly tâm loại bỏ kết tủa, thêm 0.21 g rắn (NH4)2SO4 trên 1 ml dịch huyền phù nữa (bão hòa 60%), ly tâm tách kết tủa Dung dịch thu được đem tinh sạch.2-3 ml đ enzym thô được chạy qua cột Sephadex G-100 (1.5 x 8.3cm) trong 20mM đệm acteate, pH 6.2 Peak hoạt tính được rửa giải, kéo ra khỏi cột và được hấp phụ lên cột QAE-Sephadex (1.5 x 7cm) Cột này được rửa giải bằng NaCl 0.1M trong 20mM acetate – sử dụng 20 lần thể tích trong 2 giờ với 3 lần thay đổi Enzym sau đó được hấp phụ lên Sepharose-liên kết với insulin trong cột 0.5 x 6cm Rửa với 20mM đệm acetate (pH 6.2), rửa giải với NaCl 0.1M trong 20mM acetate

Enzym sau tinh sạch được phân tích và xác định hoạt tính Kết quả như bảng 4 và hình 3

Bảng 4: Tổng hợp độ tinh sạch ISP qua các công đoạn:

Hình 3: Kết quả rửa giải ISP từ insulin-agarose Mũi tên bên trái: thêm enzym vào; mũi tên bên phải: rửa giải với NaCl 0.2M trong 20mM acetate, pH 6.2.

2.4.2 Cố định ligand lên AH-Sepharose và CH-Sepharose:

Đối với một số các matrix ái lực như AH- và CH-Sepharose, ligand có thể được liên kết thông qua các spacer arm Một spacer arm thì được sử dụng để làm tăng khả năng xâm nhập của các protein lớn mà cần liên kết với các ligand nhỏ AH-Sepharose được chuẩn bị bằng liên kết đồng hóa trị của 1, 6-diaminohexane với Sepharose nhờ CNBr (hình 4)

Hình 4: Chuẩn bị AH-Sepharose

AH-Sepharose có thể phản ứng với nhiều tác nhân khác nhau để hình thành các nhóm chức năng thay thế, như diazonium, bromoacetamidoalkyl, và dẫn xuất thiol (hình 8) CH-Sepharose được tạo ra do phản ứng của Sepharose và 6-aminohexanoic acid được hoạt hóa bởi CNBr (hình 9)

CH-Sepharose phải được hoạt hóa trước khi tạo liên kết với ligand Nó có thể đưucọ hoạt hoá với carbodiimide và có thể liên kết với ligand chứa cả nhóm carboxylic acid và amino Carbodiimide bắt nguồn từ một phản ứng giữa một nhóm amine tự do và một nhóm carboxyl tự do để tạo nên riêng một liên kết peptid bằng cách loại bỏ nuớc với xúc tác acid CH-Sepharose cũng có thể được hoạt hoá bằng cách ester hoá nhóm carboxyl của CH-Sepharose với N-hydroxysuccinimide Các nhóm amino không được nhận proton ở pH kiềm sẽ tấn công nhóm carbonyl thiếu electron, bỏ qua N-hydroxy-succinimide

VÍ DỤ ỨNG DỤNG

Dùng N-Acetyl-D-arginine gắn trên hạt agarose để thu nhận protease II từ Escherichia coli

Gắn N-Acetyl-D-arginine lên hạt agarose:

Nhóm carboxyl của N-acetyl-D-arginine và nhóm amine của L-arginine cho vào tương ứng với AH-Sepharose và CH-Sepharose Tạo huyền phù gel Sepharose 4

B (6 gam) thu được 20mL gel, rửa huyền phù lần lượt bằng 20 ml nước cất, 20

ml ligand 100 mM Thêm vào 1.2g 1-ethyl-3carbodiimide dimethyllaminopropyl), và pH 5.5 Tiến hành phản ứng trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, khuấy nhẹ ; duy trì pH 5 bằng HCl 1M Trộn và rửa với 200ml nước cất, rồi cho vào cột thủy tinh (1.6×30cm) Rửa liên tục cột với 200ml NaCl 1M và 100mM dung dịch đệm Tris/HCl 1M (pH 8.2) với 200ml 1M NaCl và 100 mM acetic acid Sau đó cân bằng với 220 mM potassium phosphate pH 7.6

(3-Sắc ký ái lực trong 220mM potassium phosphate pH 7.6 bằng CH-Sepharose 4B

có gắn L-arginine, tách enzyme không đáng kể, trong khi đó dùng AH-Sepharose

4B gắn arginine giữ được nhiều hơn .Vì vậy dùng arginine để sử dụng là ligand.

