Đa hình một số ứng cử gen liên kết với khả năng sinh sản của lợn móng cái và yorkshire

ĐA HÌNH MỘT SỐ ỨNG CỬ GEN LIÊN KẾT VỚI KHẢ NĂNG SINH SẢN CỦA LỢN MÓNG CÁI VÀ YORKSHIRE Tr n Xuân Hoàn, Phạm Thị Phương Mai, Tr n Xuân Toàn Nguyễn Thị Quỳnh Châu, Giang Thị Thanh Nhàn, L

ĐA HÌNH MỘT SỐ ỨNG CỬ GEN LIÊN KẾT VỚI KHẢ NĂNG

SINH SẢN CỦA LỢN MÓNG CÁI VÀ YORKSHIRE

Tr n Xuân Hoàn, Phạm Thị Phương Mai, Tr n Xuân Toàn

Nguyễn Thị Quỳnh Châu, Giang Thị Thanh Nhàn, Lương Nhân Tuấn

Phòng thí nghiệm trọng ñiểm công nghệ tế bào ñộng vật

TÓM TẮT

Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP phân tích ña hình các gen ESR, properdin, RNF4

và FUT1 của lợn nái Móng Cái và Yorkshire cho thấy tính ña hình các gen ở hai giống lợn khác nhau Lợn Móng Cái có tần số alen B gen ESR cao hơn lợn Yorkshire Lợn Móng Cái và Yorkshire ñều có tần số alen B gen properdin cao hơn alen A Lợn Yorkshire có tần số alen C gen RNF4 cao hơn lợn Móng Cái Gen FUT1 chỉ có tính

ña hình ở lợn Yorkshire Trong quần thể lợn Móng Cái không phát hiện ñược ña hình gen FUT1 Bước ñầu phát hiện số con sơ sinh sống lứa 1 của lợn nái mang kiểu gen RNF4-CC cao hơn ñáng kể so với lợn mang kiểu gen RNF4-TT trong cả hai giống lợn

1 Đặt vấn ñề

Các tính trạng sinh sản luôn ñược chú ý trước tiên trong chăn nuôi, bởi chúng ñóng vai trò chính trong nâng cao hiệu quả chăn nuôi Nâng cao các tính trạng sinh sản của lợn bằng chọn lọc giống truyền thống là khó do khả năng di truyền về các tính trạng này thấp Giải pháp chọn lọc theo gen dựa vào tính ña hình trong những gen ứng cử tạo ra sự sai khác kiểu hình về sinh lý-sinh hoá có thể thúc ñẩy nhanh khả năng nâng cao các tính trạng sinh sản của lợn

Các hormon nhóm steroid và các thụ thể của chúng ñóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh sản Estrogen liên quan mật thiết với quá trình mang thai và chức năng hoạt ñộng của nó thông qua (ER estrogen receptor) thụ thể (Rothschild và cs, 1996)

RNF4 (The ring finger protein 4 gene ) ñóng vai trò phát triển tế bào mầm của bào thai trong trứng cũng như qúa trình chín của tế bào granulosa ( Hirvonen-Santti và

cs, 2004 )

Properdin có chức năng sinh lý quan trọng trong sinh sản như phát triển biểu

mô của tử cung (Hasty và cs, 1993)

Hoạt tính FUT1 (alpha-1,2fucosyltransferase) liên quan với lượng estrogen và progesteron (Domino và cs, 2001)

Chính vì vậy các gen ESR, properdin, RNF4, FUT1 ñược chọn lọc như là ứng

cử gen về số con sơ sinh của lợn Phân tích ña hình các gen này có mối liên kết với số con sơ sinh sống của lợn ñã ñược nghiên cứu trong một số công trình

