slide Sắc ký lớp mỏng trong hóa thực vật

slide Sắc ký lớp mỏng trong hóa thực vật tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả...

SẮC KÝ LỚP MỎNG

GVHD:

NGUYỄN THỊ DiỆP CHI SVTH:NGUYỄN TRỊNH BẢN

DIỆP THỊ KIM CƯƠNG

KHÁI QUÁT CHUNG

Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatograpy)

Nhanh, gọn, tiện lợi, nhận biết biết nhanh số lượng thành phần có trong hỗn hợp thông

qua hệ số lưu, dựa trên tính phân cực.

=> TLC dùng chất hấp phụ làm pha tĩnh trải

thành lớp mỏng Quá trình tách khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đã có mẫu.

CƠ CHẾ SẮC KÝ LỚP MỎNG

Pha tĩnh: chất hấp phụ trải thành lớp mỏng, mịn, đồng nhất được cố định trên phiến kính, kim loại hay nhựa; thường là silicagel, aluminium oxide, hoặc

cellulose phủ trên mặt phẳng chất trơ

Pha động: hệ đơn thuần một dung môi hay hỗn

hợp nhiều dung môi phối hợp với nhau theo tỷ lệ quy định

Trong quá trình sắc ký các cấu tử trong mẫu thử di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau dẫn đến việc tách – phân bố vị trí

khác nhau trên lớp mỏng => Sắc ký đồ

Dựa vào cơ chế, TLC thành 4 loại

Sắc ký hấp phụ

Sắc ký phân bố

Sắc ký trao đổi ion

Sắc ký rây phân tử

Sắc ký hấp phụ

Sự khác nhau ái lực hấp phụ của các chất đối với pha tĩnh và được biểu thị qua hằng số hấp phụ

Chất tan bị giữ lại trên bề mặt rắn (hấp phụ) và

bị dung môi động đẩy ra (phản hấp phụ)

Chất có ái lực mạnh sẽ đẩy chất yếu hơn về phía trước làm cho bề mặt không có khoảng trống và sắc ký đồ tạo thành vệt dài

Tốc độ di chuyển và khả năng tách phụ thuộc vào sự có mặt của tạp chất và bề mặt riêng

Sự cân bằng phụ thuộc nồng độ, nhiệt độ, áp suất

Sắc ký phân bố

Pha tĩnh: chất lỏng không tan với pha động và

được gắn vào một chất mang thích hợp

Pha động: chuyển dịch trên pha tĩnh kéo theo

những chất cần tách và những chất nầy được phân bố giữa hai pha cho tới khi hình thành trạng thái cân

bằng

Hệ số phân bố khác nhau của mỗi chất với pha

động, tĩnh

Chú ý:

SKLM tẩm những chất ưa dầu (pha tĩnh không phân

cực) và pha động phân cực => Sắc ký phân bố

pha đảo dùng tách chất kỵ nước

Pha tĩnh thường H2O, pha động chất hữu cơ không

hòa tan trong H2O nhưng có cho thêm H2O hay đã được làm bão hòa nước

Tách chất có độ phân cực TB, pha tĩnh là dung môi

phân cực không bay hơi: formamid, PEG Pha

động là chất lỏng không phân cực như

cloroform…

Sắc ký trao đổi ion:

Pha tĩnh: Chất có khả năng trao đổi ion với ion chất cần phân tích (nhựa, dẫn chất cellulose)

Ái lực khác nhau của các ion trong mẫu và pha tĩnhNhựa trao đổi ion chứa nhóm hóa học thích hợp:

Cationit:

R-H+ + Na+ R-Na+ + H+

Anionit:

R-OH- + Cl- R-Cl- + OH

-Sắc ký rây phân tử

Sự tách dựa trên kích thước phân tử khác nhau của

chất tan để lọt sâu vào trong các hốc của pha tĩnh Các chất có kích thước phân tử nhỏ thì lọt vào

trong các hốc của pha tĩnh và bị giữ lại đó sẽ ra

sau Chất có kích thước phân tử lớn nằm ngoài các hốc này sẽ ra trước

Pha tĩnh: Gel (thường là gel Sephadex) dùng để tách

các chất có phân tử lượng khác nhau Một số loại Gel sephadex: G-50, G-75, G- 100, G-150

Silicagel có chất dính và chất chỉ thị huỳnh quang:

13% bột bó, chất chỉ thị huỳnh quang Silicagel GF254 (Merek Anasil)

Silicagel không có chất dính:

Silicagel H của Merek Anasil D-O (camag)

Silicagel không có chất dính, có chất chỉ thị:

HF254 (Merek), DF-O (Camag)

Silicagel đã silan hóa dùng cho TLC pha đảo:

PF254 silanized RP-2…

Dung môi

Dung môi € 0 Dung môi € 0

Ete dầu hỏa 0.01 Ete etylic 0.38 Hexan 0.01 Chloroform 0.40 Heptan 0.01 Metylen

chcloride 0.42Cyclohexan 0.04 Dicloetan 0.49 Cacbon

tetrecloride 0.18 Acetone 0.56Ete

Bình sắc ký

• Đáy tròn, vuông hoặc chữ nhật

Lựa chọn điều kiện sắc ký

Chọn pha tĩnh:

Bản chất chất cần tách

Chọn bản mỏng, chất hấp phụ thích hợp

Chọn dung môi:

Khả năng hòa tan được mẫu

Tra cứu tài liệu tìm dung môi (nếu có)

Chọn dung môi theo độ phân cực tăng dần



Quá trình và kỹ thuật sắc ký

Chuẩn bị bản mỏng

Bản mỏng, bình sắc ký thích hợpChuẩn bị dung môi

Chấm dung dịch lên bản mỏng

Khai triển sắc ký

Giải ly để dung môi giải ly di chuyển xuốngGiải ly để dung môi giải ly di chuyển lên

Giải ly nhiều lần liên tiếp

Giải ly hai chiều

Phát hiện vết

Phương pháp vật lý:

Đèn chiếu tia UV 254nmĐèn chiếu tia UV 366nmPhương pháp hóa học:

Thuốc thử đặc trưngThuốc thử không đặc trưng

Tìm hiểu sơ bộ về mẫu chất khảo sát

Chuẩn bị cho việc sắc ký cột

Sự tách sắc tố thực vật

Hóa chất và nguyên liệu

thực vật tươi (fresh leaves)

Thiết bị và dụng cụ

Máy sấy quay, bình TLC 22 x 22 x10

bản silicagel TLC ( DC- Alufolien, F254 Kieselgur

Kieselgel 60/, Art.5567 Merck)

cái cọ, cái cối và chày

Phễu tách 100ml, 5 ống đong 25ml, ống đong 100ml, erlen

Hazards and safety precautiona:

ete dầu hỏa dễ cháy, tính độc hại thay đổi theo thành phần => tránh phải sự hít vào

Acetol và isopropanol có tính cháy cao

Dung môi khai triển (pha động):

100ml ete dầu hỏa, 11ml isopropanol

Chuẩn bị bình sắc ký:

Dm khai triển cho vào bình bao trùm đáy một độ sâu 0.5cm Đậy nắp, chờ dm bão hòa hơi nước.

Chiết sắc tố lá (extraction of the leaf pigment):

Lá tươi nghiền với 22ml acetol, 3ml dầu hỏa và một thìa CaCO3, dd sau lọc cho vào phễu tách cùng 20ml ete dầu hỏa và 20 ml NaCl 10% Chờ dd tách lớp, lớp dưới cho vào becker, lớp trên đem rửa 3-4 lần với 5ml nước Rồi cho vào Erlen và làm khô với 4 thìa Na2SO4, sau đó rót vào bình đáy tròn sấy còn

khoảng 3ml

Chấm dịch chiết lên bản mỏng:

Vẽ 1 đường thẳng cách đáy bản 1.5 cm bằng viết chì, dùng ống pasteur chấm dịch chiết lên bản, lặp lại

nhiều lần đến khi có màu xanh đậm, vết chấm kế

tiếp được thực hiện sau khi được sấy khô vết chấm

Thí nghiệm:

Bản được đặt cẩn thận vào bình với hàng kẽ mẫu

ở đáy, giử thẳng không cho chạm vào thành

bình, đậy bình, giử bản mỏng đứng yên, khi

dung môi khai triển được ¾ bản thì lấy bản ra

và đánh dấu vết ngay lập tức

Sắc tố lá được tách bằng TLC

Kết quả và thảo luận:

Khi chấm mẫu lên bản bởi

mao quản, thành phần của

hỗn hợp sắc tố được phân ra

bởi pha động và pha tĩnh

(silicagel), tùy vào sự hấp

thụ khác nhau và độ mạnh

của dung dịch Thành phần

nào mạnh sẽ giử lại pha tĩnh,

thành phần yếu di chuyển

cùng pha động Tuy nhiên,

tốc độ di chuyển tùy thuộc

vào dịch triết trong dung môi

Sự tách hổn hợp nhuộm Lipophilic

Hóa chất:

Yellow, Sudan Blue II, Sudan Red G and

Indophenol in toluene)

Blue II each dissolved in toluene

Glass wares and materials:

 Bình sắc ký: (jam glass with a screw cover,

h = 11 cm d = 5 cm)

 DC plate POLYGRAM® ALOX N/UV254

(Macherey Nagel)

 Mao quản thủy tinh (1 µL)

Toluene rất độc khi hít vào, ăn vào hay hấp thụ vào

da, gây kích thích nghiêm trọng, sinh quái thai học

=> Kính bảo hộ an toàn và găng tay được yêu cầu Thí nghiệm được thực hiện trong một tính rõ ràng toàn diện, tuân thủ qui định PTN, đảm bảo an toàn

Thí nghiệm:

Một đường thẳng được vẽ cách đáy bản 1 cm bằng viết chì Dùng mao quản 1µl chấm dung môi

tham khảo ở vị trí 1 & 3, vị trí 2 là hỗn hợp

nhuộm Thao tác lấy mẫu cần nhanh, gọn

Khi hơi dung môi bảo hòa, bản mỏng đưa vào cẩn thận với hàng kẽ mẫu ở dưới và tránh sự tiếp xúc của dung môi và mẫu thử Đậy nắp bình, giử cố định bản mỏng, khi mức dung môi lên khoảng ¾ bản thì lấy ra và đánh dấu vị trí của các mẫu tại thời điểm đó

Kết quả:

Mẫu thử tách ra nhiều thành phần, mức độ phân chia có thể

quan sát sự di chuyển của điểm màu Qua đó, so sánh với dung môi tham khảo.

Cơ sở quá trình

Phân tích định tính những thành phần cần tách trong TLC được dựa vào sự so sánh tỷ lệ di trú của các chất Nhân tố duy trì, giá trị Rf đựơc sử dụng đặc trưng và so sánh những thành phần của những

mẫu khác nhau

Giá trị Rf đựơc tái tạo, không khí trong bình khai

triển phải bảo hòa với dung môi, thành phần của pha động và nhiệt độ phải không thay đổi

Kết luận

SKLM là phương pháp phân tích cơ bản không thể thiếu được đối với các nhà hóa học cũng như các nhà phân tích và trở thành một phương pháp chính thức trong nghiên cứu phân tích và kiểm tra chất lượng sản phẩm ở Việt Nam và các nước khác

Tính linh động trong quá trình sắc ký

Chi phí, thời gian phân tích tiết kiệm

Thiết bị gọn, đơn giản

Ứng dụng trong nhiều lĩnh vực

Tự động hóa một vài bước, tăng độ dung giãi và cho

số liệu chính xác hơn, cần cải tiến vài bước

=> Sắc ký lớp mỏng hiệu năng

CHÂN THÀNH CẢM ƠN CÔ

VÀ CÁC BẠN ĐÃ CHÚ Ý

THEO DÕI!