N-acetyl-D-Sepharose –AH-N-acetyl-D-arginine thu được chứa 4.5 - 5 µmol arginine/ml trong gel trạng thái ổn định

Enzyme thô thu được từ E.coli có hai phần với trọng lượng phân tử khác nhau và

có họat độ khác nhau Trong đó, chỉ một enzyme có ái lực với trypsine, gọi là protease II Enzyme protease còn lại có tính ái lực với dẫn xuất của arginine và L-arginine tự do Chúng ta sử dụng tính chất này để tách protease II dùng sắc ký

ái lực với hạt agarose gắn N-acetyl –D-arginine Phương pháp này thu nhận được lượng enzyme 30-37%

Hình 5: Sắc ký thu nhận protease II dùng AH-Sepharose, ở 4 0 C Cột (0.9×6 cm) cân bằng với (A) 120 mM potassium phosphate pH 7.6, (B) 220 mM potassium phosphate pH 7.6 Lấy khỏang 6ml protein (họat tính 277 units/ml) hòa tan 0.6

ml dung dịch đệm vào mỗi cột Rửa bằng dung dịch đệm cho đến khi họat tính enzyme ít hơn 10 units/ml Dung dịch đệm có bổ sung vào 150 mM KCl cho vào mỗi cột và tổng họat độ enzyme nhận được Dòng chảy tốc độ 6 ml/giờ Đo ở bước song 280 nm (●) Họat tính đo với Bz-Arg-ONAn (○)d

Hình 6: Sắc ký ái lực sử dụng N-acetyl-D-arginine gắn với AH-Sepharose Hai peak ở 290-306 và 310-330 ml là phần A và B của enzyme.

Bảng 5: Kết quả tách protease II

Cột AH-Sepharose dùng N-acetyl-D-arginine dùng để thu nhận protease II từ Escherichia coli Sắc ký ái lực thực hiện sau khi DEAE-Sephadex ( quy trình làm sạch truyền thống).

Quá trình tinh sạch không hòan tòan khi khi tinh sạch enzyme nguồn enzyme có

sự hiện diện của proteins khác có khả năng gắn vào ligand với ái lực tương tự protease II Sắc ký ái lực của enzyme cải thiện khi có sự hiện diện enzyme sử lý với diisopropylphosphofluoridate

* SO SÁNH AH-SEPHAROSE, CH-SEPHAROSE VÀ CNBr-activated

SEPHAROSE:

Hình 7: So sánh cấu trúc của các loại Sepharose thường dùng

AH-Sepharose 4B và CH-Sepharose 4B: để liên kết với các ligand chứa một nhóm carboxyl tự do hoặc một nhóm amino cơ bản lên matrix Sepharose thông qua một nhóm“spacer” 6 phân tử carbon AH-Sepharose 4B, với 1 nhóm amino

cố định, và AH-Sepharose 4B, với 1 nhóm carboxyl cố định làm giảm đáng kể sự cản trở về không gian để có thể hình thành liên kết giữa ligand nhỏ với matrix Sepharose

Các ligand có thể liên kết trực tiếp với những nhóm “spacer” này, sử dụng một phản ứng carbodiimide, do đó làm giảm số bước tổng hợp chất hấp phụ

AH-Sepharose 4B, chứa nhóm –(CH2)6NH2 và CH-Sepharose 4B chứa –(CH2)5COOH, đều có sẵn dạng chế phẩm thương mại, 15g tưong ứng với 60ml 1 thể tích gel

Sepharose hoạt hoá bằng CNBr là một matrix đã được hoạt hoá Do đó, những protein và những nhóm amino cơ bản có thể liên kết trực tiếp

Matrix này ứng dụng tốt trong các trường hợp cố định các đại phân tử được chạy sắc kí ái lực

Sepharose 4B hoạt hoá bằng CNBr là một vật liệu thưòng được chọn trong cố định các đại phân tử; khi chuẩn bị chất hấp phụ có tính đặc hiệu sinh học để chạy sắc ký ái lực Nó được sử dụng trong nghiên cứu protein, nucleic acid, polysaccharide… Sepharose cung cấp một matrix rất ổn đinh, có khả năng cao, thậm chí là đối với phân tử rất lơn, và nó không có tính hấp phụ đặc hiệu

Sepharose 4B được hoạt hoá bởi CNBr ở dạng sấy lạnh được đóng gói sẵn, tương ứng với cột 50ml

2.4.3 Cố định ligand bằng sự hoạt hoá với Divinylsulfone