Đánh giá sự sai khác di truyền giữa một số quần thể dê nội Việt Nam Trần Thị Thu Thuỷ, Nguyễn Trọng Bình, Phạm Doãn Lân, Đỗ Ngọc Duy, Nguyễn Văn Ba, Lê Quang Nam, Lê Thị Thuý Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật Summary Five Vietnamese indigenous goat populations were genotyped for fifteen microsatellite markers recommended by the FAO. A total of 97 alleles were observed in 5 populations. The mean expected heterozygosity and the mean observed heterozygosity for the populations are 0.480 and 0.439, respectively. The mean Fst (0.063) (the genetic differentiation within each population) is small. Coeffecient inbreeding of the Co Sonla goat population is higher than other populations (Fis = 0.147). Large Nei's standard genetic (0.157) were observed between Co Sonla and Bach Thao Ninhthuan goat population. The STRUCTURE software program was used to cluster individuals to 2 2 k 2 4 assumed clusters. The most probable clustering was found at k = 2. The study analyzed the recent origins of these populations and contributed to the knowledge and genetic characterization of Vietnamese indigenous goat populations. 1. Đặt vấn đề Hin nay, chỳng ta ủang ủng trc tỡnh trng ủỏng bỏo ủng v mụi trng, h sinh thỏi b phỏ v, hin tng thoỏi hoỏ nhanh chúng trong cỏc ging vt nuụi. phc v cho li ớch v hiu qu kinh t, ngi ta ch tp trung lm t ng s ủu con, ủa vo h thng ch n nuụi thõm canh, lm gim s phong phỳ trc ủõy ca cỏc ging v t ng t l ủng huyt dn ti sc sng gim sỳt nhiu ging. Cỏc nc núi chung v Vit m núi riờng hin ủang phi ủt ra phng hng bo tn vt liu di truyn trờn cỏc ủi tng vt nuụi, ủ va ủm bo khai thỏc, chn lc cỏc qun th theo tiờu chun kinh t, va phi bo v tớnh ủa dng di truyn phong phỳ ca cỏc ging ủng vt. ủú, ủỏnh giỏ cu trỳc di truyn, bo tn v s dng cỏc ging ủng vt l nhim v cp bỏch ca cỏc nh nghiờn cu di truyn hc.Trong nhng n m gn ủõy, ủa dng di truyn ca cỏc ging dờ bn ủa ủc ủỏnh giỏ da trờn cỏc phng phỏp di truyn hoỏ sinh, A ty th (Li, 1997), v ủa hỡnh khuch ủi ngu nhiờn (RA (Chen, 2001) Tuy nhiờn, tt c cỏc ch th ny ủu cú s ủa hỡnh, nhng cha phõn bit ủc rừ rng g LIa, S g ZHAOa, 2002). Hin nay k thut marker l cụng c hu hiu trong vic xỏc ủnh s ủa dng di truyn gia cỏc qun th cng nh mi quan h phỏt sinh loi. T nhng tỡnh hỡnh thc t trờn, ủ gúp phn ủnh hng bo tn tớnh ủa dng di truyn ca cỏc ging dờ chỳng tụi nghiờn cu ủ ti:" ỏnh giỏ s sai khỏc di truyn gia cỏc qun th dờ ni Vit Nam" 2. Đối tợng, vật liệu và phơng pháp 2.1. i tng, thi gian v ủa ủim nghiờn cu - Tng s l 199 mu mỏu dờ C v dờ Bỏch Tho ủc thu thp ngu nhiờn t cỏc v trớ ủa lý khỏc nhau: C Ba vỡ (CoBV), dờ C Sn La (CoSL), dờ C Thanh hoỏ (CoTH), dờ Bỏch Tho Ba Vỡ (BthBV), dờ Bỏch tho Ninh thun (BthNT). - Thớ nghim ủc tin hnh ti Vin Ch n nuụi từ 11/2006 - 5/2007. 