Sắc ký lớp mỏng trong hóa thực vật

Sắc ký lớp mỏng trong hóa thực vật tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả các lĩ...

SẮC KÍ LỚP MỎNG (THIN LAYER CHROMATOGRAPHY)

-˜—µ–™ -A Mục tiêu:

 Cơ chế chính trong SKLM

 Trang thiết bị trong SKLM

 Các bước tiến hành SKLM

 Phạm vi ứng dụng của SKLM

 Ứng dụng SKLM trong hóa thực vật

B Nội dung:

I KHÁI QUÁT CHUNG:

Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC) còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), là kỹ thuật sắc ký khá nhanh gọn và tiện lợi Nó giúp nhận biệt nhanh về số lượng thành phần có trong hỗn hợp đem sắc ký… determining their purity and the following the grogress of reaction It also permits the optimization of the solvent system for the given seperation problem In comparison with the column chromatography, it only requires small quantities of the compound and is muchs faster

as well Trong phương pháp sắc ký lớp mỏng, thành phần trong hỗn hợp được xác định nhờ so sánh hệ số lưu của hỗn hợp Rf và hệ số lưu Rf của một số chất đã biết

Định nghĩa:

TLC là một phương pháp sắc ký dùng chất hấp phụ làm pha tĩnh trản thành lớp mỏng trên tấm kính, nhựa hay kim loại Quá trình tách các chất xảy ra khi pha động là dung môi di chuyển qua pha tĩnh Do đó, TLC là sắc ký lỏng, có thể là sắc ký lỏng – lỏng hay sắc ký lỏng – rắn

Về mặt lý thuyết cũng như về chủng loại các pha tĩnh và pha động, về mặt TLC và sắc ký lỏng trên cột khá giống nhau Vì thế TLC có thể dùng để tìm các điều kiện tối

ưu cho sự tách bắng sắc ký lỏng trên cột

II CÁC CƠ CHẾ TRONG SẮC KÝ LỚP MỎNG:

Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao gồm:

Pha tĩnh là chất hấp phụ trải thành lớp mỏng, mịn, đồng nhất được cố định trên phiến kính, kim loại hay nhựa; thường là silicagel, aluminium oxide, hoặc cellulose phủ trên mặt phẳng chất trơ

Pha động là một hệ dung môi đơn thuần hay hỗn hợp nhiều dung môi phối hợp với nhau theo tỷ lệ quy định

Sắc ký được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt các chất phân tích Trong quá trình sắc ký các cấu tử trong mẫu thử di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau dẫn đến việc tách – phân bố khác nhau trên lớp mỏng Kết quả thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng, ở đó các thành phần của mẫu thử phân bố rãi rác theo các đường đi của dung môi động

Dựa vào cơ chế, TLC chia thành 4 loại:

Sắc ký hấp phụ

Sắc ký phân bố

Sắc ký trao đổi ion

Sắc ký rây phân tử

II.1 Sắc ký hấp phụ

Sự tách chủ yếu dựa vào ái lực hấp phụ khác nhau của các chất đối với chất hấp phụ rắn (pha tĩnh) và được biểu thị thông qua hằng số hấp phụ

Trong sắc ký hấp phụ, pha tĩnh là chất rắn có khă năng hấp phụ Chất tan bị giử lại trên bề mặt pha tĩnh (chất hấp phụ) và bị dung môi động đẩy ra (phản hấp phụ) Mức

độ tách trong sắc ký hấp phụ phụ thuộc nhiều về bề mặt của chất hấp phụ đã được tán nhỏ nên bột chất hấp phụ phải rất mịn Silicagel và nhôm oxide là những chất hấp phụ hay được dùng, nhất nhưng silicagel được dùng hơn cả Đây là hai chất hấp phụ ưa nước nên các chất cần tách càng phân cực càng bị lưu giữ mạnh và ra chậm khi phản hấp phụ

