CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT MÀU TỪ NẤM MEN

 Trong một số động vật biển như tôm hùm, cua…tồn tại một dạng phức hợp giữa carotenoid và protein gọi là carotenoprotein lúc còn sống có màu xanh lá, tím hoặc xanh dương; nhưng khi nấu

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG

CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT MÀU TỪ NẤM MEN

MỤC LỤC

PHẦN I: TỔNG QUAN 3

1 Giới thiệu về carotenoid 3

1.1 Phân bố 3

1.2 Phân loại 4

2 Nguyên liệu sản xuất 4

2.1 Thành phần nguyên liệu 4

2.2 Mô tả nguyên liệu 5

3 Giống vi sinh vật 9

3.1 Giới thiệu giống vi sinh vật 9

3.2 Hình thái 10

3.3 Cấu tạo 11

3.4 Đặc điểm sinh hóa 13

3.5 Sinh sản 13

3.6 Tiêu chí chọn giống 14

3.7 Cơ chế sinh tổng hợp sắc tố carotenoid từ Rhodotorula 15

PHẦN II: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT 18

1 Quy trình công nghệ 18

2 Thuyết minh quy trình 19

2.1 Chuẩn bị môi trường 19

2.2 Tiệt trùng 19

2.3 Hoạt hóa giống, nhân giống 21

2.4 Lên men 21

2.5 Ly tâm tách sinh khối 23

2.6 Đồng hóa 25

2.7 Trích ly 26

2.8 Lọc 28

2.9 Cô đặc 30

2.10 Sấy 31

PHẦN III: SẢN PHẨM 33

1 Các chỉ tiêu 33

1.1 Vật lý 33

1.2 Hóa học 34

1.3 Sinh học 35

2 Ứng dụng 36

2.1 Tạo màu cho sản phẩm 36

2.2 Dùng làm dược phẩm 37

3 Thành tựu 37

PHẦN IV: TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHẦN I: TỔNG QUAN

1 GIỚI THIỆU VỀ CAROTENOID

Carotenoid là nhóm chất màu hòa tan trong chất béo có trong lục lạp, trong quả và rau có màu da cam, màu vàng và màu đỏ Có khoảng hơn 600 loại carotenoid tồn tại trong tự nhiên Chúng rất phổ biến và được tạo ra rất nhiều trong tự nhiên Người ta ước tính rằng hằng năm có trên 100 triệu tấn carotenoid được sản sinh ra trong tự nhiên Phần lớn lượng này ở dạng fucoxanthin (trong tảo), và trong 3 carotenoid chính của lá cây là lutein, violaxanthin và neoxanthin Còn lại tuy chiếm lượng nhỏ hơn nhưng hiện diện khắp nơi là β-carotene và zeaxanthin Những sắc tố khác là lycopene (cà chua),

capsanthin (tiêu đỏ), bixin (điều)

 Hàm lượng carotenoid hầu như giống nhau ở các loại lá cây:

β-carotene (25-30%), lutein (khoảng 45%), violaxanthin (15%), neoxanthin (15%) trên tổng số khối lượng carotenoid Ngoài ra còn

có một lượng nhỏ α-carotene, α và β-cryptoxanthin, zeaxanthin, atheraxanthin, lutein – 5,6 – epoxdide

Carotenoid cũng phân bố trong các mô thường (không có phản ứng quang hợp) tạo ra màu vàng, cam, đỏ cho hoa quả như cà chua, cà rốt, bí đỏ…

Động vật  Carotenoid tạo màu vàng, đỏ cho lông cánh các loài chim; tạo

màu lông và da vàng cho gà con, tạo màu đỏ cho lòng đỏ trứng

 Trong một số động vật biển như tôm hùm, cua…tồn tại một dạng phức hợp giữa carotenoid và protein gọi là carotenoprotein lúc còn sống có màu xanh lá, tím hoặc xanh dương; nhưng khi nấu chín protein bị biến tính màu đỏ của carotenoid mới hiện ra.