2.2. Vt liu Cỏc mu mỏu dờ ủc thu thp v bo qun -20 o C - Hoỏ cht: Magic buffer, Lyses Buffer (160mM Sucrose, 80mM EDTA pH8; 100mM), phenol, proteinase K, mi, Taq-polymeare, buffer, dNTPs theo cỏc hóng Fermantas, Merk, Invitrogen - Thit b: Mỏy gii trỡnh t CEQ8000, mỏy PCR, mỏy ly tõm 2.3. Phng phỏp - Tin hnh thu thp mu - Tỏch chit ADN tng s: theo qui trỡnh Lysis Buffer (Vin Ch n nuụi Quc T). - Nhõn gen bng phng phỏp PCR: S dng phng phỏp PCR ủ nhõn lờn cỏc ủon gen cú cha cỏc microsatellite. Thnh phn phn ng PCR: Buffer 1,2X; dNTP 200nm (m i lo i); Mg ++ 15mM; 10pM m i lo i m i; ADN 40ng; Taq-polymeare 1,5U; nc vụ trựng. Vi chu trỡnh nhit: 94 0 -5;95 0 -30; (48- 65) 0 -1; 72 0 -1; 72 0 -10 v ủc lp li trong 35 chu k. - Phõn tớch Fragment trờn mỏy gii trỡnh t CEQ8000 v phõn tớch trờn phn mm CEQ system. - Phõn tớch s liu qua cỏc phn mm thng kờ: + Sử dụng phần mềm Fstat version 2.9.3 (Goudet, 2001) ñể tính số alen quan sát ñược ở m i locut i với m i m u và t n s alen tương ứng. Trung bình dị hợp tử quan sát Ho và lý thuyết He (giả ñịnh quần thể tuân theo ñịnh luật Hardy-Weinberg, Nei.1987). Các giá trị Fis, Fst. + Phần mềm Genetics phiên bản 4.03: Xác ñịnh sự phân bố các cá thể trong quần thể. + Phần mềm Phylip phiên bản 3.5, (Felsenstein, 1993): Vẽ cây phân loại dựa trên khoảng cách di truyền giữa các quần thể. - Một số công thức liên quan ñến cấu trúc quẩn thể: Một số cách tính tiện lợi cho cấu trúc quần thể là giá trị thống kê F ñược Wright phát triển (1965). Giá trị F ñược tính theo công thức * Trong quần thể: F = Fis = (He – Ho)/He: Trong ñó: - Ho: tần số dị hợp tử quan sát = f(Aa) - He: tần số dị hợp tử lý thuyết = 2pq - Fis: thể hiện sự biến thiên của tần số alen [1;-1], ñánh giá mức ñộ cận huyết của các cá thể trong quần thể * Gi a các quần thể với nhau: F = Fst = (Ht – Hs)/Ht - Ht: Tần số dị hợp tử lý thuyết của các quần thể tạo thành 1 quần thể duy nhất . - Hs: Trung bình tần số dị hợp tử lý thuết của các quần thể - Fst: Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các quần thể hay hệ số cận huyết giữa các quần thể . KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. Tính ña hình các maker Qua bảng 1 chúng tôi thấy tất cả 15 Microsatellite ñều có tính ña hình cao. Tổng số alen có mặt trong 5 quần thể là 97, trung bình 6,47 ± 2,67 alen trên m i locut. Kho ng alen quan sát thấy ở 15 locut ñều nằm trong khoảng alen ñã báo cáo (theo FA (Bảng 1). Bảng 1. Đặc ñiểm của các locut Microsatellite: Khoảng cách và số alen ñối với mỗi locut trên tổng 5 quần thể dê bản ñịa của Việt Nam 1,2,3,4,5 alen xuất hiện tại quần thể Dê Cỏ Ba vì (1), dê Cỏ Sơn La (2), dê Cỏ Thanh hoá (3), dê Bách thảo Ba Vì (4), dê Bách thảo Ninh thuận (5). Tên locut Kho ng allen thu c S alen Kho ng allen mong i Lo i alen trong quần thể ILSTS0029 152-179 7 135-185 151 1,2,3,4,5 159 4 161 1,4,5 165 4 171 1 177 