xác định gen

DANH SÁCH NHÓM 1. HUỲNH YẾN NHI 08115131 2. VÕ KIM OANH 08109221 3. NGUYỄN VĂN PHONG 08101551 4. BÙI THÀNH DANH 08091601 5. ĐINH HỒNG SƠN 08224981 6. LÊ QUANG BÁ DUY 08121641 Kỹ thuật xác định gene  Khi nhận được một đoạn trình tự ta không thể chắc chắn đoạn trình tự đó có phải là gene hay không hay là một vùng trình tự nào khác trên DNA.  Để xác nhận được điều đó ta cho đoạn gen đó dịch mã thành protein sau đó ta xác định tên của protein đó rồi suy ngược lại tên của đoạn gene.  Nếu đoạn trình tự đó không thể dịch mã tạo thành protein ta đi đọc trình tự đoạn trình tự đó để có thể xác định chính xác đoạn trình tự ta có là gì.  Sau khi đoạn gene được dịch mã ta có thể xác định protein đó bằng các kháng thể hay các protein chức năng.  Dựa vào các tương tác vật lí giữa các protein ta có thể xác định protein ta đang có từ đó xác định tên của đoạn gene. Kỹ thuật xác định gene  Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.  Áp dụng phương pháp sàng lọc miễn dịch.  Dựa vào các protein chức năng.  Dựa vào tương tác của đoạn gene với các tác nhân xung quanh nó.  Nhờ vào sự biểu hiện của các phase. Kỹ thuật xác định gene (Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.) Ý tưởng cơ bản của kiểu qui trình sàng lọc này là có thể giữ lại được DNA chứa trong mỗi bản sao trên một màng lai nitrocellulose ( ngày nay người ta thường dùng màng lai được làm từ nylon). Màng nitrocellulose điển hình có khả năng tiếp nhận 100μg DNA/cm 2 , trong khi màng nylon có khả năng tiếp nhận 500μg DNA/cm 2 . Mặt khác màng nylon có khả năng giữ DNA chắc hơn và ít đứt gãy hơn) . Những khuẩn lạc của vi khuẩn - có chứa plasmid tái tổ hợp - được chọn để sàng lọc thì phát triển trên những đĩa agar mỏng chứa đựng những kháng thể thích hợp, cho phép sự phát triển của những tế bào chứa đựng những plasmid tái tổ hợp. Kỹ thuật xác định gene (Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.) Kỹ thuật xác định gene (Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.) Khi khuẩn lạc vi khuẩn phát triển, một tấm nylon được đặt trên đỉnh của chúng và sau đó được nhấc ra để sản xuất một phiên bản bản sao của đĩa. Một phần của mỗi khuẩn lạc sẽ dính vào tấm nylon được nhấc ra và rời khỏi đĩa agar cùng với nitrocellulose. Sau đó tấm nylon bản sao được xử lí theo những cách khác nhau để ly giải vi khuẩn và gắn chặt DNA vào đĩa. Các bước tiến hành xử lí màng lai:  Tấm nylon được xử lí với kiềm (0.5 M NaOH) để bắt đầu vừa ly giải tế bào vi khuẩn và biến tính DNA.  Khi trung hòa, tấm nylon được xử lí bằng protease (ví dụ như proteinase K)  Sau đó tấm nylon được nung ở 80◦C, hoặc xử lí bằng tia UV, để chắc chắn DNA bám lên màng. Kỹ thuật xác định gene (Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.) Sau khi DNA đã được cố định trên màng lai ta thiết kế các đoạn mồi (probe) các đoạn này đã được đánh dấu đồng vị phóng xạ thả vào trong màng lai như vậy theo nguyên tắc bổ sung các đoạn mồi sẽ tìm được đoạn nucleotide mà ta quan tâm. Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò. (probe) DNA có đánh dấu. Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung (giữa DNA trên màng lai với mẫu dò) để đánh dấu người ta thường sử dụng P 32 , biotin/streptavidin hoặc một mẫu dò phát quang sinh học. Kỹ thuật xác định gene (Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.) Tùy theo đoạn gene ta quan tâm mà ta thiết kế đoạn probe khác nhau Cc oligonucleotide mẫu dò tương đng chứa ít nhất một phần của chuỗi nucleic acid chính xác của dòng cDNA mong muốn Thông thường, đoạn bắt nguồn từ một đầu hoặc đầu khác của dòng hiện có được phân lập, đánh dấu phóng xạ in vitro và dùng để thăm dò thư viện. Lai với các mẫu dò tương đồng thường được tiến hành dưới các điều kiện nghiêm ngặt (stringency). Cc oligonucleotide mẫu dò nhân to: Các oligonucleotide mẫu dò nhân tạo là các đoạn nucleotide của trình tự xác định được tổng hợp in vitro. Trình tự của các mẫu dò này được suy luận, bằng cách dùng mã di truyền, từ các vùng ngắn của chuỗi amino acid đã biết của protein quan tâm. Do sự thoái biến (degeneracy) của mã di truyền, chuỗi amino acid đề xuất có thể không được đặc trưng chính xác bởi các oligonucleotide đơn được dự đoán cho trình tự. Mặc dù, trong rất nhiều trường hợp, trình tự các amino acid giống nhau có thể được đặc trưng bởi nhiều oligonucleotide khác nhau. Kỹ thuật xác định gene (Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.) Sau khi đoạn mồi đã dò tìm và gắn với đoạn gene mà ta đang quan tâm lúc này ta cần tìm vị trí của đoạn gene trên màng lai, lúc này tùy vào đồng vị phóng xạ ta dùng lúc đầu mà ta có cách xác định khác nhau. Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, nếu sử dụng biotin/streptavidin thì dùng phương pháp so màu hoặc nếu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học thì phát hiện bằng sự phát quang. Các phương pháp được sử dụng để hỗ trợ cho kỹ thuật này là SOUNTHEN BLOT, WESTERN BLOT [...]... hoá promotor và sản phẩm của gen “báo cáo” được phát hiện Ngược lại , nếu hai protein X và Y không tương tác với nhau thì tác động của chúng đối với promotor là riêng rẽ do đó không có sản phẩm của gen “báo cáo” Kỹ thuật xác định gene ( hệ thống lai kép ) a Phức hệ phiên mã gồm AD và BD b Sử dụng phức hệ phiên mã để nghiên cứu tương tác hai protein X và Y Kỹ thuật xác định gene ( dựa vào chức năng )... chứa hàng triệu protein khác, sau đó có thể khuếch đại gen mã hóa protein này và xem đó như một phần của bộ gen của thực thể Kỹ thuật xác định gene ( kỹ thuật phage display ) Thư viện phage được dùng để chọn lọc ở đây là một đoạn kháng thể chuỗi nặng ( sdAb ) Phần virus trong kỹ thuật này thường dùng filamentous bacteriophage M13 Kỹ thuật xác định gene ( kỹ thuật phage display )     Cấu trúc của... Kỹ thuật xác định gene ( dựa vào chức năng ) Ta có một ví dụ: Hệ gen của nấm men có chứa gene mã hóa cho enzyme immidazole glycerol phosphate dehydrat Đây là enzyme cần thiết cho sự tổng hợp amino aicd histidine mang tên là HIS3 Vi khuẩn E.coli lại chứa gene khiếm khuyết histidine mang tên là HIS B Ta biến nạp vào cơ thể E.coli một thư viện các tính trạng được biểu hiện ở nấm men, lúc này các gene HIS... dịch mã của gen ‘báo cáo” xảy ra, còn khi chỉ có một trong hai nhân tố trên thì sản phẩm của gen ‘báo cáo” không được tổng hợp Kỹ thuật xác định gene ( hệ thống lai