Trong chăn nuôi hiện nay việc chuẩn đoán , phát hiện bệnh sớm để điều trị kịp thời sẽ làm giảm thiệt hại
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VÂN ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN VÂN ANH PGS. TSKH. NGUYỄN LÊ TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM ƠN Tơi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tơi trong suốt thời gian học tập. - Các Thầy Cơ trong Bộ mơn Cơng nghệ sinh học cùng các Thầy Cơ đã ln tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tơi. - TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Các chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, Đỗ Thị Châm, Dƣơng Ngọc Diễm, Võ Thị Mỹ Dun, Lạc Thị Thêm, Dỗn Thị Sim thuộc phòng Miễn dịch viện Pasteur Tp. HCM đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tơi trong suốt thời gian thực hiện khố luận. - Thầy Lê Anh Phụng, cơ Nguyễn Thị Kim Loan phụ trách phòng thí nghiệm Vi Sinh và các thầy cơ thuộc Bệnh xá Thú y đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tơi trong suốt thời gian qua. - Tồn thể lớp CNSH27 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tơi trong suốt thời gian làm đề tài. Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình ln tạo điều kiện và động viên con trong suốt q trình học tập tại trƣờng. Chân thành cảm ơn. Tháng 08 năm 2005 Nguyễn Vân Anh iv TÓM TẮT NGUYỄN VÂN ANH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli” Hội đồng hƣớng dẫn: 1. TS. Nguyễn Ngọc Hải 2. PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2/2005 đến tháng 8/2005 Địa điểm nghiên cứu: Viện Pasteur Tp. HCM Bệnh xá Thú y Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM Phòng thí nghiệm Vi Sinh. Đánh giá chất lƣợng kháng huyết thanh thu đƣợc ở hai qui trình gây đáp ứng miễn dịch ngắn ngày và dài ngày. Đề tài thực hiện trên 2 lô thỏ thí nghiệm đƣợc gây miễn dịch theo hai qui trình khác nhau: qui trình ngắn ngày (35 ngày) và qui trình dài ngày (154 ngày). Kháng huyết thanh thu đƣợc từ hai qui trình tủa trong amonium sulfate bão hòa và có thể phục hồi bằng phƣơng pháp thẩm tích. Hiệu quả đáp ứng miễn dịch của hai qui trình đƣợc đánh giá qua phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính (định tính) và phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm (định lƣợng). Ngoài ra để tăng cƣờng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ngƣng kết kháng huyết thanh đƣợc xử lí gắn với Staphylococcus aureus và hấp phụ với kháng nguyên vi khuẩn K88 + . Kết quả đạt đƣợc: 1. Cả hai qui trình ngắn ngày và dài ngày đều gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ. 2. Phát hiện đƣợc kháng thể trong kháng huyết thanh sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. 3. Xác định đƣợc nồng độ S. aureus thích hợp để gắn với KHT nhằm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. KHT đƣợc xử lí gắn với S. aureus (nồng độ 10 14 tế bào/ ml) và tỉ lệ thể tích KHT : S. aureus là 1:4. 4. Hiệu giá kháng thể ngƣng kết ở qui trình dài ngày cao hơn qui trình ngắn ngày. 5. Tách kháng thể ra khỏi kháng huyết thanh bằng cách tủa trong muối amonium sulfate bão hòa. 6. Hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu trong kháng huyết thanh. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn . iii Tóm tắt . iv Mục lục . v Danh sách các chữ viết tắt ix Danh sách các hình . x Danh sách các bảng xi Danh sách các biểu đồ . xii Danh sách các sơ đồ . xiii 1. MỞ ĐẦU . 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ . 1 1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU . 2 1.2.1. Mục đích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH . 3 2.1.1. Khái niệm miễn dịch 3 2.1.2. Kháng nguyên 3 2.1.2.1. Định nghĩa 3 2.1.2.2. Khái niệm về epitop . 3 2.1.3. Kháng thể dịch thể . 4 2.1.3.1. Định nghĩa . 4 2.1.3.2. Cấu trúc của một phân tử immunoglobulin . 4 2.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của động vật 5 2.1.4.1. Loài động vật . 5 2.1.4.2. Yếu tố di truyền 5 vi 2.1.4.3. Kháng nguyên . 6 2.1.4.4. Qui trình gây miễn dịch . 7 2.1.4.5. Chất bổ trợ . 8 2.1.5. Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể 9 2.1.5.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể . 9 2.1.5.2. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể . 11 2.2. VI KHUẨN E. coli 14 2.2.1. Định nghĩa 14 2.2.2. Đặc tính sinh hóa 14 2.2.3. Yếu tố kháng nguyên . 14 2.2.3.1. Kháng nguyên thân O 14 2.2.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K 15 2.2.3.3. Kháng nguyên lông roi H . 