1,2,3,4 179 2 BMS149 254-278 4 235-300 254 1,3,4,5 270 1 274 1,2,3,4,5 278 1,2,3,4,5 MAF035 105-107 2 90-130 105 1,2,3,4,5 107 1,2,3,4,5 SRCRSP 111-125 6 110-140 111 1,2,3,4,5 115 5 119 1,2,3,4,5 121 1,2,3,4,5 123 1,4,5 125 1,3,4,5 BM1818 248-266 10 240-310 248 4 250 1,2,3,4 252 1,2,3,4,5 254 5 256 1,4,5 258 1,2,3,4,5 260 1,2,3,4 262 1,2,3,4 264 2,5 266 4,5 ARFCB 89-119 10 80-130 89 1,2 91 1,2,3,4 93 1,2,3,4,5 95 1,2,3,4,5 97 1,2,3,4,5 99 1,2 101 4,5 103 1,3,4,5 105 2 119 3 ARAE5 118-138 9 105-145 118 1,2 120 1,2,3,4,5 124 1,2,3,4,5 126 1 130 1,2,3 132 1 134 1,2,3,4 136 1,2,3,4,5 138 1,4 ILSTS005 176-182 3 160-230 176 1,2,3,4,5 180 1,2,3,4,5 182 1,3,4 SPS113 139-151 7 125-170 139 3 141 1,2,3,4,5 143 1,2,3,4,5 145 1,2,3,4,5 147 1.2.3.4.5 149 1,3,4 151 1,2,3 CSRD247 218-244 9 210-260 218 1,2,3,4,5 230 2,3 232 1,4 234 1,2,3,4,5 236 1, 238 2,4 240 1,4,5 242 1,2,3,4,5 244 5 INRA0132 139-153 4 125-175 139 1,2,3,4,5 141 1,2,3,4,5 145 1,4,5 153 1,4 MCM527 154-168 4 155-195 154 1,2,3,4,5 156 1,2,3,4,5 164 3,4 168 1,2,4 MAF70 140-158 9 120-190 140 3,4,5 144 4,5 146 1,2,3,4 148 1,3,4,5 150 1,2,3,4,5 152 1,3,4,5 154 1,3,4,5 156 1,2,3,4,5 158 1,4,5 ILSTS11 263-283 8 250-300 263 1,4,5 267 3 269 1,3,4,5 271 1,2,3,4,5 275 1,2,3,4 277 1,2,3,4,5 279 1,2,3,4,5 283 5 ETH10 199-211 5 190-220 199 2,5 205 1,4,5 207 1,2,3,4,5 209 1,3,4 211 1 Tổng 97 TB 6,47± 2,67 3.2. Đánh giá ña dạng di truyền trên mỗi locut trong tổng 5 quần thê dê bản ñịa Bảng 2 . Tần số dị hợp tử quan sát (Ho), tần số dị hợp tử theo lý thuyết (Hs), Fst và Fis trên mỗi locut trong tổng 5 quần thể Tần số dị hợp tử mong ñợi (He) trên tất cả quần thể với từng locut biến thiên từ 0,142 ñến 0,698 với trung bình 0,439 (bảng 2). Fst và Fis trung bình trên tổng số locut trong tất cả các quần thể tương ứng là 0,063 và 0,087 (bảng 2). Hai giá trị này nhỏ và không chênh lệch nhiều, ñiều này cho thấy rằng sự khác nhau về mặt di truyền giữa các quần thể không lớn. Giá trị Fis càng nhỏ (tiến gần tới 0) quần thể giao phối ngẫu nhiên (Nei, 1986). Fis = 0.087 cho ta biết tỷ lệ giao phối cận huyết thấp giữa các quần thể. 3.3. Đánh giá tính ña dạng di truyền trên toàn bộ locut với mỗi quần thể Tên locut Ho He Fst Fis ILSTS0 0.142 0.143 0.018 0.003 BMS149 0.344 0.382 0.113 0.099 MAF035 0.429 0.455 0.07 0.056 SRCRSP 0.632 0.695 0.042 0.091 BM1818 0.490 0.549 0.032 0.107 ARFCB 0.443 0.483 0.031 0.083 ARAE5 0.546 0.562 0.134 0.028 ILSTS0 0.261 0.262 0.029 0.004 SPS113 0.534 0.603 0.061 0.114 CSRD24 0.638 0.596 0.046 -0.07 INRA01 0.163 0.393 0.121 0.586 MCM527 0.416 0.417 0.02 0.002 MAF70 0.698 0.71 0.073 0.016 ILSTS1 0.592 0.687 0.054 0.138 ETH10 0.25 0.268 0.049 0.066 Trung bình 0.439 0.48 0.063 0.087 Bảng 3. Giá trị Fis (hệ số cận huyết) trên mỗi quần thể Quần thể CoBV CoSL CoTH BthBV BthNT Fis 0,054 0,147 0,071 0,017 0,003 Kết quả từ bảng 3 cho thấy, giá trị Fis ở cả 5 quần thể ñều lớn hơn không, ñiều này có nghĩa mức ñộ dị hợp tử trong quần thể thấp. Trong ñó giá trị Fis của quần thể dê CoSL cao nhất (0,147), kết quả này cho biết các cá thể trong quần thể có giao phối cận huyết, tình trạng trên có thể ñược giải thích: do quần thể dê CoSL ở bản thuộc vùng sâu, vùng xa của thị xã Sơn La, quần thể bị chia thành những nhóm nhỏ trong hộ gia ñình, mà khoảng cách những hộ nuôi thường cách xa nhau, nên khả n ng gặp giao phối giữa các nhóm ít xảy ra. 3.4. Tính khoảng cách di truyền Ma trận khoảng cách di truyền trong số 5 quần thể dê theo tiêu chuẩn của Nei, (1978) (bảng 4). Từ khoảng cách này chạy qua phần mềm Neighbour-tree cho cây phân loại ở Hình1 Bảng 4. Ma trận khoảng cách di truyền giữa các quần thể Hình1 . Cây phân loại 5 quần thể dê nội Quần thể CoBV CoSL CoTH BthBV BthNT CoBV 0 0.0445 0.0276 0.0401 0.0750 CoSL ** 0 0.0663 0.1210 0.1507 CoTH ** ** 0 0.0708 0.1023 BthB V ** ** ** 0 0.0195 BthT ** ** ** ** 0 ** có ý nghĩa ở mức 1% Kết quả trên cho chúng ta thấy: khoảng cách di truyền giữa quần thể Bách Thảo Ba Vì và Bách Thảo Ninh Thuận là rất nhỏ, Fst: 0.0195. Trong khi ñó khoảng cách ñịa lý giữa quần thể dê Bách Thảo Ba Vì và Ninh Thuận là khá xa và 0.01 covBV covSL2 0 covTH2 0 BthBV2 0 BthNT2 0 CoSL CoBavi CoTHoa BThBv BThNT hệ sinh thái khác nhau, ñiều này ñược giải thích là do 2 quần thể này ñều có chung nguồn gốc xuất xứ và thời gian cách ly về mặt ñịa lý chưa dài, vì vậy mà sự khác biệt về mặt di truyền giữa 2 quần thể là không ñáng kể. Khoảng cách di truyền lớn nhất là quần thể Cỏ Sơn La và Bách Thảo Ninh Thuận (0,157). 3.5. Đánh giá mức ñộ phân tách quần thể theo giống qua phần mềm STRUCTURE Hình 2. Mức ñộ phân tách quần thể theo giống ( 1: Quần thể dê Cỏ Bavi, dê Cỏ Sơn La, 3: dê Cỏ Thanh Hoa, 4: Dê Bách Thảo Ba Vì,5: dê Bách Thảo Ninh Thuận). Từ kết quả phân tích STRUCTURE, giả ñịnh trong 5 quần thể trên có 2 giống (K=2), 3 giống (K=3), 4 giống (K=4), chúng tôi có biểu ñồ tỷ lệ phần tr m của các giống trong m i quần thể. Quần thể dê cỏ Ba vì và cỏ Thanh Hoá có thể có sự lai tạp giữa các giống. Quần thể dê Cỏ Sơn La, Bách Thảo Ninh Thuận và Bách Thảo Ba Vì có tỷ lệ phần tr m của 1 giống chiếm chủ yếu. Kết quả này cũng phù hợp với khoảng cách di truyền ở trên. 3.6. Xác ñịnh mô hình phân bố các cá thể trong quần thể bằng phần mềm Genetic Hình 3. Mô hình phân bố các cá thể trong quần thể K >2 K=2 Mô hình trên cho thấy, giả ñịnh k = 2,3,4 thì sự phân bố của các cá thể trong 5 quần thể ñều phân thành 2 nhóm. . KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ K=2 K = 3 K = 4 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 1 2 3 4 5 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 1 2 3 4 5 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 1 2 3 4 5 gi?ng khác gi?ng khác de Bach thao de Co 4.1. KÕt luËn K t qu phân tích qua các phần mềm Fstat, Phylip và Genetic cho thấy: 1. Tất cả 15 micrositellite ñều biểu hiện tính ña hình cao. 2. Sự khác nhau về mặt di truyền giữa các quần thể không lớn. 3. Quần thể dê cỏ Ba Vì và Thanh Hoá có sự lai tạp giữa các giống. 