kép ) Qui trình thực hiện: Muốn nghiên cứu tương tác protein X và Y Người ta tiến hành tách dòng gen mã hoá cho hai protein này và lần lượt gắn vào hai vectơ AD và BD Sau đó hai vectơ cùng được biến nạp vào dòng tế bào biểu hiện gen Kết quả... và kháng nguyên dẫn đến thế hệ sau của tế bào lympho B tiết số lượng lớn chất hòa tan hình thành bởi các thụ thể đặc biệt mà ta gọi các chất hòa tan đó là kháng thể Kỹ thuật xác định gene (Sàng lọc miễn dịch) Kỹ thuật xác định gene           (Sàng lọc miễn dịch) Cấu trúc một kháng thể: Kháng thể là những glycoprotein Cấu trúc gồm hai chuỗi nhẹ ( L ) và hai chuỗi nặng ( H ) Chuỗi nhẹ gồm 200... system )vì phương pháp này có nhiều ưu việt hơn hẳn các phương pháp khác Đặc biệt là độ chính xác và độ nhạy cao mà không phương pháp nào có thể đạt được Kỹ thuật xác định gene ( hệ thống lai kép ) Nguyên lí của phương pháp lai kép có thể được mô tả như sau: Việc hoạt động của promotor cho gen “báo cáo” (reporter genes) phụ thuộc vào hai nhân tố phiên mã: nhân tố hoạt hoá promotor AD (Activation Domain)...Kỹ thuật xác định gene (Sàng lọc miễn dịch) Sàng lọc miễn dịch là một phương pháp dùng để xác định các đoạn polypeptid từ các gene được nhân bản Việc phát hiện ra các chuỗi polypeptid thường được thực hiện bằng cách sử dụng các kháng thể Kháng thể khá đơn giản để tạo... thuật xác định gene ( kỹ thuật phage display ) Quá trình xâm nhiễm bắt đầu khi phage tiếp xúc với bề mặt vi khuẩn thông qua tương tác giữa pIII với F pilus của E coli Sau đó phage chuyển bộ gen của nó vào tế bào chủ và các protein vỏ gắn với màng vi khuẩn Bên trong vi khuẩn, bộ gen của phage chuyển thành DNA mạch kép (dsDNA) nhờ các enzyme của vi khuẩn và bắt đầu tổng hợp 11 protein của M13 Kỹ thuật xác. .. khỏi vi khuẩn Kỹ thuật xác định gene ( kỹ thuật phage display ) Sàng lọc phage display dựa trên nguyên lý chọn lọc ái lực và gồm các bước cơ bản sau: 1 khuếch đại thư viện và tạo phage 2 cho phage tiếp xúc với đích 3 loại bỏ phage không gắn bằng cách rửa 4 tách phage gắn 5 tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ để khuếch đại chúng lên Sau đó chu trình được lặp lại Kỹ thuật xác định gene ( kỹ thuật phage display... đầu tổng hợp 11 protein của M13 Kỹ thuật xác định gene ( kỹ thuật phage display ) Khi các protein của phage và bộ gen DNA mạch đơn tích lũy đủ trong vi khuẩn bị nhiễm, quá trình lắp ráp virion bắt đầu Các protein cấu trúc pVIII, pVII, pIX, pVI, và pIII đồng thời gắn với màng trong vi khuẩn và chờ đợi bộ gen DNA mạch đơn tái bản Khi đủ nồng độ, pV bọc bộ gen mạch đơn mới tổng hợp của phage và ngăn cản . tương tác vật lí giữa các protein ta có thể xác định protein ta đang có từ đó xác định tên của đoạn gene. Kỹ thuật xác định gene  Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.  Áp. plasmid tái tổ hợp. Kỹ thuật xác định gene (Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic acid.) Kỹ thuật xác định gene (Sàng lọc các đoạn gene bằng cách sử dụng màng lai nucleic. protein ta đi đọc trình tự đoạn trình tự đó để có thể xác định chính xác đoạn trình tự ta có là gì.  Sau khi đoạn gene được dịch mã ta có thể xác định protein đó bằng các kháng thể hay các protein