Dưới đây là một thí nghiệm ứng dụng kỹ thuật hệ thống lai kép với tế bào chủ là nấm men để nghiên cứu các protein tương tác với photphataza (TTP30). 1. Nguyên liệu ban đầu
Vật liệu và dòng tế bào dùng cho nghiên cứu: Thư viện gen (cDNA library) của Arabidopsis
Plasmid pGBT9 mang Gal4-BD và Trp và Plasmid pGAD424 mang Gal4-AD và Leu.
Dòng tế bào nấm men HF7C khuyết dưỡng Leu.,Trp.,và His.
Thư viện gen ( cDNA library) của Arabidopsis đã được gắn vào plasmid pGAD424 mang gen Leu
2. Hoá chất dùng cho nghiên cứu:
Sử dụng các cặp mồi dùng để tách dòng gen TTP30 và gắn vào vectơ pGBT9 như sau:F1,R1;F2,R2 và F3.
Các hoá chất tinh khiết dùng cho sinh học phân tử
Điều kiện phản ứng PCR: Hỗn dịch phản ứng 25 microlit, dNTP-0.25 microMol,
đệm tris có pH:8.0-10 mM,
MgCl2-1mM, DNA mồi (primer),-50ng, DNA khuôn (template) 10-20ng) ,
94oC:45s 55 oC:45s,
72oC :45s.
Các kỹ thuật sử dụng
Sử dụng các kỹ thuật di truyền như: tách, tinh sạch DNA, cắt với enzim giới hạn, gắn vào vectơ và biến nạp E.coli
Biến nạp vào nấm men
Các kỹ thuật phát hiện dòng tế bào biến nạp trên môi trường chọn lọc và sản phẩm của gen chỉ thị
1. Thu nhận dòng gen mã hoá cho TTP30 bằng kỹ thuật PCR.
Gen TTP30 của gen là protein có hai nhóm chức năng phân biệt là vị trí bám vào photphat : PB(435 bps ) và vị trí có độ lặp lại cao của 4 acid amin
TPR( 550bps ). Với mục đích tìm hiểu các protein tương tác với gen TTP30 cũng như với từng đoạn peptit PB và TPR chúng tôi dùng phản ứng PCR để thu được các đoạn gen mong muốn.
Khi dùng cặp mồi F1 và R1, chúng tôi nhận được gen đầy đủ chứa cả hai vị trí PB và TPR(1050bps) và khi dùng các cặp mồi F2, R2 và F3 ,R1 sẽ thu được các phần gen riêng biệt cho PB và TPR. Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ở hình2.
2. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ pGBT9 và biến nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C.
Các đoạn mồi đều mong vị trí cắt của enzim giới hạn SmaI.
Tiến hành cắt riêng rẽ các sản phẩm PCR và vectơ pGBT9 với SmaI . Sản phẩm PCR và vectơ tinh sạch lại được gắn với nhau nhờ ligaza(MPI) và được biến nạp vào E.coli (DH5anpha).
Nuôi cấy E.coli chứa plasmit pGBT9 mang các đoạn gen nghiên cứu , tiến hành tách plasmid và biến nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C.
Trên môi trường chọn lọc khuyết dưỡng triptophan chúng tôi thu được dòng tế bào biến nạp.
Sử dụng kỹ thuật PCR để kiểm tra các đọan gen đã được gắn vào vectơ pGBT9, kết quả kiểm tra được trình bày ở hình dưới
3. Tuyển chọn dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30.
Tiến hành tách plasmid pGAD424 mang cDNA biến nạp vào tế bào nấm men HF7C đã chứa plasmit pGBT9 mang các đoạn gen tương ứng TTP30,PB,TPR ở trên.
Các thể biến nạp được phát hiện trên các môi trường chọn lọc:
MT1 không chứa Leu và Trip (phát hiện hiệu quả và tần số biến nạp),
MT2 không chứa Leu, Trip và His (phát hiện dòng gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30)
Kết quả thí nghiệm cho thấy các dòng tế bào đều cho tần số biến nạp cao khi phát hiện trên môi trương MT1. Trên môi trường MT2 chúng tôi chỉ nhận được 5 khuẩn lạc với dòng tế bầo mang gen TTP30 trong khi đó không nhận được thể biến nạp nào với 2 dòng tế bào còn lại (PB và TPR). Để khẳng định các thể biến nạp thu được đã xác định hoạt độ betagalactosidaza và chỉ có hai thể biến nạp có hoạt tính. Đồng thời dùng phản ứng PCR để phát hiện đoạn gen cDNA khi dùng primer của plasmit pGAD424.
Kết quả xác định hoạt độ betagalactosidaza (a) và phản ứng PCR của hai thể biến nạp thu được
NHẬN XÉT:
Như vậy, khi dùng kỹ thuật lai kép với tế bào chủ là nấm men HF7C chúng tôi đã thu được 2 gen mã hoá cho protein tương tác với TTP30 có kích thước khoảng 1,6 kb ( kết quả PCR).Gen TTP30 có hai vùng chức năng PB và TPR nhưng không có biểu hiện tương tác với một protein nào từ thư viện gen cDNA , điều này có thể liên quan đến việc tách dòng riêng rẽ các vùng chức năng sẽ ảnh hưởng đến cấu hình không gian và làm thay đổi khả năng tương tác của chúng. Việc xác định loại gen và vùng tương tác của hai dòng gen thu được ở trên chỉ được thực hiện sau khi giải trình tự gen và axitamin của protein tương ứng kết hợp với kỹ thuật tạo đột biến điẻm trong các nghiên cứu tiếp theo