4. Đối với quần thể dê cỏ Sơn La hệ số cận huyết là cao nhất so với các nhóm nghiên cứu. 5. Kết quả về khoảng cách di truyền cho thấy 2 giống dê Cỏ và Bách Thảo thực sự là 2 giống khác nhau. 4.2. §Ò nghÞ Đây là kết quả nghiên cứu bước ñầu ñánh giá thực trạng và chiều hướng ña dạng di truyền các quần thể dê nội. Để có kết luận chính xác hơn chúng tôi ñề nghị ñược tiếp tục nghiên cứu ñánh giá trên nhiều quần thể ở các vùng ñịa lý khác nhau của Việt Nam và nhiều các chỉ thị microsatellite hơn. Tµi liÖu tham kh¶o 1. Chen S.L., Zhao S.H., Li Y.J., Li M.H., The research of rADNom amplified polymorphic DNA(RAPD) of Liaoning cashmere goat, J. Huazhong Agr. Univ. 1. 4 (2001) 303–305. 2. Goudet, J., 2001. FSTAT, a program to estimate ADN test gene diversities ADN fixation indices (version 2.9.3). http://www.unil.ch/izea/softwares/fstat.html . 3. FAO: Secondary Guidelines for Development of National Farm Animal Genetic Recourse Management Plans, Measurement of Domestic Animal Diversity (MoDAD): Recommended Microsatellite Markers, Food ADN Agriculture rganization of the United Nation. (2002) 4. Felsenstein, L., 1993. Phylip (Phylogeny Inference Package) Version 3.5c. University of Washington, Washington, D.C. 5. Li X., Zhang Y., Chen S., Zeng F., Study on the mtDNA RFLP of goat breeds, 6. Zool. Res. 4 (1997) 421–428. 7. Meng-Hua LIa, Shu-Hong ZHAOa, Genetic relationships among twelve Chinese indigenous goat populations based on microsatellite analysis. a Laboratory of Molecular Biology ADN Animal Breeding,School of Animal HusbADNry ADN Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, P.R. China (Received 26 ctober 2001 8. Nei M., Estimation of average heterozygosity ADN genetic distance from a small number of individuals, Genetics 89 (1978) 583–590. 9. Zeuner F.E., A history of domesticated animals, Hutchinson, London, 1963. To access this journal online:www.edpsciences.org . Đánh giá sự sai khác di truyền giữa một số quần thể dê nội Việt Nam Trần Thị Thu Thuỷ, Nguyễn Trọng Bình, Phạm Doãn Lân, Đỗ Ngọc Duy, Nguyễn Văn Ba, Lê Quang Nam, Lê Thị Thuý. hình cao. 2. Sự khác nhau về mặt di truyền giữa các quần thể không lớn. 3. Quần thể dê cỏ Ba Vì và Thanh Hoá có sự lai tạp giữa các giống. 4. Đối với quần thể dê cỏ Sơn La hệ số cận huyết là. cách di truyền giữa các quần thể. - Một số công thức liên quan ñến cấu trúc quẩn thể: Một số cách tính tiện lợi cho cấu trúc quần thể là giá trị thống kê F ñược Wright phát triển (1965). Giá