Vi sinh vật

 Carotenoid là chất màu nội bào của một số loài vi sinh vật

như: vi khuẩn (Brevibacterium tạo canthaxanthin, Flavobacterium tạo zeaxanthin), nấm men (Rhodotorula sp.), nấm mốc (Neurospora crassa, Mucorals choanophoracea), tảo (Dunadiella)

1.2 Phân loại

Carotenoid được cấu tạo từ 8 đơn vị isoprene liên tiếp nhau ở trung tâm của phân tử tạo nên cấu trúc đối xứng, có thể chia làm hai nhóm chính:

- Carotenes: gồm các hydrocarbon carotenoid (C40H56)

- Xanthophylls: gồm các dẫn xuất có chứa oxy như hydroxyl, keto, epoxy,

methoxy, acid của carotenoid (C40H56O2)

Theo Bong và cộng sự (2004) các carotenoid chính được nghiên cứu từ giống nấm

men Rhodotorula hiện diện đủ cả hai nhóm, trong đó torulene, β-carotene thuộc nhóm carotenes; torularhodin, astaxanthin thuộc nhóm xanthophylls

2 NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT

Nguồn carbon sử dụng là mật rỉ đường, có hàm lượng chất khô 75-83% khối lượng,

Olbrich (1963), p.540, Chen and Chou (1993), p.408

Ngoài ra, ra trong mật rỉ còn có chứa một số vitamin

Bảng 4 Thành phần vitamin trong mật rỉ (tính theo µg/g rỉ đường)

sinh vật càng kém Màu sẫm bám vào sinh khối nấm men và tạo cho nấm men có màu vàng thẫm, không phải màu tự nhiên của nấm Ngoài ra rỉ đường cũng là môi trường dinh dưỡng khá lý tưởng cho vi sinh vật xâm nhập và phát triển.

Để xử lý hệ keo và màu sẫm của mật rỉ, người ta sử dụng 3.5kg acid sunfuric đậm đặc cho một tấn mật rỉ Khi cho H2SO4 vào mật rỉ, có ba cách thực hiện quá trình xử lý này

Cách thứ nhất: Khi cho 3.5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta khuấy đều ở nhiệt

độ thường trong 24h, sau đó ly tâm thu dịch đường

Cách thứ hai: Khi cho 3.5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta đun nóng toàn bộ lên

85oC và khuấy đều liên tục trong 6h, sau đó ly tâm thu dịch đường

Cách thứ ba: cho H2SO4 đến khi pH của mật rỉ đạt giá trị 4, người ta đun nóng đến

120 – 125oC trong một phút để các chất vô cơ kết tủa, sau đó ly tâm dịch đường

Dịch đường sau khi xử lý được pha chế thành môi trường có nồng độ phù hợp cho quá trình lên men thu sinh khối

K2O (khan), % KL chất khô 53

Kim loại nặng (như Pb) , % KL chất khô 0.001

Kim loại nặng (Pb), % KL chất khô 0.005

3 GIỐNG VI SINH VẬT

Hình 4 Khuẩn lạc Rh mucilaginosa Hình 3 Tế bào Rhodotorula glutinis

3.1 Giới thiệu giống vi sinh vật

- Theo phân loại Harison(1927) nấm men Rho dotorula thuộc:

- Nấm men Rhodotorula còn được gọi là nấm men sinh sắc tố carotenoid

(carotengensis), là một trong rất ít các giống nấm men có khả năng tổng hợp tích lũy một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là β-carotene, torulene, torulahodin…

- Rhodotorula thuộc cơ thể đơn bào, không sinh bào tử, không có sợi khuẩn ti hay

sợi khuẩn ti giả

- Rhodotorula là nhóm sinh vật ưa ấm, khoảng nhiệt độ hoạt động từ 20-400C

- Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi: trong đất, không khí, trên các vỏ lá cây như táo, dưa hấu, dâu tây…

3.2 Hình thái

- Khi quan sát dưới kính hiển vi tế bào nấm men Rhodotorula có dạng hình tròn,

oval, elip, cầu đến dạng thon dài hoặc gậy

- Kích thước tế bào dao động trong khoảng 2-5 µm, chiều rộng 2,5-10 µm, chiều dài phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và độ tuổi

- Kích thước khuẩn lạc tùy môi trường, có thể đạt từ 1-10 mm

- Quan sát dưới kính hiển vi không hình thành sợi nấm, một số có sinh sợi nấm giả nhưng rất kém phát triển, thường nảy chồi ở đỉnh, không hình thành bào tử túi

Bảng 10 Một vài loài sinh tổng hợp chất màu carotenoid

Rh Acheniorum Hồng Dài Quả dâu, lá lê

Rh Bogoriensis Kem hoặc hồng Gậy

elip

Rh Lactosa Vàng, hồng hoặc

đỏ

Rh

Mucilaginosa(rubra

)

