Cách pha chế một số thuốc nhuộm & thuốc thử

C Đặc tính và tác dụng Dạng bột màu đỏ - Dùng để chế phèn nhuộm cacmin Cacmin nhuộm thành tế bào sống thành màu đỏ C Cách pha thành thuốc nhuộm cacmin - Cho phèn chua đã giã nhỏ và bột c

Tập huấn sử dụng thiết bị dạy học sinh học

I Giới thiệu thiết bị tối thiểu – Môn sinh học

1 Tranh ảnh

Các mức cấu trúc NST

Các chu trình sinh địa hoá

Mối quan hệ họ hàng giữa ngời với một số vợn ngời

một số hoá thạch điển hình

Chuỗi thức ăn

Lới thức ăn

II Cách pha chế và sử dụng một số thuốc nhuộm, thuốc thử

1 cách pha và sử dụng một số thuốc nhuộm

a Cacmin

C Đặc tính và tác dụng

Dạng bột màu đỏ

- Dùng để chế phèn nhuộm cacmin

Cacmin nhuộm thành tế bào sống thành màu đỏ

C Cách pha thành thuốc nhuộm cacmin

- Cho phèn chua đã giã nhỏ và bột cacmin vào 1 cốc sứ

- Cho thêm một ít nớc, quấy đều rồi đem đun nhẹ trên đền cồn và quấy bằng đũa thuỷ tinh

- Sau 15 - 20 phút hỗn hợp sẽ sôi lăn tăn và có màu vàng, để nguội hỗn hợp sẽ rắn lại

- Sau 24h lấy ra, hoà thêm 100ml nớc cất đã đun nóng, lọc và bổ sung phenol

b Cácmin axetic

CDùng để nhuộm NST trong nhân tế bào

CCách pha:

- Cho 1,2 gam bột cacmin cùng 100ml axit axetic 45% vào một bình tam giác cỡ 500ml , lắc đều

- Đun sôi trong 1 giờ sau đó để nguội và lọc đợc thuốc nhuộm

c axeto ocxein

CDùng để nhuộm NST trong nhân tế bào

CCách pha:

- Cho 2 gam ocsein vào 45 ml axit axetic nóng, rồi làm lạnh sau đó thêm 55ml nớc cất ,lắc đều vào bảo quan trong hộp nâu

2 sử dụng một số thuốc Cố định

CPha dung dịch định hình có tính axit

Lấy 90 ml cồn etylic 50% hoà vào 5ml axit axetic đặc cộng với dung dịch fomalin 30% ( fomalin : nớc = 30 : 70) Lắc cho đều để vào lọ

CPha dung dịch định hình có tính bazơ

Lấy 5g crom sunfat với 1g đồng oxit, fomalin 30ml và nớc cất 70 ml Lắc đều cho vào lọ

CPha dung dịch định hình navaxin

pha axit cromic 1%: (1 g anhđric cromic + 100nớc cất)

Pha focmalin 16% : 16ml focmalin (40%) + 24ml nớc cất

<=> Khi sử dụng trộn 10 phần axit cromic 1% với 4 phần focmalin 16%

và 1 phần axit axetic đá sẽ đợc dịch định hình navaxin ( pha xong dùng ngay vì thuốc dễ bị phân huỷ )

únavaxin sử dụng để cố định các rễ non và đối tợng nhỏ, thời gian

cố đinh là 24h

CPha dung dịch cố định carnoy

- 6 phần cồn etilic (100%) + 3 phần clorofooc + 1 phần axit axetic

- dung dịch cố định carnoy ngấm nhanh vào hầu hết các tế bào nhng tác dụng không đều, không mền nh thuốc navaxin

sử dụng tốt cho việc phân tích tế bào và phôi thai học , thời gian cố

định 2 – 12 h

3 Một số nớc rửa sử dụng trong làm tiêu bản

v nớc javen

CDùng để tẩy sạch nội chất của tế bào

CCách pha

a 20g CaCl2 trong 100ml nớc cất và 25g K2CO3 ( NaCO3) trong 25

ml nớc cất Sau 1 ngày đêm trộn lẫn 2 loại trên

b Hoà tan 3g KCLO3 trong 25ml nớc cất Thêm 6 ml HCL đậm đặc,

đun nhẹ cho tan rồi để nguội

ú Trộn a với b và cho vào chai có nút kín để vài giờ sau đem lọc

c Hoà tan 10g Na2CO3 trong 200ml nớc rồi thêm dung dịch 5g Ca(CLO)2 trong 25ml nớc cất Khuấy đều để yên

ú Lọc tất cả các dung dịch trên ( a,b,c) phơi và đựng trong chai màu, nút kín

v Xylen

C Dùng để làm tiêu bản cố đinh, chống mốc, lau thị Kính và vật kính

v glixerin

C Dùng để lên lam kinh, làm mềm mẫu rắn, chống nhăn nhúm mẫu

v nớc glixerin

C Dùng để nhỏ lên lam kính, xem ngay

C Cách pha: 1glixerin + 1 nớc

4 Cách pha một số loại thuốc thử

v Thuốc thử Fehling

Fehling A: 40g CuSO4.5H20 hoà tan trong 1 lit nớc cất, nếu đục đem lọc

Fehling B: Hoà tan 200g muối seignet, 150g NaOH đổ lẫn vào nhau

và dùng nớc cất dẫn đến mức1 lit ( Hoặc: hoà tan 150g NaOH trong nớc cất, sau đó cho thêm 50ml glixerin vào dung dịch NaOH, khuấy đều, dùng nớc cất dẫn đến mức 1lít)