Sự hấp phụ các dung dịch không đơn giản như đối với chất khí vì chất được hòa tan và dung môi tranh giành nhau các điểm hấp phụ trên bề mặt chất hấp phụ Do đó trong quá trình khai triển, pha động chạy qua pha tĩnh, các chất cần tách hòa tan trong dung dịch bị hấp phụ giử lại trên bề mặt chất hấp phụ rắn trong khi dung môi là chất lỏng luôn di động kéo theo chất phân tích nhiều hay ít tùy thuộc vào lực phản hấp phụ của dung môi và đặc tính của chất cần cần phân tích Như vậy, quá trình sắc ký là quá trình hấp phụ và phản hấp phụ liên tục trên bề mặt chất hấp phụ cho đến khi đạt tới trạng thái cân bằng và dẫn tới sự phân bố khác nhau của chất phân tích trên lớp mỏng Cân bằng nầy phụ thuộc nhiều vào áp suất, nhiệt độ và nồng độ

Khi hệ dung môi có chứa chất khác ngoài chất phân tích và các chất này lại gần nhau về mặt hóa học, có ái lực tương tự và mạnh hơn đối với chất hấp phụ thì xảy ra

sự tranh giành bề mặt chất hấp phụ Chất có ái lực mạnh sẽ đẩy chất yếu hơn về phía trước làm cho bề mặt chất hấp phụ không có khoảng trống và sắc kí đồ tạo thành vết dài Chính hiện tường này làm cho tốc độ di chuyển và khả nắng tách của các chất trong sắc kí hấp phụ phụ thuộc nhiều vào sự có mặt của tạp chất hơn là sắc ký phân bố

II.2 Sắc ký phân bố

Sắc ký phân bố là sự phân tách của một hỗn hợp giữa hai pha chất lỏng luôn tiếp xúc với nhau nhưng không hòa tan vào nhau

Trong sắc ký phân bố, pha tĩnh là một chất lỏng không hòa tan với pha động (dung môi) và được gắn vào một chất mang thích hợp Pha động chuyển dịch trên pha tĩnh kéo theo những chất cần tách và các chất này được phân bố giữa hai pha cho tới khi hình thành trạng thái cân bằng Hằng số cân bằng tùy thuộc vào dung môi và bản chất chất phân tách

Phuơng trình Nerst chỉ ra sắc ký phân bốự phân bố của một chất giưữa hai pha lỏng không hòa tan vào nhau

const C

C

=

=

2

2

α

Trong đó α là hệ số phân bố: C1, C2 là nồng độ chất tan trong 2 pha

Hệ số phân bố ảnh hưởng lớn đến tốc độ di chuyển của chất

Mổi chất có một hệ số phân bố khác nhau, do đố khi khai triển sắc ký, các chất trong hỗn hợp sẽ di chuyển nhanh hay chậm trên pha tĩnh và dần dần tách xa nhau

Chú ý:

Sắc ký trên những lớp mỏng có tẩm những chất ưa dầu như parafin là một phương pháp phân bố Ở đây do có mặt của một pha tĩnh không phân cưc và một pha di động phân cực nên được gọi là sắc ký pha đảo, dùng tách những chất kỵ nước

Khi sử dụng sắc ký phân bố để tách một hỗn hợp những chất ưa nước, thườg dùng pha tĩnh là nước, pha động là một dung môi hữu cơ không hòa tan trong nước nhưng

có cho thêm nước hay đã làm bão hòa nước

Khi cần tách những chất có độ phân cực trung bình, người ta dùng một số dung môi phân cực không bay hơi làm pha tĩnh như formamid, polyethylenglycol (PEG), pha động là các chất lỏng không phân cực

Trong TLC thường gặp các hiện tượng phân bố và hiện tượng hấp phụ chồng chéo nhau khi dùng nước làm dung môi và chất hấp phụ có hoạt độ kém, sự phân bố xảy ra trước sự hấp phụ

II.3 Sắc ký trao đổi ion:

Pha tĩnh trong sắc ký trao đổi ion là các chất có khả năng trao đổi ion (nhựa trao đổi ion hoặc dẫn chất của cellulose) với ion chất cần tách trong dung dịch phân tích

