BÁO CÁO THỰC TẬP-ĐỀ CƯƠNG AMINO ACID

1. Phần mở đầu 1.1. Tính cấp thiết của đề tài - Nước mắm là một loại gia vò và nước chấm quen thuộc, được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực của các nước ở Châu Á. Ở Việt Nam, nước mắm là một phần không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày của hầu hết mọi gia đình. - Tuỳ theo từng vùng khác nhau, nước mắm sẽ được chế biến và mang những hương vò đặc trưng riêng cho từng vùng miền. Như ở Phú Quốc, nước mắm được chế biến từ cá cơm, tại Phan Thiết thì nước mắm được chế biến từ cá nục hoặc tại đồn bằng sông Cửu Long thì nước mắm từ cá linh, ở một số thì nước mắm còn được làm từ con cà cuống. Một số thương hiệu nước mắm nổi tiếng ở Việt Nam như: nước mắm Phú Quốc, nước mắm Phan Thiết, nước mắm Nha Trang… - Trong nước mắm thành phần chủ yếu và quyết đònh đến chất lượng. giá trò dinh dưỡng đó chính là các acid amin như Lysine, Valine, Glutamic, Arginine, Methionine, Tyrosine, PhenylAlanine, Threonine, Leucine, IsoLeucine… - Hiện nay để đánh giá chất lượng và giá thành của nước mắm, chúng ta vẫn đang dựa vào tiêu chuẩn xác đònh độ đạm tổng của nước mắm bằng phương pháp Kjiehdahl rồi quy ra hàm lượng đạm amin. Phương pháp này có khuyết điểm là không thể phân biệt được các loại hợp chất có chứa đạm dinh dưỡng và các hợp chất chứa đạm không dinh dưỡng. Một số cơ sở sản xuất đã lợi dụng vào tiêu chuẩn trên, làm tăng độ đạm bằng cách thêm urê vào nước mắm để làm giảm giá thành sản xuất, điều đó gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng. - Trước thực trạng trên, tôi thực hiện đề tài này nhằm xây dựng được phương pháp xác đònh acid amin trong nước mắm(cụ thể là nhóm acid amin không thay thế) bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần (LC/MS/MS) để làm cơ sở cho phương pháp xác đònh chất lượng nước mắm bằng các chỉ tiêu về acid amin. 1.2. Tổng quan 1.2.1. Tồng quan về nước mắm 1.2.1.1. Giới thiệu về nước mắm Nước mắm là hỗn hợp muối các acid amin được thủy phân từ protein trong thòt cá với tác nhân là hệ enzyme có sẵn trong nội tạng cá cùng với một số vi khuẩn kỵ khí. Tại Việt Nam, các vùng miền biển đều có làm nước mắm và có một số thương hiệu nước mắm nổi tiếng tại Việt Nam như nước mắm Phú Quốc, nước mắm Phan Thiết, nước mắm Nha Trang… Các loại cá biển dùng để làm nước mắm là cá cơm, cá nục, cá linh. Tuỳ theo độ đạm trong nước mắm mà người ta phân loại nước mắm thành các cấp độ: nước mắm đặc biệt (khoảng 40 0 đạm), nước mắm thượng hạng(35 0 đạm), hạng 1(30 0 đạm), hạng 2(25 0 đạm), hạng 3(dưới 20 0 đạm). 1.2.1.2. Thành phần của nước mắm - Các chất đạm: chiếm chủ yếu và là thành phần quyết đònh giá trò của nước mắm. Các chất đạm được phân thành 3 loại: + Đạm tổng: Là tổng số Nitơ có trong nước mắm (g/L), dùng để phân hạng nước mắm + Đạm amin: Là tổng lượng đạm nằm dưới dạng acid amin (g/L), quyết đònh giá trò nước mắm + Đạm amoni: Lượng đạm này có trong nước mắm càng nhiều thì nước mắm càng kém chất lượng. Ngoài các chất đạm trên, trong nước mắm còn có các loại đạm khác như dipeptide, tripeptide, peptone Đây là những thành phần trung gian làm cho nước mắm dễ bò hư hỏng do hoạt động của vi sinh vật. - Các hợp chất bay hơi: gồm nhiều nhóm và quyết đònh đến hương vò nước mắm Hàm lượng một số chất bay hơi có trong nước mắm (mg/100g nước mắm): + Các hợp chất carbonyl bay hơi: 407 – 512 (VD: Formaldehyde) + Các acid bay hơi: 404 – 533 ( acid propionic) + Các amin bay hơi: 9,5 - 11,3 (isopropylamine) - Các chất vô cơ: NaCl chiếm nhiều nhất(250 – 280 g/L) và một số chất khoáng khác như Ca, Mg, S, P, I. - Các vitamin: B1. B2. B12. PP 1.2.1.3. Các hệ enzym trong sản xuất nước mắm: Gồm 3 hệ lớn: - Hệ Metalo-protease( hay còn gọi là Aminodipeptidase): Hệ enzyme này có trong nội tạng cá, chòu được nồng độ muối cao, hoạt động mạnh trong thời gian đầu lên men nước mắm, giảm dần ở tháng thứ 3 về sau. Hệ enzyme có hoạt tính mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các nhóm peptide khác nhau. Nhóm enzyme này là nhóm enzyme trung tính, pH opt = 5-7, pI = 4-5, ổn đònh với ion Ca 2+ và Mg 2+ và mất hoạt tính khi có các ion Zn 2+ , Pb 2+ , Hg 2+ . - Hệ enzyme serine – protease: Điển hình là enzyme trypsine, có nhiều trong nội tạng cá. Ở giai đoạn đầu, hệ enzyme này hoạt động yếu, tới tháng thứ 2 hoạt động mạnh tới cực đại, và tới tháng thứ 3 bắt đầu giảm dần khi protein trong nước mắm phân giải gần như hoàn toàn. Hệ enzyme này hoạt động ở pH = 5-10, pH opr = 9 - Hệ enzyme acid – protease: Có trong nội tạng cá. Hệ enzyme này dễ bò ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên chỉ hoạt động trong thời gian đầu của quá trình thủy phân. Hệ này chỉ đóng vai trò thứ yếu trong quá trình sản xuất nước mắm. 1.2.1.4. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng nước mắm Hiện nay các nhà sản xuất nước mắm tại Viện Nam đều áp dụng tiêu chuẩn TCVN 5107:2003 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn của Bộ Khoa Học và Công nghệ ban hành. Tiêu chuẩn này có các quy đònh về hoá học như hàm lượng nitơ tổng, hàm lượng nitơ amin, hàm lượng muối… Các chỉ tiêu về vi sinh như tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc E.coli, Coliform… 1.2.2. Tổng quan về Acid Amin [1] 1.2.2.1 Giới thiêụ chung về acid amin: - Acid amin là 1 loai hợp chất hữu cơ có chứa nhóm amino -NH 2 và nhóm cacboxyl – COOH trong phân tử. -Tuỳ theo vò trí cuả nhóm -NH 2 so với –COOH mà có các α ,β… acid amin. - Các α- acid amin là đơn vò cơ sở câú tạo nên cấu trúc cuả protein của cơ thể sống. Công thức cấu tạo tổng quát cuả α-acid amin là: - R-CH-COOH NH 2 Protein có trên 20 loại acid amin khác nhau tham gia vào cấu trúc của nó, các acid amin chỉ khác nhau ở gốc R. Các tính chất lý học như khả năng tan trong nước , hoạt động hóa học, khả năng tạo liên kết hiđro của acid amin cũng phụ thuộc vào bản chất hóa học của gốc R đó. 1.2.2.2. Phân loại các acid amin: - Dựa vào đặc tính mạch bên ngoài , ngươì ta phân chia các acid amin thường gặp thành 1 số nhóm chính sau: • Nhóm 1: Acid amin mạch thẳng : 1.1: Acid monoaminmonocacboxylic: Tên gọi Công thức câú tạo Kí hiệu viết tắt Glycine CH 2 H 2 N COOH Gly Alanine COOH CHH 2 N CH3 Ala Leucine COOH CHH 2 N CH 2 CH CH 3 CH 3 Leu Isoleucine COOH CHH 2 N CH C 2 H 5 CH 3 Ile Valine COOH CHH 2 N CH CH 3 CH 3 Valin Serine HC COOH NH 2 CH 2 OH Ser Threonine CHHC COOH NH 2 OH CH 3 Thr 1.2: Acid monoamindicacboxylic