Rh Muscorum Kem hoặc nâu nhạt Gậy

ngâm

3.3 Cấu tạo

Các nghiên cứu cho thấy, nấm men Rhodotorula có hình thái và cấu tạo tế bào giống

như các loài nấm men khác, được cấu tạo từ cách thành phần sau:

3.3.1 Thành tế bào

Được cấu tạo từ các thành phần khác nhau, trong đó đánh kể nhất là: glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ như kitin

- Glucan: là hợp chất cao phân tử của D-glucose Đó là một polysaccharide phân

nhánh có liên kết β-1,3 và β-1,6 Cả hai thành phần này phân bố đều trên thành tế bào

- Manan: là hợp chất cao phân tử của D-manose, mỗi phân tử thường chứa 200 –

400 thành phần manose Thường manan liên kết với protid theo tỷ lệ 2:1 Manan

thường có mối liên kết α-1,6; α-1,3; β-1,3 Phân tử lượng của chúng khoảng 5.104.

- Protein: thường protein liên kết với các thành phần khác như là manan Trong

thành phần của chúng chứa nhiều acid amin Phân bố ở màng tế bào, gần sát bào tương

- Kitin: nằm ở phần nẩy chồi Chúng chiếm số liệu rất nhỏ khoảng 3% Là chất bền

vững, không bị enzyme phá hủy, vì thế chúng có tác dụng bảo vệ chồi còn non.Ngoài ra trong thành phần tế bào có lipid ở dạng phospholipid, khoảng 1 – 10%

mà khả năng trao đổi chất của nấm men gặp khó khan Hai hiện tương này được gọi là

co và trương nguyên sinh chất

3.3.3 Nguyên sinh chất

Tế bào còn non thì nguyên sinh chất càng đồng nhất, càng về già càng mất tính đồng nhất do xuất hiện nhiền không bào và hạt volutin Thành phần bao gồm: nước, protid, lipid, glucid, muối khoáng và enzyme Tế bào chất luôn luôn chuyển động, thường chuyển động một chiều xung quanh thành tế bào

3.3.4 Nhân

Ở Rhodotorula đã có nhân thật, nhân hình bầu dục hay hình cầu Nó được bao bọc

bởi lớp màng bên trong là lớp dịch nhân Giống như các vi sinh vật khác, nhân nấm men

có chứa protein và acid nucleic Ở trạng thái lên men nhân tăng 20 – 30 lần so với ở trạng thái hô hấp

3.3.5 Các thành phần khác

Không bào: là nơi chứa đựng protease.

Hạt không bào: thường nằm trong không bào, là chất dinh dưỡng của tế bào, nguồn

năng lượng cho tế bào, tham gia điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào

Ty thể: cung cấp năng lượng hoạt động cho tế bào.

Riboxom: tham gia vào nhiều quá trình sinh tổng hợp của nấm men.

Volutin: không phải là thành phần cấu trúc tế bào, chúng xuất hiện ở những điều kiện

đặc biệt như khi nuôi cấy trên môi trường giàu hydratcacbon và phosphate vô cơ Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ carbon : nitơ và sự có mặt của lưu huỳnh cũng như của vitamin Volutin đóng vai trò quan trọng sau:

- Là chất dự trữ dinh dưỡng cho tế bào

- Tham gia điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào

- Làm nguồn năng lượng cho tế bào

3.4 Đặc điểm sinh hóa

- Không lên men các loại đường như: D-glucose, D-galactose, maltose, saccharose

và nhiều loại đường khác nhưng chúng lại sử dụng các loại đường này cung cấp nguồn carbon cho việc xây dựng tế bào

- Tạo ra enzyme urease

- Đồng hóa DBB (Diazonium Blue B)

- Có chứa sắc tố Carotenoid

- Không tạo ra acid acetic

- Không đồng hóa được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của Rhodotorul khác với các giống nấm men Cryptococcus, Candida.