Sự phân tách ở đây xảy ra do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch cần tách với các ion trong pha tĩnh.sự trao đổi ion này được đặc trưng bằng hằng số trao đổi ion Nhựa trao đổi ion hay được dùng làm pha tĩnh hơn cả Các nhựa này có chứa các nhóm hóa học có thể trao đổi được với các ion trong dung dịch chất phân tích Tùy theo khả năng trao đổi với cation hay anion của nhựa trao đổi ion (ionit) mà ta có nhựa trao đổi cation (cationit) hay anion (anionit)

Cationit có 2 loại : cationit acid mạnh có nhóm - HSO3 được ứng dụng rộng rãi, cationit acid yếu có nhóm - COOH-H+

Anionit cũng có 2 loại : anionit base mạnh có nhóm amoni bậc 4 -

(CH3)3+OH- và anionit yếu có nhóm amin bậc 2 hay bậc 3

Phản ứng trao đổi giữa cationit R với cation (ví dụ với ion natri) xảy ra như sau :

R - H+ + Na+ R - Na+ + H+

Phản ứng trao đổi giữa anionit R với anion (ví dụ ion clorid) xảy ra như sau:

R - OH- + Cl- R - Cl- + OH

-Trong sắc ký trao đổi ion, người ta cho dung dịch chứa các ion cần tách chạy qua cột nhựa đã lựa chọn Các ion của nhựa sẽ trao đổi với các ion của dung dịch Các ion đã trao đổi này phần lớn nằm trong dung dịch và sẽ được hấp phụ khá nhanh ở dỉnh cột Sau đó dùng một dung môi thích hợp cho chảy qua cột để phản hấp phụ các ion này

II.4 Sắc ký rây phân tử:

Sự tách dựa trên kích thước phân tử chất tan để lọt sâu vào trong các lỗ hoặc các hốc của pha tĩnh Các chất có kích thước phân tử nhỏ thì lọt vào trong hốc của pha tĩnh

và bị giữ lại đó sẽ ra sau Các chất có kích thước phân tử lớn sẽ nằm ngaòi các hốc này

do đó sẽ ra trước

Pha tĩnh là các gel, hay gặp gel sephadex dung để tách các chất có phân tử lươngj khác nhau.Một số laọi gel Sephadex được dung trong TCL như 50, 75,

G-100, G-150, G-200

III TRANG THIẾT BỊ

Chất hấp phụ giữ các chất được hấp phụ bởi những lực tĩnh điện, những lực này gây nên sự gắn bó của mạng tinh thể Các lực tĩnh điện bề mặt tạo ra các momen lưỡng cực trong những hợp chất không phân cực hay làm tăng những momen đã có

sẵn trong các hợp chất phân cực Nhờ đó, những lưỡng cực ion những lực sinh ra giữa

2 lưỡng cực là nguyên nhân sinh ra sự liên kết giữa chất bị hấp phụ và bề mặt của chất hấp phụ Đôi khi những cầu hydro cũng tham gia vào sự liên kết giữa chất hấp phụ và chất bị hấp phụ

Hàm lượng nước trong chất hấp phụ có tầm quan trọng quyết định tới hoạt độ của các chất hấp phụ vì các phân tử nước dễ bị hấp phụ nên dễ chặn các điểm hoạt động trên bề mặt chất hấp phụ

Chất hấp phụ dùng trong sắc ký lớp mỏng là loại bột rất mịn (cỡ hạt 5 - 40µm )

Có nhiều loại chất hấp phụ được dùng trong sắc ký lớp mỏng, sau đây giới thiệu một vài loại thông dụng :

III.1.1 Silicagel :

Là chất hấp phụ thông dụng nhất Cũng như các chất hấp phụ khác, silicagel có những “trung tâm hoạt năng” hợp thành bởi các góc, cạnh những lỗ xốp hay điểm khuyết ở bề mặt, ở những nơi đó, ion dễ lộ ra ngoài Mặt khác silicagel được điều chế

từ tủa keo acid silisic ngưng tụ, keo này có chứa các phân tử nước trong khe của các mạng tinh thể Khi được sấy, một phần nước bốc hơi, bị loại ra khỏi mạng tinh thể nhưng cấu trúc vẫn giữ nguyên, nước bốc hơi tạo thành những lỗ hổng có tác dụng hút rất mạnh các phân tử nước hay phân tử các chất phân cực khác vào khung cấu trúc của nó

