đề tài nuôi cấy tạo cây đơn bội lúa

Lời nói đầu Công nghệ sinh học là một lĩnh vực công nghệ cao dựa trên nền tảng khoa học về sự sống, kết hợp với quy trình và thiết bị kỹ thuật nhằm tạo ra các công nghệ khai thác các hoạ

ĐỀ TÀI:NUÔI CẤY TẠO CÂY ĐƠN BỘI

LÚA

Sinh viên thực hiện: Đoàn Minh Huy

Hà Văn Hoạ Nguyễn Văn Hải Trần Anh Đức

NỘI DUNG

phấn.

I Lời nói đầu

Công nghệ sinh học là một lĩnh vực công nghệ cao dựa trên nền tảng khoa học về sự sống, kết hợp với quy trình và thiết bị kỹ thuật nhằm tạo ra các công nghệ khai thác các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào thực vật

và động vât để sản xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm sinh học có chất lượng cao, phục vụ phát triển kinh

tế - xã hội và bảo vệ môi trường Vì vậy công nghệ sinh học là một ngành khoa học mũi nhọn được cả thế giới quan tâm Sự phát triển nhanh chóng của Công nghệ Sinh học tạo ra một cuộc cách mạng Sinh học trong nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, y dược, và đặc biệt là trong nông nghiệp trồng trọt Nhờ ứng dụng các biện pháp của nó chủ yếu là kĩ thuật nuôi cấy mô, dung hợp TB trần, Kĩ thuật chuyển gen, ngành công nghệ tạo giống đã tạo ra những tiến bộ vượt bậc, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn là một trong các hướng tạo nên tiến bộ vượt bậc ấy Nhờ đó chúng ta sẽ nghiên cứu về tạo giống, nuôi trồng tạo cây đơn bội về cây Lúa.

II.Giới thiêu chung về nuôi cấy đơn bội

Nuôi cấy

Cơ thế đơn bội

Abd

II.Giới thiêu chung về nuôi cấy đơn bội

Mục tiêu:

 Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen

 Tạo đột biến ở mức đơn bội

 Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ công tác giống cây trồng

Các phương pháp tạo cây đơn bội:

 - Phương pháp1: Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn

 - Phương pháp 2: Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương pháp

cơ học, hoặc do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuôi trên môi trường lỏng

Quy trình nuôi cấy tạo cây đơn bội:

Bước 1: Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn bắt đầu từ thể 4

nhân đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết

quả tốt hơn bao phấn của hoa muộn

Bước 2: Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và

trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ

đó tạo cây đơn bội

II.Giới thiêu chung về nuôi cấy đơn bội

Quy trình nuôi cấy tạo cây đơn bội

 Bước 3: Chọn môi trường tái sinh cây thích hợp: Tùy theo đối tượng nuôi cấy bao

phấn, hạt phấn mà chúng ta lựa chọn môi trường thích hợp tương ứng

 Bước 4: Điều chỉnh điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng cho tái tạo calus

hoặc nếu chọn được thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp có thể sẽ cho ra cây con trực tiếp qua phôi hoặc gián tiếp thông qua calus Cây con sau đó được chuyển qua môi trường thích hợp sẽ ra rể và lá

 Bước 5: Chọn lọc cây đơn bội:Không phải tất cả cây tái sinh khi nuôi cấy bao phấn,

hạt phấn đều là cây đơn bội vì callus và phôi lưỡng bội cũng có thể được sinh ra từ tế bào vỏ bao phấn có nhiều cách để xác định cây đơn bội như: làm tiêu bản để đếm số lượng nhiễm sắc thể, đo hàm lượng DNA trong tế bào, so sánh cây tái sinh từ bao phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình thái, kích thước

 Bước 6: Lưỡng bội hoá các thể đơn bội bằng xử lý cochicine: Các cây đơn bội thu

được sau nuôi cấy bao phấn, để có thể sử dụng được trong chọn giống thì cần lưỡng bội hoá tạo cây lưỡng bội Sơ đồ tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn Tách các bao phấn Khử trùng bề mặt Nhuộm acetoarmine để xác định GĐPT của hạt phấn Nuôi cấy trên môi trường đặc Nuôi cấy trên môi trường lỏng phát triển phôi loại bỏ chỉ nhị Cây đơn bội Hoa

Quy trình nuôi cấy tạo cây đơn bội

Ưu và nhược điểm của NCTCĐB

 1 Ưu điểm:

 • Nuôi cấy bao phấn:

 - Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng

 - Môi trường nuôi cấy đơn giản

 • Nuôi cấy hạt phấn:

 - Tạo ra giống cây trồng sạch bệnh

 - Giống tạo ra có phẩm chất di truyền đồng đều

 - Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy

 - Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền

 - Tóm lại, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ra đời đã làm giảm thời gian, đồng thời làm tăng vọt số lượng các cá thể đơn bội thu được

- Các giai đoạn phát triển của hạt phấn không đồng đều nên hiệu suất tạo cây đơn bội không cao.

- Hạt phấn là vật liệu quan trọng để gây đột biến và chuyển nạp gen, tuy nhiên nó ít được sử dụng vì làm giảm tỉ lệ tái sinh cây.

• Nuôi cấy bao phấn:

- Khó sàng lọc cây đơn bội.

- Khi nuôi cấy bao phấn thường gặp hiện tượng bạch tạng

- Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tạo cây đơn bội phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố: tuổi hạt phấn, trạng thái sinh lý của bao phấn và hạt phấn, kiểu gen, kinh nghiệm…

III Tạo cây đơn bội lúa

 Các môi trường sử dụng trong nuôi cấy túi phấn lúa:

 - Môi trường tạo mô sẹo: N6 + 2mg/l 2-4,D + 60g/l sucrose

 - Môi trường tái sinh: MS + 1mg/l BAP + 1mg/l NAA + 1mg/l kinetin + 30g/l sucrose

 - Môi trường nhân chồi: MS + 2mg/l BAP + 30g/l sucrose

 - Môi trường nhân nhanh: MS + 30g/l sucrose

 - Môi trường tạo rễ: MS + 1mg/l NAA + 30g/l sucros

 - Môi trường thích nghi: dung dịch Yoshida

III Tạo cây đơn bội lúa

 1 Thu thập vật liệu:

 Các giống lúa được trồng trên vườn ươm Thu hạt của các giống trên Các dòng lúa này được trồng trong chậu và được đặt trong vườn ươm Túi phấn được thu nhận vào ngày thứ 60 hoặc 90 sau trồng Các dòng lúa được gieo trồng cách khoảng nhau 1

tuần và tiến hành trong 5 lần để tránh các giống có thời gian chín khác nhau Mỗi dòng cần 1-2 tép có mang tược hoa thụ phấn ở giai đoạn chín

III Tạo cây đơn bội lúa

 2 Quy trình:

III Tạo cây đơn bội lúa

 2 Quy trình:

 Xử lý vật liệu (túi phấn):

 • Giai đoạn chín của cây lúa ở ngay thời điểm thích hợp cho nuôi cấy túi phấn là giai đoạn phân tử có nhân phân chia đồng nhất trước khi hạt phấn đi vào quá trình phân chia giảm nhiễm Mẫu được lấy là đoạn thân giữa lá cờ và lá đòng (2-5cm) Đoạn thân được đặt trong bao nylon và dán kín lại và giữ trong lạnh trong suốt thời gian thu thập mẫu và vận chuyển Xử lý lạnh túi phấn trước khi đưa vào nuôi cấy để tăng hiệu suất tạo mô sẹo.Trước khi xử lý, bẹ lá được tách rời khỏi thân tránh gây thương tổn hay dập đoạn thân

 • Đoạn thân được giữ trong túi nylon và dán kín lại cùng ghi chú cẩn thận Túi nylon được đặt trong bao giấy nhôm và đặt trong tối để tiến hành xử lý lạnh với ánh sáng giảm hẳn Đoạn thân xử lý ở 5oC trong 5-7 ngày trước khi nuôi cấy túi phấn

III Tạo cây đơn bội lúa

 Sự hình thành mô sẹo và tái sinh:

 • Sau khi xử lý lạnh đoạn thân có chứa túi phấn, đoạn thân được khử trùng với Natrihypoclorit 2,5 % trong 20 phút

 • Đoạn thân được lấy ra sau khi khử trùng và được rửa lại bằng nước cất vô trùng

 • Chùm hoa lúa được tách ra khỏi thân và được đặt trên đĩa petri

 • Dùng kéo được vô trùng cắt phần chân hoa lúa

 • Dùng que inox vô trùng có đầu móc vô trùng để tách túi phấn bên trong hoa lúa ra

III Tạo cây đơn bội lúa

 - Túi phấn được cấy trên môi trường N6 tạo mô sẹo Cấy khoảng 120 túi phấn trên 1 đĩa petri (100 x 15 mm) Mỗi giống cấy ít nhất 3 đĩa petri Đĩa được ghi chú cẩn thận về ngày cấy, giống, môi trường và người cấy

 • Đĩa petri được dán kín bằng parafilon Dán 2-3 lớp parafilon để tránh mất

 mát môi trường

 - Đĩa được đặt trong phòng dưỡng cây ở 270C

III Tạo cây đơn bội lúa

 - Đĩa được đặt trong phòng dưỡng cây ở 270C

 • Trong 2 tuần đầu tiên thì cứ cách 5 ngày ghi nhận số liệu về sự phát sinh mô sẹo Khi mô sẹo phát triển đến đường kính 2mm thì tách mô sẹo và cấy lên môi trường tái sinh MS Túi phấn còn lại chưa hình thành mô sẹo hay chưa đến mức tối thiểu

 ( D= 2 mm) còn lại trong đĩa petri được dán kín lại Tiếp tục theo dõi trong 3 tháng

 • Cấy 5- 10 mẫu mô sẹo trên 1 đĩa petri có chứa môi trường tái sinh MS Đĩa petri được dán kín và đặt trong phòng dưỡng cây có cường độ chiếu sáng 50-60 mol/m2/s

ở 270C có quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối

III Tạo cây đơn bội lúa

 • Cụm cấy tái sinh được tách rời từng cây riêng biệt khi cây cao 1cm và được cất trên môi trường MS Cây tái sinh được cấy chuyển sang chậu trong vườn ươm cây khi cây cao 5 cm, cây được đánh dấu

 • Duy trì cây tái sinh trong chậu có lớp nước mỏng phủ 1 mặt cho đến khi

 cây chín

 • Khi cây lúa chín, thu hạt đặt trong bao giấy và được đặt trong 1 bao kín và

 làm khô ở 40oC với độ ẩm còn lại 12% Thời gian làm khô 1-3 ngày Hạt

 khô có thể tồn trữ nhiều năm ở -200C Nếu làm khô ở 500C và kéo dài 5

 ngày thì sẽ làm mất khả năng nảy mầm của hạt

III Tạo cây đơn bội lúa

Sự hình thành mô sẹo:

 Sau 2 tuần nuôi cấy, theo dõi sự hình

thành mô sẹo cách khoảng 5 ngày ghi

ngày phát sinh mô sẹo và số lượng mô

sẹo được cấy chuyển sang môi trường

tái sinh trên mỗi giống trong vòng 90

ngày nuôi cấy Xác định tổng số túi phấn

được nuôi cấy hình thành mô sẹo trên

mỗi giống ở thời điểm 30, 60 và 90 ngày

nuôi cấy Xác định sự hình thành mô

sẹo bằng tỉ lệ túi phấn nuôi cấy phát

sinh mô sẹo

Tuổi hạt phấn

 Cây đơn bội chỉ thu được khi cấy bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn phát triển thích hợp, bắt đầu từ thể 4 nhân cho đến ngay sau lần nguyên phân đầu tiên

Trang thái sinh lí của cây cho bao phấn và hạt phấn

 Kết quả tạo cây đơn bội phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của cây bố, mẹ cho bao phấn, hạt phấn Trạng thái sinh lý lại liên quan đến điều kiện môi trường mà cây sinh trưởng như: quang chu kỳ, cường độ ánh sáng, nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng khoáng

 Khả năng thành công cao nhất với những bao phấn thu được trong lần trổ hoa đầu tiên và giảm dần trong những lần trổ hoa tiếp theo

 Sử dụng bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, ngày ngắn

sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn

IV Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tạo cây đơn bội.

Dinh dưỡng, hoocmon và các nguyên tố khác

 Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn, hạt

phấn là: MS-1962, LS-1965, B5-1968, N6-1976.

 Các Auxin ngoại sinh (IAA, NAA, IBA, 2,4 D) và cytokinin (BAP,

Kinetin, Zeatin) cần được đưa vào môi trường để thúc đẩy quá trình phát sinh phôi.

 Các nguồn chất hữu cơ không xác định như: dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, cà chua… và các axit amin, glutamin có tác động tích cực với sinh trưởng trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn.

 Than hoạt tính có tác dụng kích thích phát sinh phôi vô tính cũng như thúc đẩy sự khởi đầu của phôi từ mô bao phấn đơn bội.

 Khi sử dụng môi trường đặc cần lựa chọn thạch có độ tinh khiết cao

sẽ cho hiệu quả tạo mô sẹo và cây con cao hơn.

 Hàm lượng đường cho vào môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy.

IV Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tạo cây đơn bội.

Hiện tượng bạch tạng trong nuôi cấy bao phấn:

 Ở các đối tượng cây hai lá mầm như Datura, Atroppa, Nicotiana, Brassica khi nuôi cấy bao phấn cây đơn bội thường phát triển trực tiếp từ tiểu bào tử và ít khi xuất hiện cây bạch tạng

 Nhưng ở những đối tượng cây một lá mầm như lúa nước (Oryza), lúa mì (Triticum) cây hoàn chỉnh phát sinh thông qua giai đoạn callus thì tần số cây bị bạch tạng chiếm khá cao (20-30

% hoặc cao hơn nữa)

 Tần số cây bạch tạng phụ thuộc vào các yếu tố sau:

 - Tuổi callus cấy chuyển từ môi trường tạo mô sẹo sang môi trường tái sinh cây Càng cấy

chuyển muộn tần số bạch tạng càng cao

IV Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tạo cây đơn bội.

 - Nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ cao thường làm tăng số lượng cây bạch tạng Nghiên cứu về siêu cấu trúc tế bào lá cây bạch tạng cho thấy trong tiền lạp thể của cây bạch tạng không có ribosome, như vậy quá trình sinh tổng hợp các protein hoặc các tiểu phần protein của lạp thể này không hoàn chỉnh, dẫn đến tình trạng lạp vô sắc không phát triển thành lục lạp được.

 Cũng có giả thuyết giải thích hiện tượng bạch tạng là kết quả của hiệu ứng mẹ:

 - Hiệu ứng mẹ biểu hiện rõ ở một số đặc điểm di truyền tế bào chất Khi thụ phấn chỉ có nhân của tế bào sinh sản đực được chuyển sang tế bào noãn Vì vậy, các tính trạng di truyền tế bào chất chỉ di truyền theo đường mẹ

 Hạt phấn là tế bào chứa rất ít nguyên sinh chất, tức là số lượng ty thể và tiền lục lạp cũng rất ít Khi nuôi những tế bào này thành những cá thể thực vật hoàn chỉnh có thể xảy ra hiện tượng mất cân đối trong tương tác di truyền giữa nhân và cơ quan tử, dẫn đến sai lệch trong quá trình phát sinh cơ quan tử, đặc biệt là lục lạp

IV Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tạo cây đơn bội.

V ứng dụng của nuôi cấy tạo cây đơn bội

Đơn bội được sử dụng vì hai lý do:

• Sự có mặt của một bộ nhiễm sắc thể đơn dễ dàng cho tách dòng đột biến

– Nhị bội đồng hợp tử thu nhận được bằng cách nhị bội hóa cây đơn bội Rất có ý nghĩa trong công tác lai tạo giống

•Nghiên cứu về phôi học thực nghiệm

Chủ yếu trên các đối tượng mà phôi phát triển trực tiếp từ tiểu bào tử trong nuôi cấy bao phấn thông qua quá trình phát sinh phôi đơn tính, còn gọi là sinh sản đơn tính đực (androgensis)

V ứng dụng của nuôi cấy tạo cây đơn bội

2 Nghiên cứu về tế bào học

Cây đơn bội có thể sinh trưởng và phát triển tới giai đoạn ra hoa, nhưng bất dục.Khi nghiên cứu quá trình phân bào giảm nhiễm đầu tiên của tế bào mẹ hạt phấn cây đơn bội có thể phát hiện được mối quan hệ tương tác giữa các nhiễm sắc thể, bởi vì bộ nhiễm sắc thể đơn bội không thể giảm nhiễm bình thường được

V ứng dụng của nuôi cấy tạo cây đơn bội

3.Nghiên cứu đột biến và di truyền

Trong hệ gen (genome) của thể đơn bội không có quan hệ tính trội mà chỉ có quan hệ bổ sung giữa các gen, do đó các thể đơn bội là những nguyên liệu lý tưởng trong chọn dòng đột biến cũng như trong những nghiên cứu về mối tương tác của các gen

V ứng dụng của nuôi cấy tạo cây đơn bội

Tạo cây từ hạt phấn của các dòng lai F1

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn trên môi trường tổng hợp đã được sử dụng rộng rãi vào nhiều mục đích khác nhau Kết quả công bố gần đây trên thế giới cũng như trong nước cho thấy: phương pháp tạo cây từ hạt phấn của các dòng lai F1 không chỉ rút ngắn thời gian tạo giống mà còn đơn giản hóa quá trình chọn giống.

Nghiên cứu tạo cây từ hạt phấn của các giống thuần

Nghiên cứu đột biến, gây đột biến ở các dạng đơn bội và chọn lọc

Người ta đã chọn ra các dòng tế bào chống chịu được các chất kháng sinh, độc tố nấm và vi khuẩn gây bệnh.

Phát triển các dòng vô tính ở các loài cây thân gỗ lâu năm

Chuyển các gen ngoại lai mong muốn

Thiết lập các dòng tế bào đơn bội và nhị bội của cây hạt phấn

CÁM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN

ĐÃ LẮNG NGHE!