- Có hoạt tính protease ngoại bào trên các nguồn cơ chất khác nhau

- Có chứa enzyme D-amino-acid oxidase

- Có chứa các enzyme khử bảo hòa (desaturase), đặc biệt có khả năng chuyển hóa acid oleic (C18:1) thành acid linolenic (C18:3)

- Khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid

3.5 Sinh sản

Đa số loài của nấm men Rhodotorula sinh sản bằng cách nảy chồi như: Rh.pilimane,

Rh.pilatii, Rh.javaniti, Rh.ingniosa, Rh.difluens và Rh.bogoriensis Ngoài ra, Rhodotorula còn sinh sản theo kiểu phân đôi nhưng giống Rhodotorula không có kiểu

sinh sản hữu tính

3.5.1 Sinh sản bằng hình thức nảy chồi

Đầu tiên hạch nấm men bắt đầu dài ra và sau đó hạch bắt đầu thắt lại ở chính giữa

Tề bào mẹ bắt đầu phát triển chồi con Hạch một phần chuyển vào chồi và một phần

ở tế bào mẹ, nguyên sinh chất cũng chuyển sang chồi con

Khi chồi con gần bằng chồi mẹ nó sẽ được tách ra và sống độc lập

 Đây là hình phương pháp sinh sản vô tính chủ yếu nhất ở nấm men

3.5.2 Sinh sản bằng hình thức phân đôi

Lúc đầu tế bào dài ra, sau đó từ từ thắt lại ở chính giữa, nơi thắt này nhỏ dần, nhỏ dần tới khi dứt hẳn và tạo thành 2 tế bào con độc lập

Hai tế bào con này giống hệt nhau và đều mang một nửa vật chất di truyền của tế bào mẹ

Tốc độ sinh sản của Rhodotorula nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi thường

2-6h

Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm 4 giai đoạn:

Ÿ Giai đoạn thích nghi

Ÿ Giai đoạn phát triển

- Khả năng sinh tổng hợp chất màu carotenoid cao.

- Có khả năng thích nghi và tốc độ sinh trưởng cao

- Điều kiện nuôi cấy rẻ tiền đơn giản

3.7 Cơ chế sinh tổng hợp sắc tố carotenoid từ Rhodotorula

Có rất nhiều loại carotenoid được tổng hợp từ nấm men, trong đó chủ yếu: carotene, torulene, lycopene, astaxanthin, torularhodin, … Toàn bộ quá trình sinh tổng hợp sắc tố carotenoid của nấm men có thể chia thành 3 giai đoạn:

- Giai đoạn cảm ứng ánh sáng (tối thiểu 12 giờ)

- Giai đoạn tổng hợp enzyme – giai đoạn này xảy ra trong tối

- Giai đoạn tổng hợp carotenoid phụ thuộc vào ánh sáng

Giai đoạn đầu tiên hình thành các tiền terpenoid gồm 5 carbon ban đầu Giai đoạn hai

là giai đoạn hình thành các hợp chất C40 Giai đoạn cuối cùng là thay đổi chuỗi C40 trong hệ thống các carotenoid Có nhiều hệ enzyme khác nhau được sử dụng vào giai đoạn cuối cùng của quá trình tổng hợp các strerol và carotenoid, chúng có chung con

đường là thông qua Farnesyl pyrophosphate (FPP) Giống Rhodotorula thông qua tổng

hợp acid mevalonic phù hợp với sự hình thành carotene của nấm men và tương tự với con đường tổng hợp carotene của các vi sinh vật sinh sắc tố carotenoid khác

Carotenoid là một loại hợp chất isoprenoid được sinh tổng hợp từ acetyl coenzyme-A qua acid mevalonic Giai đoạn tạo các carotenoid bắt đầu với sự tạo thành hợp chất C40 đầu tiên, phytoene, từ hai phân tử geranylgeranyl diphosphate (GGDP)

Phytoene tạo thành ở dạng đồng phân 15C, có 3 nối đôi liên hợp, không có màu, sẽ chuyển hóa tiếp tục bằng những phản ứng dehydro hóa, tạo sản phẩm cuối cùng là lycopene Sơ đồ chuyển hóa theo hình 6.

Hình 5 Con đường sinh tổng hợp carotenoid

γ -carotene

β-carotene Torulene

Torularhodin

Echinenone 3-OH-echinenone Phoenicoxanthin

Astaxanthin

4-keto-torulene 3,3’-dihydroxy-3,4’-didehydro- β , ϕ -caroten- 4-one (HDCO)

3,3’-dihydroxy - β , γ -caroten-4,4’-dione (DCD)

Astaxanthin

Mevalonate-pyrophosphate (MVPP) Isopentenyl-pyrophosphate (IPP) Dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) Geranyl-pyrophosphate (GPP)

Farnesyl-pyrophosphate (FPP) Geranyl geranyl-pyrophosphate (GGPP) Phytoene

Neurosporene

Acetyl-CoA Acetoacxetyl-CoA 3-hydroxymethyl-3-glutaryl-CoA (HMG-CoA) Mevalonic acid (MVA)

Sau cùng, lycopene tiếp tục đóng vòng ở một hoặc hai đầu tạo ra các sản phẩm carotene như γ-carotene, δ-carotene (đơn vòng), β-carotene, α-carotene, ε-carotene (hai vòng) Sơ đồ theo hình 7.