Kích thước hạt ảnh hưởng tới tốc độ dịch chuyển, kích thước lỗ hổng ảnh hưởng nhiều đến khả năng hấp phụ Silicagel dùng cho TLC trên thị trường thường có kích thước hạt từ 5 - 40µm và đã được loại tạp chất như sắt, nhôm… Hơn nữa, trên bề mặt của silicagel có các nhóm OH tự do làm cho lớp mỏng có tính acid nhẹ (pH 4-5), do

đó, khi phân tích các chất có tính base cần chú ý vì các chất này thường bị giữ lại ở đường khởi điểm Để khắc phục, người ta dùng các pha động có tính kiềm hoặc thêm một lượng KOH hoặc dung dịch đệm calci hydroxyd hoặc natri citrat vào silicagel khi tráng bản mỏng Để mở rộng phạm vi áp dụng cho TLC, người ta còn gắn các mạch hycarbon (có từ 2-18 cacbon) vào nhóm OH trên bề mặt của silicagel (silan hóa) để tạo

ra các pha tĩnh không phân cực dùng trong sắc ký lớp mỏng pha đảo (RPTLC -Reversed phase thin layer chromatography) như RP-2,… RP-18 Có trường hợp, người ta còn cho tẩm silicagel với 20% bạc nitrat và có hoặc không có 10% chất dính calci sulffat Loại này dùng tách các chất chứa liên kết đôi ( đồng phân cis- trans và mức độ bão hòa)

Tóm lại, khả năng hấp phụ của silicagel phụ thuộc cỡ hạt, trạng thái bề mặt và hoạt năng của nó

Silicagel có loại không có chất dính, có loại có thêm chất dính để cố định bản mỏng Chất dính thông dụng là calci sulfat (bột bó)với tỷ lệ 5 - 15% Ngoài ra còn cho thêm các chất chỉ thị huỳnh quang như kẽm silicat ở bước sóng 254nm hoặc muối natri của acid hydroxypurene - sulfonic ở 366nm, silicagel loại này dược ký hiệu là

F254 hoặc F366 Đôi khi người ta còn cho thêm 1 số acid như acid oxalic, acid sulfuric vào silicagel khi tráng bản mỏng để tách các hợp chất acid hoặc tẩm bản mỏng với dầu parafin, silicon…để tách các chất ưa dầu

Có nhiều hãng sản xuất silicagel dùng cho TLC Dưới đây là một số loại silicagel dùng trong TLC hay gặp :

a) Silicagel có chất dính

Silicagel có 13% bột bó,loại này thông dụng nhất : Silicagel G (Anasil) ; Silicagel G (loại 60) của Merck…

Silicagel có 5% bột bó, đóng gói 1,5kg : Silicagel D-5, DS-5 (Camag)

b) Silicagel có chất dính và chất chỉ thị huỳnh quang.

Silicagel có 13% bột bó và chất chỉ thị huỳnh quang : Silicagel GF254 (Merck, Anasil)

c) Silicagel không có chất dính

Silicagel H của Merck, Anasil,D-O (Camag) Loại này kém bền vững

d) Silicagel không có chất dính, có chất chỉ thị : HF254 (Merck),DF-O (Camag)

e) Silicagel đã silan hóa dùng cho TLC pha đảo: PF254 silanized RP -2…

Silicagel được bán ở dạng gói 500g, 1kg, 5kg hay ở dạng bản mỏng tráng sẵn trên kính, nhôm, polyester Gần đây trên thị trường còn bán bản mỏng hiệu năng cao với các loại chất hấp phụ khác nhau nhưng chủ yếu là Silicagel và C18

III.1.2.Nhôm oxyd :

