1 Tên đề tài: Kt qu gn Horse Radish Peroxidase Progesterone s dng trong ELISA để chẩn đoán bò sữa có thai sớm Phan van Kiem, Tang Xuan Luu *,Nguyen Thi Dinh**, Nguyen Thi Tuyet Nhung Abstract Ataching Horse Radish Peroxidase with Progesterone to produe HRP- P4 for use in early pregnancy Elisa test on dairy cows The objective of the experiments was to produce Horse Radish Peroxidase Progesterone (HRP-P4) complex from HRP and P4 to replace the expensive imported HRP P4. The results show that: HRP- P4 produed from the present experiment could be used for early pregnancy Elisa test on dairy cows with the efficiency comparable to the imported HRP-P4 Key words: Progesterone, Horse Radish Peroxidase, pregnancy. * Trung tõm Nc bũ & ng c Ba Vỡ ** Cụng ty Sentis t vn ủ: Động thái hormon sinh dục có trong huyết thanh, sữa v.v ( Isobe. N. (2002) là tín hiệu quan trọng phản ảnh chu kỳ sinh sản, tình trạng mang thai của con vật cũng nh tín hiệu trong một số bệnh sinh sản. Để nghiên cứu động thái của hormon sinh sản, ngời ta dựa vào các kit không những chỉ phát hiện mà còn có thể định lợng nồng độ hormon trong mẫu cần xét nghiệm, giúp xác định nguyên nhân gây chậm sinh và chẩn đoán có thai sớm ở bò. Các xét nghiệm có thể tiến hành trong sữa, huyết thanh với thời gian nhanh, chính xác. Kit có khả năng định lợng Progesterone phổ biến hiện nay là competitive EIA-P4. Kit này cho phép định lợng Progesterone trong mẫu huyết thanh, sữadựa vào đờng cong của mẫu tham chiếu. Tuy nhiên, Kit EIA-P4 nhập ngoại rất đắt và hơn nữa khi nhập các kit khác nhau, thờng phải xác định lại đờng cong chuẩn trong định lợng. Do vậy việc chủ động nguồn ch phm chính của kit nh: kháng thể kháng P4, HRP-P4 cấu thành bộ kit là hết sức cần thiết. Để chủ động nguyên liệu dựng trong chẩn đoán, ủ ti tiến hnh với mục tiêu tạo đợc chế phm HRP-P 4 dùng trong phản ứng ELISA để chẩn đoán bò sữa có thai sớm. Vt liu v phng pháp nghiên c u * Hóa cht, nguyên liệu: Progesterone; HRP (Horse Radish Peroxidase); NHS (N- hydroxysuccinimide) DCC (dicyclohexylcarbodimide) ; DMF (dimethylformamide); Na 2 CO 3 ; NaHCO 3 ; NaH 2 PO 4 ; 2 Na 2 HPO 4 ; NaCl; KCl ; Sephadex G50; HRP-P 4 chuẩn; Anti Progesterone; BSA (Bovine Serum Albumin); Axit Boric; OPD (o-Phenylenediamine); H 2 SO 4 * Động vật thí nghiệm: Bò lai hớng sữa F2, F3 sinh sản bình thờng 4-6 tuổi đã đẻ 1-2 lứa. Các mẫu sữa đợc lấy vo ngy động dục( ngy 0), ngy 7, 15 v 21 sau phối giống * Nội dung nghiên cu: - Thăm dò phơng pháp gắn HRP P4 - Xác định độ pha loãng thích hợp của HRP - P4 tự gắn để dùng trong phản ứng Elisa - Thử nghiệm để chẩn đoán có thai sớm ở bò sữa * Phơng pháp nghiên cu: - Phơng pháp gắn Progesterone với HRP theo theo phơng pháp ca Se-Han P v cs (1993); theo cỏc bc sau: a. Tạo dung dịch 1: Hòa tan progesterone với nồng độ 