Các hợp chất carotene chứ nhóm chức chứa oxy (hydroxyl, epoxy, methoxy, ) như astaxanthin, torularhodin, thường tổng hợp vào giai đoạn cuối cùng

Hình 6 Các phản ứng dehydro hóa trong quá trình sinh tổng hợp carotenoid

Hình 7 Tổng hợp carotenoid có vòng từ lycopene

PHẦN II: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

1 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

Môi trường

Sản phẩm

2 THUYẾT MINH QUY TRÌNH

2.1 Chuẩn bị môi trường

Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men.

Môi trường sau khi được trộn đưa vào thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20 để tiêu diệt

vi sinh vật có sẵn trong môi trường Hệ vi sinh vật này có thể có hoạt động cạnh tranh với nấm men chính quy trình sản xuất

Biến đổi nguyên liệu:

Sinh học: hệ vi sinh vật có trong môi trường bị tiêu diệt

Thiết bị: thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20.

1 Thùng chứa; 2 Bơm; 3 Bộ đun nóng; 4 Bộ giữ; 5 Bộ lấy mẫu; 6 Thiết bị trao đổi nhiệt - thu hồi; 7 Thiết bị trao đổi nhiệt - thiết bị làm mát; 8 Thiết bị lên men

Hình 8 Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC – 20

Trong công nghiệp, để tiệt trùng các môi trường lỏng, người ta thường sử dụng các thiết bị tiệt trùng dạng YHC-5, YHC-20, YHC-50 với năng suất tương ứng 5, 20, 50

bị có côn để nạp lớp mỏng, đều của môi trường đã được đun nóng và bộ giữ nhiệt

Bộ giữ nhiệt: là một ống xoắn gồm nhiều ống tiện lợi cho bảo quản dài hạn trong trường hợp cần thiết cho sản xuất

Thiết bị làm mát: được sử dụng để làm lạnh môi trường dinh dưỡng tiệt trùng đến

400C và thường được sử dụng bộ trao đổi nhiệt kiểu “ống lồng ống”

Nguyên tắc làm việc của thiết bị là đun nóng nhanh môi trường đến nhiệt độ tiệt trùng 120-140oC khi cho tiếp xúc trực tiếp với hơi nước, được giữ trong bộ giữ nhiệt khoảng 15 phút và sau đó làm lạnh nhanh đến 28-300C Trước khi bắt đầu tiệt trùng môi trường dinh dưỡng cả các bộ phận của thiết bị (bộ đun nóng, bộ giữ nhiệt, bộ trao đổi nhiệt, bộ lấy mẫu và hệ thống đường ống) phải được tiệt trùng bằng hơi nước trong 4 giờ Sau khi tiệt trùng thiết bị tiến hành chế độ tiệt trùng môi trường Nối thiết bị tiệt trùng YHC-20 với nồi lên men đã nạp sơ bộ không khí tiệt trùng với áp suất 76-96kPa

Để tránh sự xuất hiện không khí trong đường ống nối nồi phản ứng với YHC thường

có van ngược chiều để điều chỉnh áp suất

Quá trình tiệt trùng môi trường dinh dưỡng được thực hiện một cách tự động theo chế

độ đã cho nhờ các dụng cụ điểu chỉnh (dụng cụ kiểm tra mức môi trường trong thùng chứa, kiểm tra tốc độ nạp môi trường vào bộ giữ nhiệt, kiểm tra áp suất môi trường do bơm đầy và áp suất môi trường khi ra khỏi bộ giữ nhiệt, kiểm tra áp suất hơi cho van chỉnh của thiết bị) Nhiệt độ môi trường trong bộ đun nóng và áp suất của môi trường khi ra khỏi bộ giữ nhiệt thông số phải điều chỉnh

Thông số công nghệ:

Nhiệt độ: 1210C