Sau silicagel, nhôm oxyd là loại chất hấp phụ hay được dùng Nhôm oxyd là loại chất hấp phụ có hoạt tính cao Người ta sản xuất nhôm oxyd ở 3 dạng nhôm oxyd kiềm, acid và trung tính dể tách các loại hợp chất khác nhau Khi dùng nhôm oxyd, để

có kết quả lặp lại tốt, cần phải kiểm soát được tỷ lệ nước trong nhôm để đảm bảo được hoạt độ của nó Muốn vậy, cần hoạt hóa bản mỏng ở 75 - 1100C trước khi dùng Loại thường dùng là nhôm oxyd trung tính, nó có thể tách các hợp chất terpen, alcaloid, chất béo và nhân thơm Nhôm oxyd mất hết hoạt tính được dùng để phân tích các chất phân cực như acid amin

Cũng như silicagel, nhôm oxyd cũng được trộn chất dính hay không trộn chất dính, có hoặc không có chất chỉ thị huỳnh quang và cũng có các ký hiệu như silicagel

Ví dụ nhôm oxyd G (có chất dính), GF (có chất dính và chất chỉ thị huỳnh quang) Ngoài ra còn có nhôm oxyd loại T (có chất dính, không có chỉ thị huỳnh quang) dùng

để tách các peptid, steroid

Các bản mỏng nhôm oxyd tráng sẵn trên kính cũng được bán trên thị trường

III.1.3 Cellulose:

Silicagel và nhôm oxyd là 2 chất hấp phụ vô cơ chủ yếu để tách các chất béo

hoặc những chất hòa tan trong dung môi hữu cơ Cellulose lại là một chất hấp phụ hữu

cơ chủ yếu dùng tách các chất thân nước như đường, amino acid,ion vô cơ, dẫn chất acid nucleic Lớp mỏng cellulose được gắn trên tấm kính, nhựa , nhôm không khác nhiều so với sắc ký giấy Dung môi khai triển, thuốc thử phát hiện dùng cho lớp mỏng cellulose giống như sắc ký giấy Quá trình tách xảy ra trên cellulose chủ yếu là quá trình phân bố Có 2 loại bột cellulose phù hợp với TLC là cellulose dạng sợi tự nhiên

và cellulose vi tinh thể Việc áp dụng đối với 2 loại cellulose này đôi khi không giống nhau.Một số loại cellulose đã được xử lý hóa học dùng cho TLC được bán trên thị trường như: Cellulose dạng sợi ‘’Cellulose 300’’, Microcrystalline, tên thương mại là Avicel, DEAE (Diethylaminoethyl), carboxymethyl (CM) là những chất hấp phụ trao đổi ion được dùng rộng rãi để tách các chất có phân tử lượng lớn Acetylated cellulose dùng cho sắc ký pha đảo

III.1.4 Kieselgur hay cát biển:

Là loại bột nhẹ, màu vàng xám chứa khoảng 70-95% SiO2, phần còn lại gồm các oxit nhôm, Fe, Mg, Ca, P, S Các tính chất, thành phần, haọt độ và kích thước của

hạt Kieselgur thay đổi tùy theo hãng sản xuất Kieselgur là một chất hấp phụ yếu,

dùng tách các chất phân cực như cetoacid, lacton, và thường dùng làm chất men cho pha tĩnh trong sắc ký phân bố Đôi khi người ta còn sử dụng hỗn hợp Kieselgur - thạch cao và Kieselgur –silicagel với tỉ lệ 1:1

III.1.5 Thạch cao

Được điều chế bằng cách trộn dung dịch CaCl2 và H2SO4 với tỉ lệ đồng phân tử, đun 70-80oC , gạn lấy CaSO4, rửa tới trung tính, sấy 48 giờ ở 115-1200C

III.1.6 Các chất khác:

Polyamid: Khả năng tách trên lớp mỏng polyamid phụ thuộc vào lực liên

kết hydro được hình thành giữa phân tử polyamid và chất cần tách Lớp mỏng polyamid được dùng để tách các chất phenol, acid carboxylic, steroid, quinon, hợp chất nitro thơm

Nhựa trao đổi ion laọi ionit vô cơ – hữu cơ: là loại silicagel được sunfon

hóa (hoặc gắn các gốc có khả năng trao đổi ion khác); đó là catonit có nhóm –SO3H nên có thể sử dụng trong môi trường acid mạnh