Rothschild và cs (1996) phân tích ña hình gen ESR của lợn cho biết có alen ñặc trưng liên quan với số con sơ sinh Short và cs (1997) nghiên cứu ảnh hưởng của các locut gen ESR ñến tính trạng sinh sản và sản xuất của các dòng lợn thương phẩm cho biết có mối liên quan của t ng số con sơ sinh sống với các alen có lợi của gen ESR Goliasova và Wolf (2004) phân tích ña hình gen ESR của lợn cho thấy locut gen ESR ảnh hưởng ñáng kể ñến số con sơ sinh ở lứa 1 và trung bình của các lứa Horogh và cs (2005) phân tích các kiểu gen ESR cho thấy lợn mang kiểu gen BB có

số con sơ sinh sống vượt trội so với lợn mang kiểu gen AB và AA ở lứa ñầu và các lứa tiếp theo Wu và cs (2006) nghiên cứu mối liên quan của gen ESR với các tính trạng sinh sản của lợn Landrace cho thấy lợn nái mang kiểu gen BB có số con sơ sinh sống t ng số là cao nhất

Buske và cs (2005) phân tích mối liên quan của các kiểu gen properdin vơi số con sơ sinh của quần thể lợn thương phẩm cho thấy lợn mang kiểu gen BB có t ng số con sơ sinh và số con sơ sinh sống cao hơn so với lợn mang kiểu gen AA

Horak và cs (2005) phân tích các kiểu gen FUT1 và ESR cho thấy lợn nái mang kiểu FUT1 A / FUT1 A có số con sơ sinh thấp nhất

Niu và cs (2008) phân tích ña hình gen RNF4 trong quần thể lợn nái cho thấy lợn mang kiểu gen CC có số con sơ sinh sống cao hơn ñáng kế so với lợn mang kiểu gen TT

Qua các kết quả trên cho thấy ña hình gen có mối liên kết với khả năng sinh sản của lợn, do vậy chúng tôi tiến hành phân tích ña hình một số ứng cử gen có khả năng liên kết với số con sơ sinh sống

2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Lợn Móng Cái nuôi ở trại giống Tràng Duệ, công ty c phần ñàu tư PT Nông nghiệp Hải Phòng

Lợn Yorkshire nuôi ở trung tâm nghiên cứu lợn Thuỵ Phương

2.2 Phương pháp lấy mẫu

Dùng kìm bấm mẫu mô tai của các giống lợn, bảo quản trong ethanol tuyệt ñối Mẫu ñược bảo quản ở -20 0 C và sau ñó ñược sử dụng ñể tách chiết ADN

2.3 Phương pháp tách chiết ADN

Từ mỗi mẫu mô lấy khoảng 30 mg ñể tiến hành tách ADN Tách chiết ADN ñược thực hiện theo kít AccuPrep ® Genomic DNA Extraction Kit của hãng Bioneer 2.4 Nhân ADN ñặc hiệu

Sử dụng cặp mồi do Short và cs (1997) thiết kế có trình tự như sau ñể nhân ñoạn gen ESR

Mồi xuôi : 5’-CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG-3’

Mồi ngược : 5’-CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG-3’

Chu trình nhi t : Sau khi bi n tính ở 94 o C thực hiện phản ứng 35 chu kỳ như

sau:

94 o C 1’ , 55 o C 1’, 72 o C 1’ Sau ñó kết thúc ở 72 o C trong 8’

Sử dụng cặp mồi do Buske và cs (2005) thiết kế có trình tự như sau ñể nhân

ñoạn gen properdin

Mồi xuôi : 5’-ACT GCT ATG ACG GTT ACA CTC TCC G-3’

Mồi ngược : 5’-TCC AAG AGC CAC CTT CCT GG-3’

Chu trình nhiệt : Sau khi biến tính ở 94 o C thực hiện phản ứng 35 chu kỳ như

sau:

94 o C 30 s , 55 o C 30 s, 72 o C 50 s Sau ñó kết thúc ở 72 o C trong 5’

Sử dụng cặp mồi do Niu và cs (2008) thiết kế có trình tự như sau ñể nhân ñoạn

gen RNF4

Mồi xuôi : 5’-CGAAATGCCAGGGAAGAG-3’ Mồi ngược : 5’- CCATGCAGATCGGACAACT-3’

Chu trình nhiệt : Sau khi biến tính ở 94 o C thực hiện phản ứng 35 chu kỳ như

sau:

94 o C 45 s , 50 o C 45 s, 72 o C 2’ Sau ñó kết thúc ở 72 o C trong 10’

Sử dụng cặp mồi do Meijerink và cs (1997) thiết kế có trình tự như sau ñể

nhân ñoạn gen FUT1

Mồi xuôi : 5’-CTGCCTGAACGTCTATCAAGATC-3’

Mồi ngược : 5’-CTTCAGCCAGGGCTCCTTTAAG-3’

Chu trình nhiệt : Sau khi biến tính ở 95 o C thực hiện phản ứng 35 chu kỳ như

sau:

95 o C 30 s , 56 o C 30 s, 72 o C 30 s Sau ñó kết thúc ở 72 o C trong 7’

2.5 Phân tích ña hình gen

Sản ph ẩm PCR của cặp mồi ESR, Properdin, RNF4 và FUT1cắt bằng các

enzym tương ứng PvuII, SmaI, SacII và CfoI Sản ph ẩm PCR của cặp mồi sau khi cắt

bằng enzym giới hạn, phân lập ñộ dài các ñoạn ADN bằng cách chạy ñiện di trên

thạch agarose 1,5% - 4% với ñiện thế 65V trong 60 phút trong hệ ñệm 1x TBE,

nhuộm bằng Ethidium bromide và soi chụp dưới ñèn UV Xác ñịnh kiểu gen cho từng

cá thể dựa vào kết quả ñiện di

2.6 Phân tích và xử lý số liệu

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Kết quả nhân ADN ñặc hiệu

Sản phẩm nhân ADN từ các cặp mồi ñều thu ñược một băng, có kích thước

tương ứng như sau: gen ESR 120 bp; gen properdin 390 bp; gen RNF4 937 bp; gen

FUT1 421 bp phù hợp với kết quả của các tác giả Short và cs (1997), Buske và cs

(2005), Niu và cs (2008) và Meijerink và cs (1997), cho thấy phản ứng PCR là ñặc

hình 1

Qua hình 1 cho thấy sản phẩm nhân ADN ñặc hiệu hoàn toàn phù hợp ñể phân

tích ña hình bằng enzym giới hạn

1 2 3 4 5 6 7 8

Hình 1 Phổ ñiện di các ñoạn gen ñược nhân ñặc hiệu 1-5: marker 100 bp; 2-3: ñoạn gen properdin ; 4: ñoạn gen RNF4; 6-7: ñoạn gen

ESR; 8: ñoạn gen FUT1 3.2 Đa hình gen ESR

Phân tích ña hình ñoạn gen ESR bằng PvuII có thể thu ñược ba kiểu gen tương

ứng là: Kiểu AA có một băng tương ứng 120 bp Kiểu AB có 3 băng tương ứng là

120 bp, 65 bp và 55 bp Kiểu BB có 2 băng tương ứng là 65 bp và 55 bp Các kiểu

gen ESR, ñược phân biệt bằng ñiện di Kết quả ph ñiện di ñược thể hiện trong hình

2

1 2 3 4 5 6 7 8

Hình 2 Phổ ñiện di phân tích ña hình gen ESR bằng PvuII

1: Marker 100 bp; 1-6: Kiểu gen AB; 7: Kiểu gen BB; 8 Kiểu gen AA

Trên hình 2 cho thấy thu ñược cả ba kiểu gen AA, AB và BB Tuy nhiên tỷ lệ các kiểu gen trong mỗi giống lợn là khác nhau.Tỷ lệ các kiểu gen và tần số alen của gen ESR ở 2 giống lợn ñược trình bày trong bảng 1 Qua bảng 1 cho thấy lợn Móng Cái chủ yếu mang kiểu gen BB, trong khi ñó lợn Yorkshire có kiểu gen BB chiếm tỷ

lệ thấp nhất Theo kết quả nghiên cứu của Horak và cs (2004) trên lợn nái ñịa phương của cộng hoà Sec thì lợn mang alen A chiếm tỷ lệ cao hơn so với lợn mang alen B Kết quả phân tích của Horogh và cs (2004) trên lợn nái Đại Bạch ở Hungary cho thấy lợn mang kiểu gen BB chiếm tỷ lệ thấp nhất Tuy nhiên theo kết quả nghiên cứu của Short và cs (1997) trên lợn nái của các giống lợn khác nhau cho thấy tần số alen B tăng dần từ 0,51 ở lợn nái lứa 1 ñến 0,57 ở lợn nái các lứa tiếp theo

ảng 1 Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen gen ESR

Alen B có mối liên quan ñến số con sơ sinh sống của lợn nái ñã ñược khẳng ñịnh trong nghiên cứu của Rothschild và cs (1996), Short và cs (1997), Goliasova và

cs (2004), Horak và cs (2005) và Wu và cs (2006) Đây có thể là nguyên nhân dẫn ñến sự sai khác về tần số alen của gen ESR trong hai giống lợn

3.3 Đa hình gen properdin

Phân tích ña hình ñoạn gen properdin bằng SmaI có thể thu ñược ba kiểu gen tương ứng là: Kiểu AA có hai băng tương ứng 237 bp và 153 bp Kiểu AB có 3 băng tương ứng là 390 bp, 237 bp và 153 bp Kiểu BB có một băng tương ứng là 390 bp Các kiểu gen properdin, ñược phân biệt bằng ñiện di Kết quả phổ ñiện di ñược thể hiện trong hình 3

1 2 3 4 5 6 7 8

3 Phổ ñiện di phân tích ña hình gen properdin bằng SmaI

1
 : Kiểu gen BB; 3: Kiểu gen AA; 7: Kiểu gen AB; 8: Marker 100 bp

Trên hình 3 cho thấy cả 3 kiểu gen AA, AB, và BB ñều xuất hiện Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen của gen properdin trong 2 giống lợn ñược thể hiện ở bảng 2 Qua bảng 2 cho thấy ở cả hai giống lợn kiểu gen AA ñều chiếm tỷ lệ thấp nhất Lợn Yorkshire mang kiểu gen BB chiếm tỷ lệ cao nhất, nhưng lợn Móng cái mang kiểu gen BB tương ñương kiểu gen AB Kết quả nghiên cứu của Buske và cs (2006) trên lợn nái của Đức cho thấy ở nhóm lợn có khả năng sinh sản tốt chủ yếu mang kiểu gen

BB, không có kiểu gen AA, nhưng ở nhóm lợn sinh sản thấp xuất hiện cả 3 kiểu gen

AA, AB và BB Tác giả cho biêt lợn mang kiểu gen BB có số con sơ sinh sống cao hơn lợn mang kiểu gen AA

Bảng 2 Tỷ l ệ kiểu gen và tần số alen gen properdin

Trong hai giống lợn Móng Cái v à Yorkshire tần số alen B cao hơn alen A 3.4 Đa hình gen RNF4

Phân tích ña hình ñoạn gen RNF4 bằng SacII có thể thu ñược ba kiểu gen tương ứng là: Kiểu CC có hai băng tương ứng 545 bp và 392 bp Kiểu TC có 3 băng

tương ứng là 937 bp, 545 bp và 392 bp Kiểu TT có một băng tương ứng là 937 bp Các kiểu gen RNF4, ñược phân biệt bằng ñiện di Kết quả ph ñiện di ñược thể hiện trong hình 4

1 2 3 4 5 6 7 8

4 Phổ ñiện di phân tích ña hình gen RNF4 bằng SacII 1: Marker 100 bp;8: Kiểu gen TT; 3: Kiểu gen CC;  : Kiểu gen TC

Qua hình 4 cho thấy có cả ba kiểu gen TT, TC và CC, tuy nhiên giữa các giống có sự khác nhau về tỷ lệ kiểu gen và tần số alen Kết quả trong bảng 3 cho thấy lợn mang kiểu gen CC chiếm tỷ lệ cao nhất ở lợn Yorkshire, nhưng thấp nhất ở lợn Móng Cái Do ñó tần số alen T ở lợn Móng cái cao hơn alen C, nhưng ở lợn Yorkshire ngược lại, tần số alen C cao hơn alen T Kết quả nghiên cứu của Niu và cs (2008) trên lợn Đại Bạch ở Trung Quốc cho thấy tần số alen T và C tương ứng là 0,53 và 0,47, trong khi ñó tần số alen C của 5 giống lợn ñịa phương dao ñộng từ 0,31- 0,69 Tác giả cho biết lợn mang kiểu gen CC có số con sơ sinh sống cao hơn lợn mang kiểu gen AA

Bảng 3 Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen gen RNF4

Lợn Yorkshire có tần số alen C gen RNF4 cao hơn lợn Móng Cái

3.5 Đa hình gen FUT1

Phân tích ña hình ñoạn gen FUT1 bằng CfoI có thể thu ñược ba kiểu gen tương ứng là: Kiểu AA có hai băng tương ứng 328 bp v à 93 bp Kiểu AG có 4 băng tương ứng là 328 bp, 241 bp; 93 bp và 87 bp Kiểu GG có 3 băng tương ứng là 241 bp; 93 bp và 87 bp Tuy nhiên trong thực nghiệm hai băng 93 bp và 87 bp khó tách biệt Các kiểu gen FUT1, ñược phân biệt bằng ñiện di Kết quả ph ñiện di ñược thể hiện trong hình 5

1 2 3 4 5 6 7 8

Hình 5 Phổ ñiện di phân tích ña hình gen FUT1 bằng CfoI 1: Marker ;6: kiểu gen GG ,;7: kiểu gen AA ;5: kiểu gen AG : sản

phẩm PCR Trên hình 5 cho thấy cả 3 kiểu gen AA, AG và GG ñều xuất hiện, tuy nhiên trong thực tế phân tích cho thấy chỉ có lợn Yorkshire mang cả 3 kiểu gen Lợn Móng Cái chỉ mang một kiểu gen duy nhất là GG Tỷ lệ các kiểu gen và tần số alen của gen FUT1 ở hai giống lợn trình bày trong bảng 4 Phân tích ña hình gen FUT1 trên lợn ñịa phương cộng hoà Séc, Horak và cs (2005) cho biêt tần số alen A và G tương ứng là o,22 và 0,78 Theo kết quả nghiên cứu của Bao và cs (2008) trên 21 giống lợn cho thấy tần số alen A chỉ xuất hiện ở các giống lợn có nguồn gốc châu Âu, các giống lợn ñịa phương Trung Quốc chủ yếu mang alen G

Bảng 4 Tỷ l ệ kiểu gen và tần số alen gen FUT1

Các kết quả trên cho thấy có thể lợn Móng Cái của chúng ta có nguồn gốc gần với lợn Trung Quốc nên không xuất hiện kiểu gen AA, trong khi ñó ở lợn Yorkshire tần số alen A khá cao Đây là sự khác biệt về nguồn gen giữa hai giống

3.6 Mối liên kết của kiểu gen với khả năng sinh sản

Qua kết quả phân tích ña hình 4 ứng cử gen của lợn Móng Cái và lợn Yorkshire thế hệ bố mẹ, chúng tôi tiến hành phân tích ña hình 3 gen ESR, properdin

và RNF4 của lợn con thế hệ 1 và theo dõi số con sơ sinh sống / ở lứa ñể thứ nhất Kết quả ñược thể hiện trong bảng 5

Bảng 5 Số con sơ sinh sống/ổ lứa 1

Mean ± SD

SCSSS của lợn Yorkshire

Mean ± SD ESR : AA

AB

BB

0 9,00 b ± 2,00 12,17 a ± 0,75

8,67 a ± 2,73 10,83 a ± 1,83

0 Properdin: BB

AB

8,83 a ± 1,6 9,17 a ± 1,7

8,50 a ± 1,38 9,50 a ± 3,39 RNF4: CC

TT

12,33 a ± 0,82 9,83 b ± 1,33

12,0 a ± 1,1 8,67 b ± 1,75

* : P < 00 

Qua bảng 5 cho thấy ña hình gen ESR và RNF4 có mối liên kết với số con sơ sinh sống Tuy nhiên ñây mới chỉ là kết quả ban ñầu, nhưng cho thấy lợn nái mang kiểu gen RNF4-CC có số con sơ sinh sống lứa 1cao hơn ñáng kể so với lợn mang kiểu gen RNF4-TT trong cả hai giống lợn

4 Kết luận

- Lợn Móng Cái có tần số alen B gen ESR cao hơn lợn Yorkshire

- Lợn Móng Cái và Yorkshire có tần số alen B gen properdin cao hơn alen A

- Lợn Yorkshire có tần số alen C gen RNF4 cao hơn lợn Móng Cái

- Đa hình gen FUT1 chỉ phát hiện ñược ở lợn Yorkshire

- Số con sơ sinh sống lứa 1 của lợn nái mang kiểu gen RNF4-CC cao hơn ñáng

kể so với lợn mang kiểu gen RNF4-TT trong cả hai giống lợn

Tài liệu tham khảo

1 Bao W.B. Wu S.L.  H.H Mus G.Q Zhu & G.H Chen (2008) Genetic variation

at the alpha-1- fucosyltransferase (FUT1) gene in Asian wild boar and Chinese and Western commercial pig breeds J Anim Breed Genet 125, 427–430

2 Buske B  C Brunsch  K Zeller P Reinecke  G Brockmann (2005) Analysis of properdin (BF) genotypes associated with litter size in a commercial pig cross population J Anim Breed Genet 122, 259-263

3 Domino S.E  Zhang L  Gillespie P.J  Saunders T.L Lowe J.B (2001) Deficiency of reproductive tract alpha (1,2) fucosylated glycans and normal

alpha(1,2)fucosyltransferase locus Mol Cell Biol., 21, 8336–8345

Goliasova E and J Wolf (2004) Impact of the ESR gene on litter size and production traits in Czech Large White pigs Animal Genetics, 35, 293-297

5 Hasty L.A  Brockman W.W  Lambris J.D. Lyttle C.R.(1993) Hormonal regulation of complement factor B in human endometrium Am J Reprod Immunol., 30, 63–67

6 Hirvonen-Santti S.J  Srirama V  Anttone M  Savolaine S Palvimo J.J

Heikinheimo M Richards J.S. JanneO.A (2004) Small nuclear RING finger protein expression during gonad development: regulation by gonadotropins and estrogen in the postnatal ovary Endocrinology 145, 2433–2444

7 Horak P. T Urban  J Dvorok (2005) The FUT1 and ESR genes – their variability and associations with reproduction in P eštice Black-Pied sows J Anim Breed Genet 122, 210-213

8 Horogh G  A Zsolnai I Komlussi A Nyowsri I Anton  L Fojosus (2005) estrogen receptor genotypes and litter size in Hungarian Large White pigs J Anim Breed Genet 122, 56-61

9 Meijerink E  R Fries P.Vo¨geli J Masaban  G Wigger C Stricker S Neuenschwander H.U Bertschinger G Stranzinger (1997) Two a(1,2) fucosyltransferase genes on porcine Chromosome 6q11 are closely linked to the blood group inhibitor (S) and Escherichia coli F18 receptor (ECF18R) loci Mammalian Genome 8, 736–741

10 Niu B.Y  L.Z Ye F.E Li C.Y De  S.W Jia  M.G Lei Y.Z Xiong (2008).

Identification of polymorphism and association analysis with reproductive traits in the porcine RNF4 gene.Animal Reproduction Science

11 Rothschild MaxCarol Jacobso David Vaske Chirstopher Tuggle Lizhen Wang

Tom Short Gregg Eckardt Shoji Sasaki Amy Vincent David McLare Olwen Southwo on  Hein van der Stee Alan Mileham and Graham Plastow (1996) The estrogen receptor locus is associated with a major gene influencing litter size in pigs roc Natl Acad Sci USA 93, 201-205

12 Short T.H  M F Rothschiln O I Southwood D G McLare A de Vriesf H van der Stee G R Eckardt C K Tuggle J Helm D A Vaske A J Mileham