0.024 mmol, NHS 0.043 mmol v DCC 0.024mmol trong DMF. Trộn trong vòng 2h đến khi xuất hiện kết tủa. Sản phẩm đợc ly tâm ở 2.800vòng/phút trong 20 phút. Huyễn dịch l hỗn hợp este hoạt hóa với progesterone (Progesterone ester). Lọc tách bỏ kết tủa để lấy phần hòa tan. b. Tạo dung dịch 2: Hòa tan 0.25micromol HRP trong Carbonate buffer pH 8.8, nồng độ 0.2M chứa KCL 0.15M.: Tạo dung dịch 1 dung dịch 2 ủể tạo phức hợp gắn HRP với Progesterone - Phng phỏp thăm dò độ pha loãng thích hợp ca HRP-P 4 tự gắn & kỹ thuật Elisa để chẩn đoán có thai sớm ở bò sữa theo phơng pháp của Nakao T v cs ( 1982). lý s liu: S liu ủc x lýtheo phng phỏp thng kờ sinh hc cú s dng phn mm Excel v Minitab Th i gian v a ủim nghiên c u; Thí nghiệm tiến hành từ tháng 1/ 2007 6/2008 tại Viện Chăn nuôi, Cụng ty Sentis, Trung tâm N/C bò & đồng cỏ Ba Vì, Hà Tây Kết quả và thảo luận Kết quả gắn Progesterone-HRP Để tạo phức hợp gắn HRP với Progesterone các bớc tiến hành nh sau: Pha dung dịch 1 & 2 với tỷ lệ 1:1, lắc trong vòng 1 giờ. Hỗn hợp đợc ly tâm ở 2.800vòng/phút trong vòng 10 phút. 3 Cô đặc phức hợp bằng ống Concentrator Centriprep-10, sau khi ly tâm bỏ tủa thu phức hợp HRP-P4. Để loại bỏ Progesterone và HRP tự do, cho hỗn hợp chạy qua cột Sephadex G50 v bằng dung dịch BPS, pH 7.4 với tốc độ 6 ml/ h, sản phẩm đợc trình bày ở bảng 1 Bng 1: Kt qu gn phc hp HRP vi P4 Ln gn Phc hp trc khi gn Phc hp sau khi gn Phc hp sau khi chy ct Phc hp sau khi cụ ủc T l thu hi (%) I 5ml 4,6ml 15ml 1,30ml 28,26 II 3ml 2,7ml 9ml 0,75ml 27,78 Khi gắn HRP với P4 bằng dung dịch 1 và dung dịch 2 với tỷ lệ 1/1, phức hợp sau khi chạy qua cột Sephadex G50 tơng ứng là 1,30ml & 0,75ml. T l thu hi sn phm HRP- P4 sau khi gn ln thớ nghim I: 28,26% v thớ nghim II: 27,78%. Kết quả xác định độ pha loãng thích hợp của HRP-P4 tự gắn. HRP-P4 tự gắn đợc pha loãng theo các tỷ lệ sau: 1/5.000; 1/10.000; 1/50.000; 1/100.000 & 1/500.000 HRP-P4 chuẩn pha với tỷ lệ 1/50.000 ( 1 HRP-P4 chun vi 49 999 dung dch pha loóng . Bảng 2: Kết quả so sánh độ pha loãng HRP-P4 tự gắn với HRP-P4 chuẩn S ln P4 chuẩn pha loóng HRP-P4 t gn n ng/ml HRP-P4 chun 1/50.000 + P4 chun MSe 1/5.000 + P4 chun MSe 1/10.000 + P4 chun MSe 1/50.000 + P4 chun MSe 1/100.000 + P4 chun MSe 1/500.000 + P4 chun MSe 5 0 16602,2 28892,3 26342,2 23382,4 20402,2 16552,4 5 0,03 17542,6 29512,4 27452,4 24122,3 21292,4 17622,5 5 0,1 18432,2 28592,2 25662,1 22742,2 21282,3 18552,3 5 0,3 17462,4 26742,5 24392,5 21592,5 19882,5 17762,4 5 1 15832,3 24602,4 21582,3 18682,4 17502,4 15782,2 5 3 12542,5 22092,1 19582,2 16302,3 13962,6 12472,5 5 10 8932,4 19142,3 16092,4 13532,3 11462,3 8792,4 5 30 6432,3 15822,2 12082,1 10342,4 8932,2 6552,3 4 - ở nng ủ pha loãng 1/10.000, nng ủ P4 30ng/ml giá trị OD của HRP-P4 tự gn ủt 1208 tơng đơng với giá tr OD nng ủ P4 3ng/ml