Sephadex: Sephadex là tên thương mại dùng để chí một nhóm các gel

dextran đã được biến đổi

III.2 Bản mỏng

Các bản mỏng dùng để sắc kí chia làm hai loại: bản mỏng dính chắc và bản mỏng

không dính chắc

- Bản mỏng dính chắc : dùng chất hấp phụ đựợc trộn thêm 5-15% chất kết dính

(thạch cao, tinh bột, dextrin) Bản mỏng có thể chuẩn bị bằng cách sau:

Dùng các tấm kính có kích cở khác nhau đã rửa sạch bằng sulfocromic, xà phòng, nước và sấy khô Chuẩn bị bột nhão (ví dụ nước và silicagel có 5% thạch cao

tỷ lệ 2:1) bằng cách nghiền kỹ bột, thêm khoảng 70% lượng nước, đánh đều không để

có bọt, thêm nốt nước trộn đều, tất cả làm trong khoảng 1-2 phút Rải ngay hỗn hợp lên kính để được các lớp mỏng khoảng 0.25-0.3mm

Với các tấm kính lớn, thường rải lớp mỏng bằng dụng cụ riêng.Với tấm kính nhỏ

có thể đổ hỗn hợp lên các tấm kính rồi nghiêng, lắc đều lớp mỏng, để các bản mỏng nằm trên mặt phẳng khoảng 15-20 phút cho se lại rồi sấy 30 phút ở 1100C để haotj hóa lớp mỏng Bản mỏng đượ cất trong bình hút ẩm

Nếu tráng bản mỏng bằng tay như trên có thể dùng tỉ lệ nước cao hơn

- Bản mỏng không dính chắc: rãi bột có hoạt độ thích hợp lên tấm kính (kính mở

càng tốt) và rải đều một đũa thép hai đầu dầy khoảng 0.5-1 mm hoặc một đũa thủy tinh

2 đầu lồng 2 đoạn ống cao su Có thể rải bằng dụng cụ riêng

III.3 Dung môi

Đây là yếu tố có thể thay đổi để đạt được mục đích phân tách, việc lựa chọn dung môi không có một quy tắc nào cụ thể mà thường phải sắc ký sơ bộ để thăm dò hệ dung mooi thích hợp

Nếu mẫu phân tích có ái lực yếu với chất hấp phụ nên dùng chất hấp phụ có hoạt tính cao và dung môi ít phân cực

10*20cm 20*30cm 5*20cm

Nếu mẫu thử có khả năng bị hấp phụ mạnh thì nên dùng chất hấp phụ có hoạt tính yếu và dung môi phân cực mạnh Hệ dung môi chọn càng đơn giản càng tốt và luôn dùng loại dung môi tinh khiết

Việc lựa chọn dung môi và chất hấp phụ rất quan trọng cần được căn cứ vào một

số yếu tố sau:

+ Tính chất của hỗn hợp cần phân tách (độ hòa tan, độ phân cực, số lượng và đặc tính các nhóm chức hóa học)

+ Khả năng hấp phụ của pha tĩnh

+ Độ bay hơi, độ nhớt, sự phân lớp và độ tinh khiết của hỗn hợp dung môi Một số nhóm chức có khả năng hấp phụ theo thứ tự tăng dần như sau:

CH=CH2 <OCH3 < C=O < CHO <SH < NH2 < OH < COOH

Bảng 1 Các dung môi với sức rửa giải tăng dần (ε0 tăng dần )

Eyte dầu

Dimetyl

Cyclohexa

Cacbon

Ete

Dãy này sắp xếp theo khả năng đẩy các chất ra khỏi nhôm oxit Nhưng với silicagel ta cũng có dãy tương tự

Muốn có dung môi với giá trị trng gian không có trong bảng ta dùng hỗn hợp dung môi theo tỉ lệ thích hợp

