Xác định gen kháng kháng sinh từ dữ liệu giải trình tự bộ gen của chủng acinetobacter baumannii đa kháng lâm sàng

HỘI NGHỊ KHOA HỌC KỸ THUẬT ĐẠI HỌC Y DƯỢC Viện Pasteur TP HCM TP HỒ CHÍ MINH LẦN THỨ 34 Lê Võ Hồng Ngọc (BCV), Lê Thị Liên, Trần Thị Bích Phượng, Lê Quốc Thịnh*, Lê Hà Tầm Dương, Cao Thị Bảo Vân Viện Pasteur TP HCM * BV Nhi đồng I TP HCM 10/3/2017 TỔNG QUAN Acinetobacter baumannii • Vi khuẩn Gram âm • Tác nhân nhiễm khuẩn bệnh viện • Thuộc nhóm “ESKAPE”: Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa Enterobacter spp TỔNG QUAN Tình hình vi khuẩn kháng kháng sinh 2012 (n=132) 70.50% 70.50% 70.50% 65.90% 64.80% 59.50% 69.20% 69.70% 69.60% 68.50% 51.60% 53.20% 21.20% 0.00% Trần Thị Thanh Nga (2014) TỔNG QUAN Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn Nordmann et al (2012) TỔNG QUAN Phương pháp nghiên cứu kháng thuốc PCR, điện di trường xung, whole-genome shotgun - Ít thông tin - Nhiều bước - Tốn thời gian Whole genome sequencing (Next generation sequencing) - Nhanh chóng Lượng thông tin lớn Phân tích kết hợp Phát chế kháng MỤC ĐÍCH Xác định gene kháng kháng sinh công cụ tin sinh học từ liệu giải trình gene chủng A baumannii đa kháng phân lập lâm sàng • Lắp ráp gene phác thảo chủng A baumannii • Dò tìm gene kháng kháng sinh, đặc biệt gene kháng carbapenem • Dự đoán gene có tiềm liên quan tính kháng thuốc VẬT LIỆU Chủng A baumannii đa kháng thuốc phân lập từ bệnh phẩm dịch hút đờm bệnh nhi tháng tuổi Bệnh viện Nhi đồng TP HCM năm 2013 Đặc điểm kháng kháng sinh chủng A baumannii Nhóm Phân nhóm Tên kháng sinh Amoxicillinclavulanate Monobactam Aztreonam Cefuroxime Cefoxitine Beta-lactam Cephalosporin Ceftazidime Cefotaxime Imipenem Carbapenem Ertapenem Meropenem Gentamycin Aminoglycoside Kanamycin Tobramycin Quinolone Fluoroquinolone Ciprofloxacin Peptide Polymyxin Colistin Tetracycline Glycylcycline Tigecycline Cotrimoxazole Penicilin Đường kính kháng khuẩn (mm) MIC Kiểu hình (µg/ml) N/A Kháng 6 6 N/A 6 6 13 N/A N/A N/A N/A > 256 > 256 > 64 > 128 > 128 N/A N/A N/A N/A N/A Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Nhạy Kháng Kháng PHƯƠNG PHÁP Tách chiết DNA QIAamp DNA Blood Midi kit (QIAGEN) Chuẩn bị thư viện DNA Nextera XT (Illumina) Giải trình tự MiSeq (Illumina) với kích thước trình tự đọc 2x150 bp PHƯƠNG PHÁP (Spades) (Ragout) Chú giải gene (Res finder, CARD, ARG-ANNOT) 10 KẾT QUẢ 11 Bộ Gene Phác Thảo (Draft Genome) • Số lượng contig (≥ 500 bp): 119 • Contig dài 328.233 bp • N50: 100.121 • Chiều dài scaffold: 3.902.379 bp (9 gap) • Phần trăm GC: 38,96% • Độ bao phủ (coverage) trung bình contig scaffold: 79,6 12 Xác Định Gene Kháng Kháng Sinh  Bơm đào thải thuốc • Nhóm RND (Resistance-Nodulation-Division): adeABC, adeFGH, adeIJK • Nhóm MATE (Multi-antimicrobial extrusion protein): abeM • Nhóm SMR (Small Multidrug Resistance): abeS • Nhóm ABC (ATP-binding cassette): msrE 13 Xác Định Gene Kháng Kháng Sinh  Enzyme bất hoạt kháng sinh STT 10 11 Tên blaADC-25 blaTEM-1D blaOXA-23 blaOXA-66 aadA1 armA aph(3')-Ia aac(6')-Ib catB8 sul1 mphE Nhóm kháng sinh chịu tác động Beta-lactam (Cephalosporin, carbapenem…) Aminoglycoside (Gentamycin, kanamycin…) Fluoroquinolone, aminoglycoside Phenicol Sulphonamide Macrolide 14 Vòng 1: cấu trúc scaffold Vòng 2: gene phiên mã xuôi Vòng 3: gene phiên mã ngược Vòng 4: %GC Vòng 5: đường xiên GC Acinetobacter baumannii 3.902.379 bp 15 Xác Định Gene Kháng Kháng Sinh  Gene liên quan tính kháng carbapenem Penicillin-binding protein (PBP): • Nhóm có khối lượng phân tử cao: ponA, mcrB, pbpA ftsI • Nhóm có khối lượng phân tử thấp: dacC, dacD pbpG • Gene mtgA Porin: CarO, Opr 33-36, HMP-AB Không đột biến 16 Dự Đoán Gene Kháng Kháng Sinh Tiềm Năng  Enzyme: gene thuộc lớp metallo-beta-lactamase gene thuộc beta-lactamase lớp A  Bơm: STT Tên Nhóm ABC (ATP-binding cassette) Nhóm DMT (Drug metabolite transporter) Nhóm MATE (Multi-antimicrobial extrusion protein) Nhóm MFS (Major facilitator superfamily) Nhóm RND (Resistance-Nodulation-Division) Nhóm OEP (Outer membrane efflux protein) Số lượng gene 17 10 17 KẾT LUẬN • loại bơm đào thải kháng sinh • 11 gene mã hóa enzyme phân hủy kháng sinh, bao gồm gene blaOXA-23 blaOXA-66 • Nhiều gene kháng tiềm 18 Nghiên cứu tài trợ kinh phí Viện Nghiên cứu Y khoa Quân đội Hoa Kỳ (AFRIMS) Viện Sức khỏe Hoa Kỳ (NIH) 19 ... chế kháng MỤC ĐÍCH Xác định gene kháng kháng sinh công cụ tin sinh học từ liệu giải trình gene chủng A baumannii đa kháng phân lập lâm sàng • Lắp ráp gene phác thảo chủng A baumannii • Dò tìm gene... (µg/ml) N/A Kháng 6 6 N/A 6 6 13 N/A N/A N/A N/A > 256 > 256 > 64 > 128 > 128 N/A N/A N/A N/A N/A Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Kháng Nhạy Kháng Kháng PHƯƠNG... chủng A baumannii • Dò tìm gene kháng kháng sinh, đặc biệt gene kháng carbapenem • Dự đoán gene có tiềm liên quan tính kháng thuốc VẬT LIỆU Chủng A baumannii đa kháng thuốc phân lập từ bệnh phẩm