ca HRP-P4 chun. Nh vy nng ủ HRP-P4 t gn quá cao so với HRP-P4 chuẩn - Ti các ủ pha loãng 1/50.000 v 1/100.000 các giá tr OD ủu có s chênh lệch khá lớn, trong khi ủó ở độ pha loãng 1/500.000 giá trị OD của HRP-P4 tự gn tơng đơng vi HRP-P4 chun (655 và 643). Kết quả đợc thể hiện rõ qua đồ thị 1: th 1. Kết quả so sánh độ pha loãng HRP-P4 tự gắn với HRP-P4 chuẩn Để xác định chính xác độ pha loãng thích hợp ca HRP-P4 t gn, thí nghim đợc tiến hành vi các ủ pha loãng cao hn: 1/500.000; 1/600000; 1/700000; 1/800000; 1/1000000 . Kết quả thu đợc trình bày ở bảng 3. 5 B¶ng 3: KÕt qu¶ thăm dò ®é pha lo·ng HRP-P4 tù g¾n víi HRP-P4 chuÈn P4 chuÈn Độ pha loãng HRP-P4 tự gắn Số lần n ng/ml HRP-P4 chuẩn 1/50000 + P4 chuẩn M±Se 1/500.000 + P4 chuẩn M±Se 1/600000 + P4 chuẩn M±Se 1/700000 + P4 chuẩn M±Se 1/800000 + P4 chuẩn M±Se 1/1000000 + P4 chuẩn M±Se 5 0 1668±2,5 1665±2,3 1373±2,2 1036±2,4 0795±2,2 0649±2,3 5 0,03 1747±2,3 1762±2,6 1473±2,5 1142±2,5 0871±2,4 0786±2,5 5 0,1 1848±2,4 1845±2,5 1315±2,2 1023±2,1 0875±2,5 0764±2,6 5 0,3 1756±2,6 1776±2,4 1183±2,3 0856±2,4 0812±2,1 0651±2,2 5 1 1588±2,5 1578±2,3 0981±21 0755±2,2 0675±2,2 0533±2,4 5 3 1263±2,2 1257±2,1 0767±2,5 0654±2,5 0531±2,4 0456±2,2 5 10 0897±2,1 0878±2,2 0651±2,4 0553±2,1 0500±2,5 0447±2,5 5 30 0648±2,4 0650±2,3 0427±2,2 0405±2,3 0396±2,4 0374±2,3 §å thÞ 2: é pha lo·ng HRP-P4 tù g¾n víi HRP-P4 chuÈn 6 ở độ pha loãng HRP-P4 tự gn ở mức 1/500000, cho kết quả giá trị OD trung bình tơng đơng với HRP-P4 chuẩn (648 và 650). Khi độ pha HRP-P4 tự gn loãng lớn hơn 1/600000 (427); 1/700000 (405); 1/800000 (396); 1/1000000 (374) thấy kết quả OD trung bình thấp hơn nhiều so với HRP-P4 chuẩn. Từ kết quả ở bảng 2, bảng 3, đồ thị 1 và 2, nhận thấy HRP-P4 tự gn với độ pha loãng 1/500000, giá trị OD trung bình tơng đơng với HRP-P4 chuẩn ở nồng độ P4 chuẩn 30 ng/ml. Kết quả này phự hp vi Se-Han P v Cs (1993) & tip tc đợc thử nghiệm trong phản ứng Elisa để chẩn đoán có thai sớm ở bò sữa. ELISA để chẩn đoán bò sữa có thai sớm 12 bò lai hớng sữa F2, F3 sinh sản bình thờng 4-6 tuổi đã đẻ 1-2 lứa ủc chn lm thớ nghim. Các mẫu sữa đợc lấy vo ngy động dục (ngày 0) ngy 7, 15 v 21 sau phối giống, kết quả đợc trình bày ở bảng 4. Bng 4. Kt qu so sánh HRP-P 4 t gn vi HRP-P 4 ngoi nhp ủ chn ủoỏn bũ sa có thai sớm. Hm lng P 4 trong sa (ng/ml) Nhóm TN n Ngy 0 MSe Ngy 7 MSe Ngy 15 MSe Ngy 21 MSe Ngy 25 MSe Kt qu khám thai* HRP-P4 tự gắn 7 0,250,02 0,880,03 1,650,04 1,820,05 2,420,07 7 HRP-P4 ngoại nhập 7 0,270,05 0,910,04 1,550,03 1,720,03 2,380,05 7 HRP-P4 tự gắn 5 0,220,04 0,580,03 1,150,05 0,560,06 0,360,03 0 HRP-P4 ngoại nhập 5 0,210,03 0,610,05 1,350,07 0,650,05 0,320,02 0 * Kt qu khám thai sau 45 ngy Nhóm 7 bò đợc chẩn đoán đã có thai, hàm lợng P4 tăng dần sau ngày động dục và bắt đầu tăng nhanh từ ngày thứ 7, đạt đỉnh cao vào ngày thứ 15 và tiếp tục tăng sau ngày 21 và 25 với cỏc hàm lợng tơng ứng là: 0,25/0,27; 0,88/0,91; 1,55/1,65; 1,72/1,82 và 2,38/2,42. Sự sai khác hàm lợng P4 giữa 2 lô sử dụng HRP-P4 tự gắn và chuẩn là không đáng kể (P > 0,05). Kt qu ny 7 tng ủng vi kt qu ca Homeida v Cs (2002); Phan Văn Kiểm & Cs(2003). 