III.4 Bình sắc ký

Gồm những bình đáy tròn, vuông, hoặc chữ nhật

Tròn Φ12cm,cao 30 cm

Vuông 24x24 cm

Chữ nhật 20x30 cm

IV.CÁCH LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

IV.1 Chọn pha tĩnh

Trong phần trên đã đề cập đến việc chọn lựa các loại chất hấp phụ thích hợp Khi muốn tách một chất nào đó từ một hỗn hợp, trước hết ta phải biết ít nhiều về tính chất, độ phân cực của chất cần tách để lựa chọn chất hấp phụ cho phù hợp (loại chất hấp phụ, mức độ hoạt hóa…) Nếu không ta có thể sấy bản mỏng ở 1100C trong 30 phút

Nói chung, trong các chất hấp phụ đã nêu ở trên, silicagel hay dược dùng nhất,

nó có thể được dùng để phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau Đối với chất ưa dầu,

ví dụ như tinh dầu, acid béo…ta có thể dùng lớp mỏng silicagel hoặc nhôm oxyd nhưng cần sấy kỹ hơn để có hoạt năng cao, tăng khả năng hấp phụ của các chất hấp phụ ưa nước này Ngược lại, với các chất ưa nước, ta chỉ cần sấy nhẹ để thu được bản mỏng có hoạt năng thấp Với chất có độ phân cực trung bình, chọn bản mỏng có độ phân cực trung bình

IV.2 Chọn dung môi

Thông thường, trong TLC, trước hết người ta chọn hệ dung môi thích hợp trước khi thay chất hấp phụ khác Nên chọn dung môi nào có khả năng hòa tan được mẫu

Có thể tra cứu tài liệu để tìm dung môi cần dùng nếu có Nếu không ta phải lựa chọn dung môi dựa vào bảng sắp xếp các dung môi theo độ phân cực tăng dần (lực phản hấp phụ tăng dần) sau đây:

Bảng 2: Sắp xếp các dung môi theo độ phân cực tăng dần

(lực phản hấp phụ tăng dần)

Lực

phản

hấp

phụ

tăng

dần

Ether dầu hoả Ether dầu hoả (độ sôi 30 - 500C) Cyclohexan Ether dầu hoả (độ sôi 50 - 700C)

Ether dầu hoả (độ sôi 70 - 1000C) Carbon tetraclorua Carbon tetraclorua

Methylen clorid Aceton tuyệt đối

Ethyl acetat Ester của acid béo

Pyridin methylen cloridEthylen clorid,cloroform và

Nước pyridinAcid có trộn thêm base, nước, alcol,

Hỗn hợp dung môi cũng được sắp xếp theo lực phản hấp phụ tăng dần theo thứ tự sau: ether dầu hoả; ether dầu hoả và benzen với tỷ lệ tăng dần (10,20,50%); benzen; hỗn hợp benzen với ethanol theo tỷ lệ tăng dần (2,5,10,20%)

Các dãy trên chỉ có giá trị đối với chất hấp phụ hút nước (silicagel, nhôm oxyd) Ngoài ra còn có thể chọn nhanh một dung môi khai triển bằng “vi kỹ thuật vòng” theo cách làm như sau:

Chấm dung dịch chất phân tích tai 3 điểm khác nhau trên bản mỏng Sau đó dùng pipet hút dung môi đặt nhẹ vào từng vết chấm, để dung môi từ từ di chuyển ra xung quanh và quan sát Nếu chất thử không có màu, phun thuốc thử thích hợp để hiện màu Với một hỗn hợp chất chưa biết, trước tiên ta thử với dung môi ít phân cực Nếu thấy chất thử nằm tại điểm chấm không di chuyển thì ta chọn dung môi khác có độ phân cực lớn hơn dung môi vừa thử Hoặc nếu chất thử di chuyển quá nhanh và không tách

ra được, chọn dung môi ít phân cực hơn

Nói tóm lại, khi chất phân tích hòa tan trong một dung môi hữu cơ khan, có ái lực yếu đối với chất hấp phụ ưa nước thông thường, người ta sẽ dùng những chất hấp phụ “mạnh” và những dung môi “yếu” Ngược lại, dùng những chất hấp phụ “yếu” và dung môi “mạnh” khi ái lực của chất phân tích với chất hấp phụ “mạnh”