Tên gọi Công thức cấu tạo Kí kiệu viết tắt Aspartic acid HC COOH NH 2 CH 2 COOH Asp Glutamic acid CH 2 HC COOH NH 2 CH 2 COOH Glu 1.3:Acid điaminmonocacboxylic Tên gọi Công thức cấu tạo Kí hiệu viết tắt Lysine HC COOH NH 2 (CH 2 ) 4 NH 2 Lys Arginine HC COOH NH 2 (CH 2 ) 3 N C NH NH 2 H Arg 1.4: Acid amin chứa S Tên gọi Công thức cấu taọ Kí hiệu viết tắt Cysteine HC COOH NH 2 CH 2 SH Cys Cystine HC COOH NH 2 CH 2 S CH CH 2 S HOOC H 2 N Methionine HC COOH NH 2 CH 2 S CH 3 Met • Nhóm2: Acid amin vòng thơm: Tên gọi Công thức câú taọ Kí hiêụ viết tắt Phenylalanine HC COOH NH 2 CH 2 Phe Tyrosine HC COOH NH 2 CH 2 OH Tyr • Nhóm3: Acid amin dò vòng: Tên gọi Công thức câú tạo Kí hiệu viết tắt Tryptophane N H CH 2 CH COOH NH 2 Trp Histidine N HN CH 2 CH COOH NH 2 His Proline HN HOOC Pro • Nhóm 4: Amit của acid amin Tên gọi Công thức cấu taọ Kí hiệu viết tắt Asparagine HC COOH NH 2 CH 2 C NH 2 O Asn glutamine HC COOH NH 2 CH 2 C NH 2 O CH 2 Gln - Ngoài ra người ta còn phân loại các acid amin theo quan điểm dinh dưỡng thành 2 nhóm: + Nhóm các acid amin không thay thế (cơ thể người không tự tổng hợp được): Valine, Methionine, Lysine, leucine, Isoleucine, Tryptophane, Threonine, Phenylalanine. Ngoài ra ở trẻ em thêm 2 acid amin là: Histidine và Arginine. + Nhóm các acid amin có thể thay thế: Alanine, Glycine, Glutamic Acid, Aspartic acid, Tyrosine, Asparagine, Cysteine, Cystine, Serine, Proline. 1.2.2.3. Các tính chất chung cuả các Acid Amin: a. Tính tan: Bảng tính tan cuả các acid amin trong nước ở 25 o C Acid amin S(g/l) Acid amin S(g/l) Alanine 167.2 Leucine 21.7 Arginine 855.6 Lysine 739.0 Asparagine 28.5 Methionine 56.2 Aspartic acid 5.0 Phenylalanine 27.6 Cysteine - Proline 1620.0 Glutamine 7.2(37 o C) Serine 422.0 Glutamic acid 8.5 Threonine 13.2 Glycine 249.9 Tryptophan 13.6 Histidine - Tyrosine 0.4 Isoleucine 34.5 Valine 58.1 b. Tính phân cực: -Tính phân cực của acid amin trung hòa điện nằm giữa tính phân cực cuả acid amin không tan trong nước và tính phân cực cuả acid amin mang điện. -Tính phân cực của Ser vàThr là do nhóm –OH trong phân tử có khả năng tạo liên kết hiđro liên phân tử với nứơc. -Tyr có chứa 1 nhóm –OH phenol có khả năng ion hóa .Nó ion hoá trong môi trường kiềm yếu, vì thế Tyr cũng được coi là 1 acid amin phân cực.Tuy nhiên dựa vào khã năng tan trong nước của Tyr tại pH trung tính thì nó được xem như là acid amin không tan trong nước. - Các acid amin không phân cực như: Gly, Ala, Val, Leu, Ileu, Pro, Trp, Met, Tyr, Phe - Các acid amin phân cực trong nước như: Thr, Glu, His, Ser, Asp, Gln, Lys, Arg, Cys, Asn c. Tính quang hoạt: - Trừ Gly , các α-C củả các acid amin còn lạiđều là C bất đối. Nghóa lànó liên kết với 4 nhóm khác nhau.Vì trung tâm bất đối này nên các acid amin này có tính quang hoạt, chúng làm xoay mặt phẳng đường đi của ánh sáng phân cực.Ngoài Cα bất đối thì Cβ của Ile và Thr cũng bất đối.Vì thế Ile, Met có thể tồn tại 4 đồng phân quang học. - Tất cả các protein được tìm thấytrong tự nhiên là L-acid amin. COOH HOOC H C NH 2 NH 2 C H R R D-acid amin L-acid amin Cách gọi tên khoa học này dựa trên sự sắp xếp D, L của Glyxeranđehit và không dựa trên nguyên tắc làm xoay mặt phẳng đường đi ánh sáng phân cực . Có nghóa là: L- cáchsắp xếp này không liên quan tới việc làm xoay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang trái như trong trường hợp của L- Glycalaldehyde. Mặc dù vậy nhưng hầu hếtcác L-acid amin đều làm xoay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang trái 1.2.2.4. Vai trò của acid amin Các Acid amin là đơn vò cơ bản tạo nên các protein trong cơ thể sống, nói cách khác các acid amin là các “viên gạch” tạo nên các phân tử protein. Trong các loại acid amin thì acid amin thay thế cơ thể có thể tự tổng hợp khi không được cung cấp đủ khẩu phần thức ăn. Còn các loại acid amin không thay thế thì cơ thể không thể tự sinh tổng hợp được mà phải bắt buộc bổ sung từ khẩu phần ăn hàng ngày. Các acid amin không thay thế giúp kích thích cơ thể phát triển. Nếu thiếu 1 trong các loại acid amin không thay thế có thể dẫn đến một số bệnh nguy hiểm . Vd: Thiếu Lysine: cơ thể sẽ hấp thu Canxi không tốt làm xương mau chóng bò thoái hoá. Thiếu Methionine: Ở nam giới sẽ thiếu hormone sinh dục testosterone. Thiếu Leucine: Việc điều hoà hàm lượng đường trong máu sẽ bò rối loạn. 1.2.3 Tổng quan về các phương pháp phân tích acid amin 1.2.3.1. Phương pháp sắc ký giấy. Phương pháp sắc ký giấy nhuộm màu với thuốc thử Ninhydrin dùng để đònh tính, và bán đònh lượng các acid amin từ dòch thủy phân protein. Đây là phương pháp cổ điển dùng trong kiểm nghiệm thực phẩm. Hệ dung môi phân tách thường được sử dụng là : Phenol:H 2 O, hoặc n-butanol:acetic acid: H 2 O. Tùy theo hệ dung môi các acid amin có thứ tự và giá trò R f khác nhau. [...]... thử dùng để phân tách acid amin thường dùng: Ninhydrin, 2,4 – dinitrophenyl (DNP), 5 – dimethylaminonaphthalene – 1 – sulfonyl (dansyl)… Một số dung môi dùng để phân tách acid amin: - Acetone:H2O:Acetic acid: Formic Acid - Ethanol:H2O:dimethylamine - Chloroform:Methanol - n – butanol:acetic acid: H2O 1.2.3.3 Phương pháp sắc ký khí (GC) Phương pháp sắc ký khí là một kỹ thuật phân tích acid amin có rất nhiều... liệu tham khảo 7 Dự kiến đòa điểm và thời gian thực hiện Đòa điểm thực hiện đề tài: Labo HPLC, Trung Tâm Kiểm Nghiệm An Toàn và Vệ Sinh thực phẩm khu vực phía Nam, Viện Vệ Sinh Y Tế Công Cộng Tp.Hồ Chí Minh Thời gian dự kiến: tháng 1/2011 – 6/2011 Tài liệu tham khảo Tiếng Anh: 1 Pravin Bhandare, P Madhavan, B.M Rao,N Someswar Rao, Determination of amino acid without derivatization by using HPLC - HILIC... - Trifluoroacetic acid, Merck, AR grade - K4[Fe(CN)6].3H2O, Merck, AR grade - ZnSO4 7H2O, Merck, AR grade - NaHCO3, Merck, AR grade - Nước cất 2 lần 5.3 Phương thức nghiên cứu Khảo sát các quy trình chiết acid amin trong nước mắm Chọn lựa các điều kiện sắc ký Chọn lựa các điều kiện khối phổ Thẩm đònh quy trình đònh lượng acid amin trong nước mắm 5.3.1 Khảo sát các quy trình chiết acid amin trong nước... 3 Bjưrn Thiele & Kerstin Füllner & Nadine Stein & Marco Oldiges & Arnd J Kuhn & Diana Hofmann, Analysis of amino acids without derivatization in barley extracts by LC-MS-MS, 2008, Anal Bioanal Chem 391, p 2663–2672 4 Helena Zahradníčková, Petr Hušek and Petr Šimek , Quantification of free amino acids in natural waters using SPE and derivatization with chloroformates, 2005, Masaryk University, Faculty... lượng acid amin bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ làm tăng độ nhạy của giới hạn phát hiện, đònh danh chính xác các hợp chất acid amin và rút ngắn thời gian phân tích so với việc phân tích các acid amin bằng các phương pháp khác 3 Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng được quy trình đònh lượng các acid amin không thay thế trong nước mắm bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần (LC/MS/MS): + Đưa ra được khoảng... pháp xử lý, tách chiết acid amin trong nền mẫu, xác đònh các thông số tối ưu Bước 2: Khảo sát các thông số sắc ký lỏng và xác đònh các thông số tối ưu Bước 3: Khảo sát các thông số trên khối phổ và xác đònh các thông số tối ưu Bước 4: Thẩm đònh quy trình đònh lượng các acid amin bằng các phương pháp thống kê Bước 5: Kết quả và bàn luận Bước 6: Kết luận Chương 5: Phương pháp thực hiện 5.1 Nguyên liệu... bàn luận Bước 6: Kết luận Chương 5: Phương pháp thực hiện 5.1 Nguyên liệu 5.1.1 Chất chuẩn Các loại acid amin Hãng sản xuất Mã số Nồng độ Fluka l-alanine 89,09 AAS18 µmol/ml (±4%) 109K8709 2,50 ammonium cloride 53,49 2,50 l-arginine 174,2 2,50 l-aspartic acid 133,1 2,50 l-cystine 240,3 1,25 l-glutaminc acid 147,1 2,50 glycine 75,07 2,50 l-histidine 155,2 2,50 l-isoleucine 131,2 2,50 l-leucine 131,2 2,50... thực phẩm thấp, nguyên nhân là vì chưa loại bỏ việc tương tác nền của mẫu thực phẩm Ví dụ như Cystine(Cys) nhiều lúc không phát hiện được khi tạo dẫn xuất với OPA Trong khi đó với PITC thì độ tái lập và độ tuyến tính thấp - Tạo dẫn xuất hậu cột(Post – column): Tạo dẫn xuất và phân tích bằng cột trao đổi ion Chất tạo dẫn xuất thường dùng là ninhydrin, OPA Phương pháp này rất thích hợp cho các mẫu thực. .. điểm của phương pháp này là sự phức tạp của quá trình tạo dẫn xuất sau cột, và thời gian phân tích trên máy dài ( 1- 2h) , và nồng độ acid amin trong dòch phân tích phải lớn (LOD = 10 – 50 pmol/mL cho mỗi acid amin) Hiện nay có một phương pháp được áp dụng để phân tích các acid amin là phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phố một lần hoặc nhiều lần ( LC/MS, LC/MS n) Phương pháp này có các ưu điểm: độ nhạy... phổ khối lượng đặc trưng của từng acid amin Khuyết điểm của phương pháp này là giá thành thiết bò cao, và nồng độ mẫu phân tích phải rất nhỏ 2 Luận điểm mới của đề tài - Hiện nay ở Việt Nam chưa có những nghiên cứu hoặc có quy trình đònh lượng acid amin trong nền mẫu nước mắm từ đó làm cơ sở để đưa ra chỉ tiêu mới cho chất lượng của nước mắm - Phương pháp đònh lượng acid amin bằng sắc ký lỏng ghép khối . sức khỏe người tiêu dùng. - Trước thực trạng trên, tôi thực hiện đề tài này nhằm xây dựng được phương pháp xác đònh acid amin trong nước mắm(cụ thể là nhóm acid amin không thay thế) bằng phương. lạc E.coli, Coliform… 1.2.2. Tổng quan về Acid Amin [1] 1.2.2.1 Giới thiêụ chung về acid amin: - Acid amin là 1 loai hợp chất hữu cơ có chứa nhóm amino -NH 2 và nhóm cacboxyl – COOH trong. ,β… acid amin. - Các α- acid amin là đơn vò cơ sở câú tạo nên cấu trúc cuả protein của cơ thể sống. Công thức cấu tạo tổng quát cuả α -acid amin là: - R-CH-COOH NH 2 Protein có trên 20 loại acid