7 bò trên đợc xác định đã có thai sau 45 ngày phối giống bằng phơng pháp khám thai qua trực tràng. Nhúm 5 bò đợc chẩn đoán là không có thai : hàm lợng P4 ngày động dục giữa các lô sử dụng HRP-P4 tự chế và ngoại nhập không có sai khác (P > 0,05) tng ng 0,22/0,21; 0,58/0,61; 1,15/1,35; 0,56/0,65 và 0,36/0,32. Hàm lợng P4 cũng tăng dần từ ngày 7 sau động dục song mức độ tăng chậm hơn so với nhóm bò phối giống và có thai. Có lẽ chất lợng của thể vàng ủó ảnh hởng đến tỷ lệ đậu thai ở nhóm bò này. Từ s liu trờn nhận thy: khi sử dụng HRP-P4 tự gắn kết quả xột nghim tơng đơng với HRP-P4 nhập ngoại v khng ủnh cú th thay th bng HRP-P4 t gn trong phn ng Elisa ủ chn ủoỏn bũ sa có thai sớm. Kết luận và đề nghị Kt lun * Đã gn thnh cụng HRP v Progesterone to phc hp HRP-P4 dùng trong kít EIA-P4. * Đã xác định đợc độ pha loãng HRP-P4 tự gn ở mức 1/500 000 cho kt qu tơng đơng với chế phẩm HRP-P4 ngoại nhập * Đã bớc đầu ứng dụng thnh cụng HRP-P4 t gn trong b kit EIA-P4 để chẩn đoán bò sữa có thai sớm sau 21 ngy phi ging : ngh * Đợc thử nghiệm HRP-P4 tự gn trong kít EIA-P4 ủ chẩn đoán cú thai sm v kim tra chức năng hoạt động của buồng trứng bò sữa trong sn xut. Tài liệu tham khảo 1. Se-Han P, Leonidas G. Bachs và Willfried S. (1993). Formulating HRP-P4 for Elissa test. Analytical Biochemistry 210, 145-154 2. Isobe N( 2002.) Theory and application of ELISA. Hiroshima Univ. Japan. 3. Nakao T; Sugihashi A; Tosa.E (1982). Use of milk P4 EIA for early pregnancy diagnosis in cows. . Pages 267-272. 4. Homeida et al. (2002). Progesterone levels in skim milk in cow which conceived and not conceived after AI. Hiroshima University. Journal 5. Phan Văn Kiểm , Đào Đức Thà , Trịnh Quang Phong, Tăng Xuân Lu, Nguyễn Quí Quỳnh Hoa(2003) Kết quả nghiên cứu hàm lợng Progesterone ở bò lai hớng sữa bằng kỹ thuật miễn dịch enzyme (EIA).Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội . Cs (1993) & tip tc đợc thử nghiệm trong phản ứng Elisa để chẩn đoán có thai sớm ở bò sữa. ELISA để chẩn đoán bò sữa có thai sớm 12 bò lai hớng sữa F2, F3 sinh sản bình thờng 4-6 tuổi. gn Horse Radish Peroxidase Progesterone s dng trong ELISA để chẩn đoán bò sữa có thai sớm Phan van Kiem, Tang Xuan Luu *,Nguyen Thi Dinh**, Nguyen Thi Tuyet Nhung Abstract Ataching Horse. chế phm HRP-P 4 dùng trong phản ứng ELISA để chẩn đoán bò sữa có thai sớm. Vt liu v phng pháp nghiên c u * Hóa cht, nguyên liệu: Progesterone; HRP (Horse Radish Peroxidase) ; NHS (N- hydroxysuccinimide)