Ta thấy muốn tách chất ít phân cực, phải dùng một chất hấp phụ có hoạt năng cao và một dung môi khai triển yếu (ít phân cực) và ngược lại

V QUÁ TRÌNH VÀ KỸ THUẬT SẮC KÝ

V.1 Chuẩn bị bản mỏng

Chuẩn bị bản mỏng và bình sắc ký thích hợp

Có 4 cách để tự tráng chất hấp phụ lên bản mỏng:

Trải

Rót

Phun

Nhúng

Chuẩn bị dung môi: cho dung môi vào bình, đậy nắp, quanh thành bình lót giấy lọc để

dung môi bão hòa được lâu hơn

V.2 Chấm dung dịch lên bản mỏng

Với lớp mỏng dính chắc có thể đnáh dấu đường xuất phát cách mép dưới khoảng 1-2cm Dùng ống mao quả hay micropipet chấm dung dịch lên bản mỏng cách

2 mép bên của bản khoảng 1-2 cm; khoảng cách giữa hai vết chấm cách nhau ít nhất 1

cm Khi chấm không được làm thủng lớp mỏng, vết chấm phải gọn, nhỏ chứa lượng chất thử khoảng 1-10μg Lượng chất chấm có ảnh hưởng tới sự di chuyển của vết, làm thay đổi vị trí của nó trên sắc kí đồ

Chuẩn bị tấm bản mỏng: Bản mỏng dùng để theo dõi sắc ký cột có thể tiết kiệm với chiều dài 5cm, bản dùng để đo Rf, để công bố kết quả phân tích nên có chiều dài 10cm

Từ tấm bản mỏng thương mại 20x20 cm dùng kéo cắt các bản với kích thước cần thiết, lưu ý sao cho tấm bản mỏng lọt vào bình giải ly

Dùng bút chì vạch nhẹ các nét mức xuất phát và mức tiền tuyến của dung môi

Chuẩn bị dung dịch mẫu:

Mẫu lỏng chấm trực tiếp lên bản mỏng, dung dịch sệt thì phải pha loãng, mẫu là chất rắn phải hòa tan với dung môi thích hợp nồng độ 2-5%

V.3 Khai triển sắc ký

Đặt bản mỏng vào bình triển khai Chú ý cho lượng dung môi sao cho các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi Đậy kín bình và để triển khai ở nhiệt độ từ 20 0 C đến 25 0 C và tránh ánh sáng mặt trước Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện vết theo chỉ dẫn trong tiêu chuẩn Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf và tiến hành định tính, phát hiện tạp chất hoặc định lượng như quy định trong tiêu chuẩn riêng

Các phương pháp khai triễn sắc ký:

Giải ly để dung môi giải ly di chuyển xuống

Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên

Giải ly nhiều lần liên tiếp

Giải ly hai chiều

Kỹ thuật SRS

Kỹ thuật sắc ký chế hóa

V.4 Phát hiện vết

Với chất có màu thì có thể quan sát vết ở ánh sáng thường

Với các chất không có màu phải phát hiện bằng nhiều cách khác nhau:

Phương pháp vật lý:

 Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 366 nm với những chất phát huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại

 Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm với bản mỏng có trộn chất phát huỳnh quang

Phương pháp hóa học:

 Thuốc thử không đặc trưng: Nó tạo vết có màu hầu hết các hợp chất

Ví dụ: iod, acid sufuric, chất chỉ thị huỳnh quang

 Thuốc thử đặc trưng: Nó tác dụng với những hợp chất có chứa những nhóm chức hóa học đặc biệt tạo màu đặc trưng

Ví dụ: dinitrophenyllhydrazin tác dụng với những hợp chất có chứa nhóm cacbonyl tạo màu đỏ đậm

Có nhiều loại thuốc thử đặc trưng cho những hợp chất hữu cơ khác nhau:

 Hợp chất hữu cơ

 Các loại hrocacbon

 Cachalogenuralcan

 Các aldehyd, ceton

Muốn khảo sát các bản mỏng bằng các thuốc thử đặc trưng ta phải thấm bản mỏng vào thuốc thử, có thể thục hiện theo hai cách: