Vai trò của hóc môn LEPTIN trong nuôi cấy phôi trong ống nghiệm
vai trò của hócmôn leptin trong nuôi cấy phôi trong ống nghiệm Nguyễn Văn Lý Bộ môn Cấy truyền phôi 1. Đặt vấn đề Leptin là một mạch peptide gồm 167 axit amin và có trọng lợng phân tử 16 kD. Leptin là một hócmôn do mô mỡ tiết ra và do Zhang và cs phát hiện ra năm 1994. Khi mới đợc phát hiện, hócmôn leptin đợc coi là có ảnh hởng đến cân bằng năng lợng bằng cách tác động lên thần kinh trung ơng để ức chế lợng thức ăn thu nhận. Receptor của hocmôn leptin đợc tìm thấy ở no, tuyến yên, buồng trứng, nhau thai cũng nh ở mô mỡ. Leptin ảnh hởng lên trao đổi năng lợng bằng cách tăng mức tiêu thụ ôxy, tăng vận động và tăng nhiệt độ cơ thể. Leptin cũng đợc chứng minh là có nhiều vai trò trong sinh sản. Điều trị leptin có thể phục hồi sinh sản ở chuột. Leptin đợc coi là làm tăng chức năng sinh sản, thành thục sinh dục sớm ở chuột. Trong quá trình chửa của ngời, leptin đợc chứng minh là có liên quan vào điều khiển sự phát triển của thai, nhau thai và sinh tổng hợp hócmôn. ở lợn, leptin ở nhau thai nhiều thì thai phát triển bình thờng còn leptin ít thì lợn chậm phát triển. Dựa trên những phát hiện trên đây, chúng tôi giả thiết rằng leptin có thể có vai trò trong sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đ tiến hành nghiên cứu ảnh hởng của các nồng độ leptin khác nhau lên sự phát triển của phôi trong ống nghiệm. Ngoài ra chúng tôi cũng nghiên cứu ảnh hởng của mùa vụ thu phôi lên sự phát triển của phôi trong ống nghiệm. 2. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Phôi Phôi hai tế bào đợc thu ở ngày thứ 2 sau khi phối giốngbằng phơng pháp phẫu thuật 2.2. Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm Chuẩn bị môi trờng dịch ống dẫn trứng tổng hợp (mSOF) có thay đổi theo công thức của Tervit và cs (1972). Đầu tiên phôi đợc nuôi cấy trong mSOF có bổ xung axit amin không thay thế trong 48 giờ. Sau đó phôi đợc chuyển sang môi trờng mSOF có bổ xung axit amin không thay thế, axit amin thay thế và Albumin huyết thanh bò thêm 3 ngày nữa. Độ pH của môi trờng đợc điều chỉnh để đạt tới 7,4. áp xuất thẩm thấu đợc duy trì ở 270-300 mOsmol. Thành phần chi tiết của môi trờng đợc trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Thành phần môi trờng mSOF Thành phần g/100ml NaCL KCL KH 2 PO 4 MgCL 2 .H 2 O Na Lactate Glucose Penicillin Streptomicin NaHCO 3 Phenol Red Pyruvate CaCL 2 .2H 2 O Gluthamine Axit Amin không thay thế Axit Amin thay thế Albumin huyết thanh bò 5.830 0.534 0.162 0.100 0.616 0.270 0,060 0.050 2.102 0.010 0.360 2.520 1.460 1.0 ml 2.0 ml 0.8 Sau khi phân loại, hợp tử đợc rửa 3 lần trong mSOF trớc khi đặt vào đĩa nuôi cấy. Mỗi nhóm 5-10 phôi đợc nuôi cấy trong 50àl ở 4 môi trờng khác nhau (mSOF, SOF+1,0ng/ml leptin, mSOF+10,0ng/ml leptin và mSOF+100,0ng/ml leptin) và phủ dầu khoáng. Phôi đợc nuôi cấy trong tủ nuôi cấy có 5% CO 2 , 5%O 2 và 90%N 2 trong 5 ngày ở 38,8 0 C. Tất cả môi trờng đợc để cân bằng trong đĩa nuôi cấy trong 5% CO 2 , 5%O 2 và 90%N 2 trong 1 đêm trớc khi đợc đa ra dùng. 2.3. Đánh giá chất lợng phôi Sau 5 ngày nuôi cấy, phôi đợc đánh giá theo hình thái và chất lợng theo ph- ơng pháp của Lindner và Wright (1983). Phôi đợc phân loại theo giai đoạn phát triển gồm 8 tế bào, phôi dâu, phôi nang và phôi nang thoát màng 2.4. Sử lý số liệu Số liệu đợc sử lý theo chơng trình thống kê REG, Version 90.12 của Gilmour 1990. 3. Kết quả 3.1. ảnh hởng của mùa vụ thu phôi ảnh hởng của mùa thu phôi lên sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm đợc trình bày ở bảng 2 Bảng 2. ảnh hởng của mùa thu phôi lên sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm Tỷ lệ phôi phát triển đến 4 giai đoạn nuôi cấy(%) Mùa N 8 tế bào Phôi dâu Phôi nang Phôi thoát màng Mùa xuân 47 94,6 b 62,2 43,2 8,1 Mùa thu 51 96,2 a 47,1 27,5 5,9 ab: Các chữ cái khác nhau chỉ sự khác nhau có nghĩa, p<0,05 Bảng 2 cho thấy tỷ lệ phôi nuôi cấy ở mùa thu phát triển đến giai đoạn 8 tế bào cao hơn so với mùa xuân (96,1% so với 94,6%, p<0,05) nhng không có sự khác nhau về tỷ lệ phôi phát triển trong 3 giai đoạn còn lại (P>0,05). 3.2. ả nh hởng của các nồng độ leptin ảnh hởng của nồng độ lepin trong môi trờng nuôi cấy lên sự phát triển của phôi đợc trình bày ở bảng 3 và hình 1. Qua bảng 3 và hình 1 ta thấy có sự giảm nhanh chóng của phôi phát triển ở giai đoạn 8 tế bào đến giai đoạn thoát màng (từ 95,5% đến 0,8%, P<0,05). Tỷ lệ phôi phát triển đến 3 giai đoạn cao nhất (8 tế bào, phôi dâu, phôi nang) là ở môi trờng nuôi cấy có bổ xung 10ng/ml leptin. ở giai đoạn 8 tế bào, sự phát triển ở môi trờng đối chứng, 1ng/ml và 10ng/ml sai khác không có ý nghĩa (p>0,05).Tuy nhiên có sự sai khác có ý nghĩa về tỷ lệ phôi phát triển của các nhóm này và so với phôi nuôi cấy trong môi trờng có bổ xung 100ng/ml leptin (100% so với 77,8%, P<0,05).Tỷ lệ phôi phát triển đến phôi dâu cao nhất ở môi trờng có 10ng/ml leptin (77,8%), tiếp theo là nhóm đối chứng và 1ng/ml (54,5 và 55,6%, tơng ứng). Tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu thấp nhất đợc quan sát thấy ở môi trờng nuôi cấy có bổ xung 100ng/ml leptin (16,7%). Tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang cao nhất là ở môi trờng có bổ xung 10ng/ml leptin (50,0%), tiếp theo là môi trờng có bổ xung 1ng/ml leptin (44,4%). Phôi phát triển đên giai đoạn phôi nang thấp nhất ở trong môi trờng có bổ xung 100ng/ml leptin (0,7%). Tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn thoát màng không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các môi trờng nuôi cấy (p>0,05). Bảng 3. ảnh hởng của nồng độ leptin trong môi trờng nuôi cấy lên sự phát triển của phôi trong ống nghiệm Tỷ lệ phôi phát triển sau 5 ngày nuôi cấy trong ống nghiệm Xử lý N 8 tế bào Phôi dâu Phôi nang Phôi thoát màng Đối chứng 1ng/ml 10ng/ml 100ng/ml 33 19 28 18 100 a 100 a 100 a 77,8 b 54,5 b 55,6 b 71,4 b 16,7 c 27,3 c 44,4 b 50,0 a 0,7 d 15,2 a 0 b 0,1 b 0 b 4. Thảo luận Trong nghiên cứu của chúng tôi, một đặc điểm nổi bật là tỷ lệ hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang cao nhất là ở môi trờng có bổ xung 10ng/ml leptin. Tuy nhiên khi nuôi cấy trong môi trờng có bổ xung 1ng/ml leptin, không có sự khác nhau có ý nghĩa trong sự phát triển của phôi đến giai đoạn 8 tế bào và phôi dâu, nhng có sự khác nhau ở giai đoạn phôi nang so với môi trờng đối chứng. Ngợc lai, thêm 100ng/ml leptin vào môi trờng nuôi cấy dờng nh ức chế sự phát triển của phôi. Kết quả này cũng phu hợp với kết quả của Herris và McFarlane báo cáo rằng phôi chuột phát triển đến giai đoạn phôi nang trơng nở trong môi tr- ờng bổ xung 10ng/ml cao hơn 22% so với môi trờng đối chứng và cao hơn 48% so với môi trờng có bổ xung 100ng/ml leptin. Trong nghiên cứu của họ mức 100ng/ml leptin trong môi trờng cũng ức chế sự phát triển của phôi trong ống nghiệm. Một điều rất rõ là trong hệ thống chăn nuôi gia súc những con vật gầy (thể trạng cơ thể kếm) sinh sản kém hơn so với gia súc có thể trạng trung bình (Selk và cs, 1988). Vì nồng độ leptin trong huyết tơng tỷ lệ thuận với lợng mỡ của cơ thể, ngời ta giả thuyết rằng leptin có thể hoạt động nh một dấu hiệu đối với hệ thống sinh sản, nếu cơ thể có đủ một lợng mỡ cần thiết thì sẽ giúp cho gia súc chửa và có thai thành công (Hossner,1998). Tuy nhiên, đa số phụ nữ có u nang buồng trứng đều là những ngời béo phì và không rụng trứng (Holte và cs, 1994) đ gợi ý rằng leptin cũng có thể có ảnh hởng âm tính lên hệ thống sinh sản. Spicer và Franciso (1997) nhận thấy rằng leptin ở mức độ sinh lý (2-10ng/ml) đ ảnh hởng trực tiếp lên tế bào hạt tiết hócmôn Steroid. Các tác giả này gợi ý rằng nồng độ dao động bình thờng của leptin trong máu có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự liên hệ của trình trạng trao đổi chất và hệ thống sinh sản. Nhũng gợi ý đó đ đợc khẳng định bằng kết quả nghiên cứu của chúng tôi rằng nồng độ leptin ở múc sinh lý bình thờng (10ng/ml) thúc đẩy sự phát triển của phôi trong ống nghiệm, nhng ở mức cao (100ng/ml) ức chế sự phát triển của phôi trong ống nghiệm. Cơ chế thúc đẩy hay ức chế sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm cần phải đợc nghiên cứu thêm. Những thông tin về sự phát triển của phôi trong ống nghiệm không sẵn có. Một điều rõ ràng rằng những thay đổi lớn nhất mà phôi trớc khi làm tổ phải trải qua là năng lợng của chúng. Nghiên cứu in-vivo cho thấy leptin có thể điều hoà tiết insulin dẫn đến thu nhận glucose tăng, đó là một yếu tố điều hoà sự có mặt của glucose (Foster và Nagatani, 1999) và tăng trao đổi đờng dẫn đến tăng sự phát triển của phôi. Dựa trên phát hiện này, chúng tôi giả thuyết rằng nồng độ leptin ở mức sinh lý trong môi trờng nuôi cấy phôi trong ống nghiệm đ thúc đẩy sự phát triển của phôi bằng cách tăng trao đổi đờng của phôi. Cần phải nghiên cứu thêm về trao đổi đờng của phôi trong ống nghiệm để khẳng định giả thuyết này. ở môi trờng nuôi cấy không có leptin, 54,5% hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi dâu, 27,3%phát triển đến phôi nang và 15,2% phát triển đến giai đoạn thoát màng. Kết quả này thấp hơn nhiều so với kết quả đ báo cáo của Walker và cs (1989). Kết quả của họ là 85,2% hợp tử phát triển thành phôi nang và 74,1% phát triển đến giai đoạn thoát màng. Gardner và cs (1994) cũng báo cáo một tỷ lệ phôi phát triển thành phôi nang và phôi thoát màng cao hơn (71% và 60%, tơng ứng); nhng tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn 16 tế bào và phôi dâu trong kết quả của họ thấp (11% và 18% tơng ứng). Tuy nhiên, những tác giả này nuôi cấy phôi trong ống nghiệm 6 ngày chứ không phải 5 ngày nh trong thí nghẹm của chúng tôi, và đây cũng có thể là một lý do về tỷ lệ phôi nang thấp trong thí nghiệm của chúng tôi. Đ có báo cáo cho rằng thay mới môi trờng 48giờ một lần trong khi nuôi cấy phôi trong ống nghiệm là cần thiết để tránh độc hại của amoniac khi môi trờng nuôi cấy đợc bổ xung axit amin (Gardner, 1994). Tuy nhiên, thay mới môi trờng nuôi cấy có thể rất ảnh hởng đến sự phát triển của phôi do lấy đi từ môi truờng nuôi cấy các yếu tố sinh trởng, thay đổi pH và áp suất (Fukui, 1996). Có thể đây cũng là một yếu tố làm thấp tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang sau khi thay mới môi trờng trong thí nghiệm của chúng tôi. Đến bây giờ, cha có báo cáo nào nói về ảnh hởng của mùa vụ lên sự phát triển của phôi trong ống nghiệm. ở kết quả của chúng tôi, mùa vụ nuôi cấy có ảnh hởng lên sự phát triển của phôi đến giai đoạn 8 tế bào, nhng không có ảnh hởng ở các giai sau (phôi dâu, phôi nang và phôi thoát màng). Các yếu tố ảnh hởng đến sự phát triển của phôi trong cơ thể và trong ống nghiệm có thể là do dinh dỡng và yếu tố con đực. ở thí nghiệm của chúng tôi, tất cả con cho phôi đều đợc nuôi dỡng cùng điều kiện dinh dỡng. Hơn nữa, phôi thu đợc đợc nuôi cấy trong ống nghiệm cùng điều kiện. Đây là những lý do chính để vợt qua sự khác biệt về mùa vụ trong sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm. 5. Kết luận - Mùa vụ thu phôi không ảnh hởng đến sự phát triển của phôi trong ống nghiệm - Bổ sung 10ng/ml leptin vào môi trờng nuôi cấy (mSOF) làm tăng tỷ lệ phát triển của phôi trong ống nghiệm. Ngợc lai, bổ xung 100ng/ml leptin ức chế sự phát triển của phôi trong ống nghiệm, còn bổ xung 1ng/ml leptin ít ảnh hởng đến sự phát triển của phôi. Tóm tắt Phôi cừu 2 tế bào thu ở ngày thứ hai bằng phơng pháp phẫu thuật đợc nuôi cấy trong các môi trờng mSOF (đối chứng); SOF+1,0ng/ml leptin, mSOF+10,0ng/ml leptin và mSOF+100,0ng/ml leptin có phủ dầu khoáng trong tủ nuôi cấy có 5% CO 2 , 5%O 2 và 90%N 2 trong 5 ngày ở 38,8 0 C. Sau 5 ngày nuôi cấy, phôi đợc đánh giá phân loại chất lợng theo hình thái và giai đoạn phát triển. Kết quả cho thấy tỷ lệ phôi nuôi cấy ở mùa thu phát triển đến giai đoạn 8 tế bào cao hơn so với mùa xuân (96,1% so với 94,6%,p<0,05) nhng không có sự khác nhau về tỷ lệ phôi phát triển trong 3 giai đoạn còn lại (P>0,05). Tỷ lệ phôi phát triển đến 3 giai đoạn cao nhất (8 tế bào, phôi dâu, phôi nang) là ở môi trờng nuôi cấy có bổ xung 10ng/ml leptin. ở giai đoạn 8 tế bào, sự phát triển ở môi trờng đối chứng, 1ng/ml và 10ng/ml sai khác không có ý nghĩa (p>0,05).Tuy nhiên có sự sai khác có ý nghĩa về tỷ lệ phôi phát triển của các nhóm này và so với phôi nuôi cấy trong môi trờng có bổ xung 100ng/ml leptin (100% so với 77,8%, P<0,05).Tỷ lệ phôi phát triển đến phôi dâu cao nhất ở môi trờng có 10ng/ml leptin (77,8%), tiếp theo là nhóm đối chứng và 1ng/ml (54,5 và 55,6%, tơng ứng). Tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu thấp nhất đợc quan sát thấy ở môi trờng nuôi cấy có bổ xung 100ng/ml leptin (16,7%). Tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang cao nhất là ở môi tr- ờng có bổ xung 10ng/ml leptin (50,0%), tiếp theo là môi trờng có bổ xung 1ng/ml leptin (44,4%). Phôi phát triển đên giai đoạn phôi nang thấp nhất ở trong môi trờng có bổ xung 100ng/ml leptin (0,7%). Tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn thoát màng không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các môi trờng nuôi cấy (p>0,05). Có thể kết luận rằng, mùa vụ thu phôi không ảnh hởng đến sự phát triển của phôi trong ống nghiệm. Bổ xung 10ng/ml leptin vào môi trờng nuôi cấy (mSOF) làm tăng tỷ lệ phát triển của phôi trong ống nghiệm. Ngợc lai, bổ xung 100ng/ml leptin ức chế sự phát triển của phôi trong ống nghiệm, còn bổ xung 1ng/ml leptin ít ảnh hởng đến sự phát triển của phôi Abstract Ovine 2-cell embryos collected surgically were cultured in mSOF (control); mSOF+1,0ng/ml leptin, mSOF+10,0ng/ml leptin and mSOF+100,0 ng/ml leptin at 5% CO 2 , 5%O 2 and 90% N 2 in incubator for 5 days at 38,8 0 C. After 5 days culture, embryos were evaluated by the morphology and the stage of development. The results show that leptin level in culture medium affected development of embryos in-vitro. There was a dramatic decline in development of embryos in-vitro from 8- cell stage to hatched stage (from 95.5% to 0.8%, P< 0.05). The highest percentage of embryos that development to stage three (8-cell, morula and blastocyst) were found in 10ng/ml treatment group. At the 8-cell stage, the development of embryos in control, 1ng/ml and 10ng/ml treatments did not differ significantly (P>0.05). However, there was a significant difference in the proportion of embryos developing between these treatment groups and the 100ng/ml treatment (100% versus 77.8%, P<0.05). The percentage of embryos that developed to morula was highest in the 10ng/ml treatment (77.8%) followed by control and 1ng/ml treatment (54.5 and 55.6%, respectively). The lowest percentage of embryos that developed to morula was observed in 100ng/ml treatment (16.7%). The highest percentage (P<0.05) of embryos that developed to blastocyst was found in 10ng/ml treatment (50.0%) followed by 1ng/ml treatment (44.4%). The 100ng/ml treatment has the lowest percentage of embryos developed to blastocyst stage (0.7%). The hatched stage did not differ significantly among treatment groups (P>0.05). . ảnh hởng của mùa thu phôi lên sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm đợc trình bày ở bảng 2 Bảng 2. ảnh hởng của mùa thu phôi lên sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm . vai trò của hócmôn leptin trong nuôi cấy phôi trong ống nghiệm Nguyễn Văn Lý Bộ môn Cấy truyền phôi 1. Đặt vấn đề Leptin là một mạch peptide gồm 167. hởng của nồng độ leptin trong môi trờng nuôi cấy lên sự phát triển của phôi trong ống nghiệm Tỷ lệ phôi phát triển sau 5 ngày nuôi cấy trong ống nghiệm Xử lý N 8 tế bào Phôi