Các phản ứng sinh hóa củ vi sinh vật

Nguyên tắc: Xác định khả năng lên men của vi sinh vật đối vớinguồn carbohydrate cụ thể Glucose, Lactose, Xylose… kết hợpvới môi trường kiểm tra khả năng sinh acid hoặc sinh acid và sinhh

CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA

1.1 Nguyên tắc: Xác định khả năng lên men của vi sinh vật đối với

nguồn carbohydrate cụ thể (Glucose, Lactose, Xylose…) kết hợpvới môi trường kiểm tra khả năng sinh acid hoặc sinh acid và sinhhơi

1.2 Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men carbohydrates:

• các loại acid như: lactic acid, acetic acid,…,

• một vài loại rượu như: ethyl alcohol…,

• Xêton

• và hai loại hơi là: carbon dioxide, hydrogen

1 KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÊN MEN CARBOHYDRATE

1.3 Môi trường: Carbohydrate fermentation broth

Chứa 3 thành phần căn bản:

¾ (0.5 - 1.0)% carbohydrate kiểm tra (ví dụ: lactose hoặc

glucose…),

¾ Chất chỉ thị pH (Xem phần 1.4)

¾ Môi trường dinh dưỡng để hầu hết các vi sinh vật có thể

tăng trưởng dù vi sinh vật đó có khả năng lên men đườnghay không

1 KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÊN MEN CARBOHYDRATE

1.4 Chất chỉ thị pH:

Phenolsulfonphthalein (C19H14O5S)

8.4 – đỏ hồng nhạt

6.8 - vàng 7.9

Phenol red

2- Methylamiophenazine (C15H17N4Cl)

8.0 - vàng 6.8 - đỏ

7.5 Neutral red

4’ – Dimethylaminoazobenzene- 2-carboxylic acid

(C15H15N3O2)

6.0 - vàng 4.4 - đỏ

5.0 Methyl red

Dibromophenolsulfonphthalein (C27H28O5SBr2)

7.6 – Xanh đậm 6.0 - vàng

7.0 – xanh lá cây

Bromthymol

blue

cresolsulfonphthalein (C21H16O5SBr2)

Dibromo-o-6.8 - tím 5.2 - vàng

6.3 –tím

Bromcresol

purple

Acid fuchsin 8.0 – vàng nhạt

5.0 - hồng

7.2 – không màu

Chất chỉ thị

pH

1 KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÊN MEN CARBOHYDRATE

2 MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI

TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)

2.1 Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng nguồn carbohydrate

cụ thể kết hợp với môi trường tăng trưởng căn bản, có hoặckhông có sinh hơi và hydrogen sulfide (H2S)

2.2 Môi trường

Glucose hay Galactose Chu trình Krebs

Lactose β - Galactosidase Glucose + Galactose

Đáy

2 MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)

• Sử dụng glucose (điều kiện kỵ khí – đáy)

Con đường Embden-Meyerhof

Glucose hoặc Galactose Con đường Embden-Meyerhof

Kỵ khí

Các acid hữu cơ Các aldehyde Các loại rượu

CO2 + H2Năng lượng

2 MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)

• Không lên men lactose và glucose

Peptone Hiếu khí

Kỵ khí Ammonia (NH3) Æ Kiềm

Vi khuẩn (môi trường acid) + Sodium thiosulfate H2S gas

H2S + ion sắt Sắt sulfide (không tan tạo tủa màu đen)

• Sinh hydrogen sulfide (H 2 S)

2 MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)

Đáy ống nghiệm

• Màu vàng: glucose dương tính (lên men glucose)

• Màu đỏ/không đổi màu: glucose âm tính (không lên men glucose)

• Màu đen: sinh H2S

• Vỡ thạch: sinh hơi từ glucose

2 MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI

TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)

3 DECARBOXYLASE TEST

(LTSINE-ORNITHINE-ARGININE) VÀ DEHYDROLASE TEST ((LTSINE-ORNITHINE-ARGININE)

3.1 Decarboxylase test (lysine-ornithine-arginine)

L-Lysine Lysine decarboxylase

- CO2 Cadaverine (diamine) + CO2

L- Ornithine Ornithine decarboxylase

Cadaverine và Putrescine ổn định khi được tạo ra dưới điều kiện kỵ khí vì thế vi khuẩn phải được nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí bằng cách phủ một lớp paraffin hay dầu khoáng lên trên bề mặt môi trường

3 DECARBOXYLASE TEST

(LTSINE-ORNITHINE-ARGININE) VÀ DEHYDROLASE TEST ((LTSINE-ORNITHINE-ARGININE)

3.1 Decarboxylase test (lysine-ornithine-arginine)

3.1.2 Cơ sở sinh hóa:

L-Arginine Arg

ininedecarb

deh yd rolase

L-Citrulline +

NH3

Citrulline ureidase

2NH3

CO2L-Ornithine

CO2Putrescine

Nếu chỉ thị pH thay đổi sang kiềm nhanh và mạnh thì đó là do hệ

thống arginine dehydrolase phân hủy arginine

3 DECARBOXYLASE TEST

(LYSINE-ORNITHINE-ARGININE) VÀ DEHYDROLASE TEST ((LYSINE-ORNITHINE-ARGININE)

3.2 Arginine decarboxylase test và arginine dehydrolase test

Cơ sở sinh hóa: L-arginine được sử dụng bởi hai hệ thống xảy ra

đồng thời hoặc riêng lẽ Hai con đường đó là:

3 DECARBOXYLASE TEST

(LYSINE-ORNITHINE-ARGININE) VÀ DEHYDROLASE TEST ((LYSINE-ORNITHINE-ARGININE)

4.1 Nguyên tắc: phát hiện khả năng oxi hóa tryptophan thành các

dạng của indol: Indole, Skatole (methyl indole) và indole-acetate

4.2 Môi trường: Tryptophan hoặc peptone broth

Red color

4.4 Đọc kết quả.

– Dương tính: xuất hiện vòng màu đỏ trên bề mặt môi trường – Âm tính: màu vàng (màu của thuốc thử Kovacs’s)

– Dương tính: môi trường có màu hồng

– Âm tính: môi trường không đổi màu (vàng cam)

5 UREASE TEST

5.1 Nguyên tắc: sử dụng để phát hiện khả năng phân cắt urea

thành ammonia do hoạt tính của urease từ vi sinh vật và kết quả làmôi trường bị kiềm hóa do NH3 được tạo ra

5.2 Môi trường: Urea broth (hoặc Urea agar)

5.3 Phản ứng:

2 Glucose + H2O Æ 2 Lactic acid + acetic acid + ethanol + 2 CO2 + 2H2

(Formic acid Æ H2+CO2)

6.5 Đọc kết quả:

– Dương tính: môi trường chuyển màu đỏ (pH=4.4)

– Âm tính: môi trường không đổi màu (pH=6.0)

6 METHYL RED (MR) TEST

6.1 Nguyên tắc: kiểm tra khả năng tạo và duy trì acid được tạo ra từ

quá trình lên men glucose của vi sinh vật

6.2 Môi trường: MR-VP Broth.

6.3 Thuốc thử: chỉ thị pH Methyl

7.1 Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol

(acetoin) trong quá trình lên men glucose của một số vi sinh vật

7.2 Môi trường: MR-VP Broth.

7.3 Thuốc thử:

- Naphtol, (chất tăng cường màu)

- KOH 40%, (chất oxi hóa)

7.4 Phản ứng:

Acetoin + α - Naphthol O40%KOH

2 (oxidized ) Diacetyl

(Thuốc thử O’Meara and Coblentz)

8.1 Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng sodium malonate là

nguồn carbon duy nhất cùa vi sinh vật và kết quả là tạo môitrường kiềm

8.2 Môi trường: Malonate broth.

8.3 Thuốc thử: Bromthymol blue – chất chỉ thị pH

8.4 Phản ứng:

Pyruvate Acetyl CoA

Oxaloacetate

Citrate Malate

8.5 Đọc kết quả:

– Dương tính: Màu xanh dương đậm (kiềm)– Âm tính: Màu xanh lá cây

Citrate Æ oxalacetate + acetate Oxalacetate Æ Pyruvate + CO2

pH kiềm Pyruvate Æ acetate + formate

pH acid 2 pyruvate Æ acetate + CO2 + lactate

2 pyruvate Æ acetoin + 2CO2

9 CITRATE TEST

9.1 Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng citrate như là nguồn

carbon duy nhất trong quá trình biến dưỡng của vi sinh vật

9.2 Môi trường: Simmons citrate medium.

9.3 Thuốc thử: Bromthymol blue – chất chỉ thị pH

Phản ứng:

9 CITRATE TEST

9.4 Cơ sở sinh hóa: Môi trường có chứa muối ammonium vô cơ

Vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn Carbon duynhất thì có khả năng sử dụng muối Amonium làm nguồn Nitơ vàsinh NH3 làm môi trường trở nên kiềm

9.5 Đọc kết quả:

– Dương tính: Màu xanh dương đậm (kiềm)

– Âm tính: Màu xanh lá cây

10.1 Nguyên tắc: Xác định khả năng sống và tái sinh của vi sinh

vật trong môi trường chứa potassium cyanide

10.2 Môi trường: KCN broth.

10.3 Cơ sở sinh hóa:

- Hầu hết các vi sinh vật hiếu khí đều có enzyme cytochrome

oxidase, nhờ enzyme này mà vi sinh vật sử dụng oxygen là chấtnhận điện tử cuối cùng để khử oxygen phân tử thành hydrogen peroxide (H2O2)

- Vi sinh vật kỵ khí không có khả năng sống khi có sự hiện diệncủa oxygen trong không khí vì không có hệ thống cytochromeoxidase

10 POTASSIUM CYANIDE TEST

– Ion cyanide (CN-) có thể ức chế quá trình hô hấp, quá trình ứcchế xẩy ra trên hệ thống cytochrom Cyanide là chất ức chếcytochrome oxidase.

– Một vài vi sinhvật hiếu khí không nhạy với cyanide, chúng cókhả năng kháng với chất ức chế khi chúng có hệ thống hô hấpflavoprotein hoặc cyanide-insensitive khử diphosphopyridinenucleotide (DPNH) và triphosphopyridine nucleotide (TPNH) oxidases

10.4 Đọc kết quả:

– Dương tính: Tăng trưởng trên môi trường nuôi cấy (gây đục)– Âm tính: Không tăng trưởng (trong)

2 cytochrome c bị khử + 2 H + + ½ O2 Cytochromeoxidase 2 cytochrome c bị oxi hóa

+ H2O

2 cytochrome c bị oxi hóa + thuốc thử bị oxi hóa Hợp chất có màu

(xanh indophenol)

11 OXIDASE TEST

10.1 Nguyên tắc: Xác định sự hiện diện của enzyme oxidase

(cytochrome oxidase system)

10.2 Thuốc thử: p-phenylenediamine.

10.3 Cơ sở sinh hóa:

11 OXIDASE TEST

11.5 Đọc kết quả:

– Dương tính: Màu xanh

– Âm tính: Không đổi màu khuẩn lạc

Giống như phản ứng nhuộm gram, string test dựa trên sự khác nhau vềcấu trúc hóa học của vách tế bào Vách tế bào của vi khuẩn gram âm

dễ vỡ khi tiếp xúc với dung dịch kiềm String test bước đầu có thểphân loại được vi khuẩn gram âm và gram dương

String test dương tính

Màng tế bào

12 STRING TEST

Protein (gelatin) + H2O

Gelatinases Proteinase Polypeptides

Polypeptides + H2O Gelatinases

Peptidase Các amino acid riêng lẽ

Chú ý: Gelatin ở dạng rắn khi ủ ở 200 C hoặc thấp hơn và dạng lỏng khi ủ ở 35 0 C hoặc lớn hơn Gelatin chuyển từ dạng (trạng thái rắn) thành dạnh lỏng khi ủ ở 28 0 C Vì thế, nếu ống gelatin được ủ ở 35 0 C hoặc lớn hơn thì chúng phải được đặt vào tủ lạnh hay tủ mát trước khi đọc kết quả

13 KIỂM TRA LÀM TAN CHẢY GELATIN

13.1 Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh enzyme gelatinase làm tan

chảy môi trường gelatine Biến dưỡng protein bởi enzyme gelatinase có hai bước và kết quả là tạo hổn hợp các amino acids riêng lẽ

13.2 Môi trường: Nutrient gelatin stab medium

Phản ứng:

13 KIỂM TRA LÀM TAN CHẢY GELATIN

13.3 Đọc kết quả:

– Dương tính: Tan chảy môi trường

– Âm tính: môi trường ở dạng rắn (không tan chảy)

2NO3- + 10 e - + 12 H +

(Nitrate)

N2+ 6 H2O Nitratase

NO3- + 2 e - + 2 H +

(Nitrate)

NO2- + H2O (Nitrite) Nitratase

Sulfanilic acid (không màu) + HNO2 Æ sulfanilic acid bị diazo hóa + H2O

14 KIỂM TRA KHỬ NITRATE

14.1 Nguyên tắc: Xác định khả năng khử nitrate thành nitrite hoặc

sinh hơi nitrogen tự do của vi sinh vật

14.2 Môi trường: Nitrate broth

+ α – Naphthylamine

(không màu)

Kết hợp

p-Sulfobenzene-azo-α-naphthylamine (màu đỏ)

• Dương tính: không hình thành màu

• Âm tính: màu hồng tới đỏ đậm trong (5-10) phút

14 KIỂM TRA KHỬ NITRATE

15 THỬ NGHIỆM CATALASE

15.1 Nguyên tắc: Phát hiện enzyme catalase của vi sinh vật, catalase

thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và O2

15.2 Thuốc thử: hydrogen peroxide (H2O2) 30%

15.3 Tiến hành:

Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một

phiếm kính sạch Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vậttrên phiếm kính, ghi nhận sự sủi bọt nếu có

15.4 Đọc kết quả:

- Dương tính: Sủi bọt (do O2)

- Âm tính: không sủi bọt

16 THỬ NGHIỆM COAGULASE

16.1 Nguyên tắc: Phát hiện vi sinh vật có sinh enzyme coagulase,

coagulase có tác dụng làm ngưng kết các thành phần của huyếttương tạo thành các khối đông huyết tương

16.2 Thuốc thử: Huyết tương thỏ

16.3 Tiến hành:

Cho vào ống nghiệm 0,5 mL huyết tương thỏ không pha loãng, bổ

sung 0,5 mL dịch nuôi cấy chủng thuần hoặc một lượng lớn sinhkhối khuẩn lạc

Xoay nhẹ ống để trộn đếu vi sinh vật

Ủ ống nghiệm ở 370C trong 4h Quan sát sự ngưng kết mỗi 30 phút

16.4 Đọc kết quả:

- Dương tính: có sự kết tụ huyết tương

- Âm tính: không có sự kết tụ

17 THỬ NGHIỆM CAMP

17.1 Nguyên tắc: Phản ứng CAMP là phản ứng phối hợp giữa nhân

tố protein tiết ra bởi vi sinh vật với nhân tố β-hemolysin tiết ra

bởi chủng Staphylococcus aureus gây ra hiện tượng làm tan

hồng cầu của cừu trên môi trường thạch máu Nhân tố CAMP

có vai trò tăng cường hoạt tính phospholipase C xúc tác thủyphân thành phần chủ yếu của mảng hồng cầu cừu là

sphingomyelin của β-hemolysin

Trong thử nghiệm CAMP, cấy chủng kiểm nghiệm cùng với chủng

Staphylococcus tạo nhiều β-hemolysin lên môi trường thạchmáu được bổ sung máu cừu

17.2 Môi trường: Blood agar

17.3 Chủng chuẩn: Staphylococcus aureus

17 THỬ NGHIỆM CAMP

17.4 Tiến hành:

17.5 Đọc kết quả:

- Dương tính: có sự hình thành vùng cộng hưởng tan huyết tại vùng tiếp giáp giữa hai đường cấy của L.monocytogenes và

S.aureus.

18 THỬ KHẢ NĂNG DI ĐỘNG

18.1 Nguyên tắc: Dựa vào sự quan sát khả năng tăng trưởng và di

động của vi sinh vật trong môi truờng thạch

18.2 Môi trường: Môi trường thạch mềm chứa 0,5% agar.

18.3 Tiến hành:

Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc thuần, cấy đâm sâu

xuyên vào giữa môi trường trong ống nghiệm chứa môi trườngthạch mềm Ủ ở nhiệt độ thích hợp

xung quanh vẫn trong