15 2.3. TÁCH KHÁNG THỂ BẰNG AMMONIUM SULFATE 15 2.4. HỒI CHẾ KHÁNG THỂ BẰNG PHƢƠNG PHÁP THẨM TÍCH 16 2.5. PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ 17 2.5.1. Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) . 17 2.5.2. Các đặc tính chung của sự liên kết KN-KT . 17 2.5.3. Phản ứng ngƣng kết KN-KT 18 2.5.3.1. Phản ứng ngƣng kết KN-KT xảy ra theo 2 pha . 18 2.5.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng ngƣng kết KN-KT 19 2.6. PROTEIN A 19 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 21 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 21 3.1.1. Thời gian thực nghiệm . 21 3.1.2. Địa điểm . 21 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU . 21 3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 21 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22 3.4.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ . 22 3.4.1.1. Chuẩn bị dịch tiêm 22 3.4.1.2. Tiêm thú thí nghiệm . 22 vii 3.4.1.3. Bố trí thí nghiệm . 23 3.4.2. Thu nhận kháng huyết thanh 25 3.4.2.1. Tách kháng thể bằng amonium sulfate bão hoà 26 3.4.2.2. Phục hồi kháng thể . 26 3.4.3. Xử lí kháng huyết thanh . 27 3.4.3.1. Hấp phụ kháng thể không đặc hiệu . 28 3.4.3.2. Gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus . 29 3.4.4. Đánh giá . 30 3.4.4.1. Định tính (bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính) . 30 3.4.4.2. Định lƣợng (định hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm) 31 3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI . 32 3.6. XỬ LÍ KẾT QUẢ 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 33 4.1. KẾT QUẢ . 33 4.1.1. Định tính 33 4.1.1.1. Qui trình ngắn ngày 33 4.1.1.2. Qui trình dài ngày 34 4.1.2. Định lƣợng . 34 4.1.2.1. Qui trình ngắn ngày . 35 4.1.2.2. Qui trình dài ngày 36 4.1.2.3. Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch ở 2 qui trình 37 4.1.3. Xử lí tăng độ nhạy của kháng huyết thanh . 38 4.1.3.1. Xác định nồng độ S. aureus thích hợp gắn với kháng huyết thanh . 38 4.1.3.2. Kiểm tra phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh xử lí gắn S. aureus 38 4.1.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh . 40 4.2. THẢO LUẬN . 42 4.2.1. Định tính 42 4.2.2. Định lƣợng . 43 4.2.2.1. Qui trình ngắn ngày . 43 4.2.2.2. Qui trình dài ngày . 43 viii 4.2.3. Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết thanh 44 4.2.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh . 44 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 46 5.1. KẾT LUẬN 46 5.2. ĐỀ NGHỊ 46 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 7. PHỤ LỤC . 49 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT APC Antigen-presenting cell (Tế bào trình diện kháng nguyên) E. coli Escherichia coli Ig Immunoglobulin (Globulin miễn) IL Interleukine KHT Kháng huyết thanh KN Kháng nguyên KT Kháng thể KN-KT Kháng nguyên – Kháng thể MHC II Major histocompatibility complex class II antigens (các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II) S. aureus Staphylococcus aureus. SIg Surface immunoglobulin (Globulin miễn màng tế bào) TCR T cell receptor (Thụ quan bề mặt tế bào T) T H lympho T helper cell (tế bào lympho T hỗ trợ) x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cấu trúc tổng quát phân tử kháng thể 4 Hình 2.2 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu lộ trên bề mặt tế bào . 10 Hình 2.3 Phức hợp KN- MHC lớp II gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4 + trên tế bào T H . 10 Hình 2.4 Cấu trúc đặc trƣng của tế bào tƣơng 11 Hình 2.5 Đáp ứng của tế bào B với kháng nguyên và mối liên hệ giữa sự đáp ứng này với hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh 12 Hình 2.6 Sự khác biệt giữa KN phụ thuộc tuyến ức và KN không phụ thuộc tuyến ức trong kích hoạt đáp ứng ở tế bào B 13 Hình 2.7 Đáp ứng tạo kháng thể khác nhau tùy vào KN phụ thuộc tuyến ức hay không phụ thuộc tuyến ức. KN không phụ thuộc vào tuyến ức không gây ra sự thay đổi từ sản xuất IgM sang IgG 13 Hình 2.8 Trên bao thẩm tích có các lỗ nhỏ cho phép các phân tử muối đi ra ngoài còn KT bị giữ lại 17 H ình 2.9 Phản ứng ngƣng kết do kháng thể tạo nên . 19 Hình 2.10 Kháng thể IgG gắn với protein A của S. aureus 20 Hình 3.1 Tủa kháng huyết thanh . 26 Hình 3.2 Dịch kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate trƣớc và sau thẩm tích 27 Hình 3.3 Phản ứng ngƣng kết trên phiến kính 30 Hình 3.4 Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm 32 Hình 7.1 Thỏ nuôi thí nghiệm . 50 Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai . 50 Hình 7.3 Tiêm dƣới da 50 [...]... ở Vi t Nam vi c sản xuất kháng huyết thanh và kháng thể phục vụ cho vi c chẩn đoán bệnh bằng miễn dịch học trong chăn nuôi còn ít, chỉ mới áp dụng cho một số bệnh Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó chúng tôi đi vào nghiên cứu đề tài “Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn E coli” để phục vụ cho vi c chẩn đoán nhanh và điều trị bệnh kịp thời Ngoài ra có thể ứng dụng vào sản xuất kháng huyết. .. kháng nguyên không chịu nhiệt, bị phá hủy sau khi đun nóng 100oC trong 1h Do đó, sau khi đun nóng huyễn dịch vi khuẩn có thể gây ngƣng kết với kháng huyết thanh O mà không gây ngƣng kết với kháng huyết thanh K b Kháng nguyên K type A Là kháng nguyên vỏ có bản chất là polysaccharide, vi khuẩn có kháng nguyên này khi mọc trên môi trƣờng sẽ cho khuẩn lạc dạng nhầy và chỉ cho kết quả ngƣng kết của kháng nguyên. .. kết kháng nguyên O Hiện nay ngƣời ta đã phát hiện hơn 100 loại kháng nguyên K (Øiskov et al, 1971) [9] Kauffmann chia kháng nguyên K thành 3 nhóm dựa vào ảnh hƣởng của nhiệt độ đến phản ứng ngƣng kết, tính kháng nguyên và khả năng vi khuẩn gắn kết với kháng thể a Kháng nguyên K type L Là kháng nguyên vỏ có bản chất protein, giúp vi khuẩn có khả năng bám dính và cho phản ứng ngƣng kết với hồng cầu Là kháng. .. phản ứng với kháng huyết thanh đặc hiệu Chúng giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của các dòng vi khuẩn và một trong số các kháng nguyên này có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ Hiện nay ngƣời ta đã phát hiện hơn 160 loại kháng nguyên O (R.J.Gross và B.Rowe, 1985) [9] 15 2.2.3.2 Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K Kháng nguyên K nằm ở bề mặt tế bào nên là nguyên nhân không... quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh thỏ 1 và thỏ 2 35 Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh thỏ 3 và thỏ 4 36 Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ ở qui trình ngắn ngày và dài ngày 37 Bảng 4.6 Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh gắn S aureus ở các... cộng lực kháng nguyên Nếu cùng một lúc gây mẫn cảm nhiều loại kháng nguyên cho con thú thì kháng thể đặc hiệu đƣợc sinh ra tƣơng ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất ngang bằng hoặc nhiều hơn khi kháng nguyên đó kích thích một mình Hiện tƣợng này gọi là sự cộng lực kháng nguyên hay cộng kích thích kháng nguyên Tuy nhiên cũng có trƣờng hợp cùng một lúc gây mẫn cảm cho thú với hai loại kháng nguyên: ... nghiệm pháp IMViC phù hợp 2.2.3 Yếu tố kháng nguyên 2.2.3.1 Kháng nguyên thân O Các kháng nguyên O có bản chất lipopolysacharide (LPS) Những kháng nguyên này bền với nhiệt độ và cồn Theo Leminor, kháng nguyên O thƣờng đặc trƣng cho từng loài (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Hải, 1999) Các kháng nguyên O có thể đƣợc phát hiện bằng phản ứng ngƣng kết Để thực hiện phản ứng này, huyễn dịch vi khuẩn phải đƣợc... lượng kháng nguyên Nếu lƣợng kháng nguyên quá ít thì không đủ gây đáp ứng miễn dịch Ngƣợc lại nếu lƣợng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch Ở các mũi nhắc nên giảm lƣợng kháng nguyên 2 – 3 lần so với gây mẫn cảm để tăng ái lực của kháng thể cần tạo nên f Đường xâm nhập của kháng nguyên vào cơ thể Kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch mạnh nhất khi chúng đƣợc tiêm trực tiếp vào hạch bạch huyết. .. thể ứng dụng vào sản xuất kháng huyết thanh kháng các vi sinh vật gây bệnh quan trọng khác 2 1.2 MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích Xây dựng và hoàn thiện quy trình sản xuất kháng huyết thanh phục vụ cho công tác chẩn đoán bệnh 1.2.2 Yêu cầu Xây dựng quy trình tiêm thỏ thí nghiệm Thu nhận kháng huyết thanh từ thỏ thí nghiệm Đánh giá chất lƣợng kháng huyết thanh thu đƣợc 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI... giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 (qui trình dài ngày) 41 xi DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 TRANG Biến đổi hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 theo thời điểm lấy mẫu 35 Biểu đồ 4.2 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích của thỏ 2 36 Biểu đồ 4.3 Hiệu giá kháng . THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli Giáo vi n hƣớng dẫn: Sinh vi n thực hiện: . bệnh. Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó chúng tôi đi vào nghiên cứu đề tài “Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn E. coli” để phục vụ cho vi c