- Trớc khi dùng pha Fehling A với Fehling B đợc thứôc thử Fehling

v Thuốc thử liugol

Hoà tan 2,5 g KI trong 10ml nớc cất, sau đó cho 1g I2 vào dung dịch

KI, khuấy đều, kĩ cho I2 tan hoàn toàn Dùng nớc cất dẫn đến mức 100ml Bảo quản trong lọ màu

III Phơng pháp

Cân là dụng cụ dùng để xác định khối lợng của một vật, tính bằng các đơn vị nhất định nh kg, g và mg Cân thờng đợc dùng trong các thí nghiệm xác định sức hút nớc của hạt, cờng độ thoát hơi nớc của lá, khối lợng hạt, khối lợng lá …Tuỳ theo yêu cầu chính xác của thí nghiệm, có thể dùng cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01g hoặc cân phân tích có độ chính xác đến 0,0001g Trong các thí nghiệm phổ thông thờng sử dụng cân kỹ thuật dạng cân đĩa hoặc cân điện tự động

Cân là dụng cụ dùng để xác định khối lợng của một vật, tính bằng các đơn vị nhất định nh kg, g và mg Cân thờng đợc dùng trong các thí nghiệm xác định sức hút nớc của hạt, cờng độ thoát hơi nớc của lá, khối lợng hạt, khối lợng lá …Tuỳ theo yêu cầu chính xác của thí nghiệm, có thể dùng cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01g hoặc cân phân tích có độ chính xác đến 0,0001g Trong các thí nghiệm phổ thông thờng sử dụng cân kỹ thuật dạng cân đĩa hoặc cân điện tự động

A Cân đĩa kỹ thuật

Dùng để so sánh khối lợng của vật với khối lợng các quả cân

Trớc khi cân cần điều chỉnh cân về trạng thái cân bằng ( vị trí của kim ở trạng thái cân bằng), sau đó đặt vật cần cân lên đĩa bên trái và

đặt các quả cân lên đĩa bên phải đến khi khối lợng của vật cần cân

t-ơng ứng với khối lợng của các quả cân ( khi đó kim sẽ dừng lại ở vị trí cân bằng) Khối lợng của vật chính là tổng khối lợng của các quả cân

A Cân kỹ thuật dùng điện.

Có thể dùng cân nhanh khối lợng các vật, đặc biệt trong các thí nghiệm thoát hơi nớc của lá Khi cân, bật nút power, chọn chế độ cân theo đơn

vị gam, sau đó đa cân về vị trí cân bằng ( màn hình hiển thị 0,00 ), đặt vật cần cân lên đĩa cân, khối lợng của vật sẽ hiện trên màn hình của cân

L u ý:

Không đợc cân vật có khối lợng lớn hơn khối lợng cho phép đợc cân ( thờng < 200g )

Nếu phải cân nhiều mẫu thì trớc khi cân mẫu tiếp theo phải đa cân

về trạng thái cân bằng ( màn hình hiển thị 0,00 )

Tuyệt đối không để nớc và hoá chất đổ vào cân Nếu cân để lâu không dùng phải tháo pin

IV Cách pha dung dịch hoá chất

A Pha dung dịch theo nồng độ phần trăm(%)

Một dung dịch có nồng độ x% (theo khối lợng) là trong 100g dung dịch đó chứa x g chất tan

Ví dụ: pha dung dịch NaCl 15%, ta cân 15g NaCl cho vào ống đong rồi

đổ nớc cất đến 100ml

A Pha dung dịch theo trọng lợng phân tử.(nồng độ M)

Dựa vào trọng lợng phân tử của hoá chất cần pha, thêm nớc cất

đến mức 1 lít dung dịch

Ví dụ : muốn pha dung dịch NaCl 2M, ta cân :58,5 x 2 = 117g NaCl rồi bổ sung nớc cất đến mức 1 lít

A Pha dung dịch từ 2 dung dịch cùng loại đã biết trớc nồng độ:

Khi muốn pha một dung dịch có nồng độ trung bình từ một dung dịch

đặc và một dung dịch loãng, ta sử dụng phơng pháp sơ đồ đờng chéo

Ví dụ, muốn pha dung dịch 20% từ dung dịch 10% và 50%:

50 20 – 12 = 8

20

12 50 – 20 = 30

ú Vậy phải cần 8ml dung dịch 50% pha với 30ml dung dịch 12% để đợc dung dịch có nồng độ 20%

ú Vậy phải cần 8ml dung dịch 50% pha với 30ml dung dịch 12% để đợc dung dịch có nồng độ 20%

III Một số phơng pháp làm tiêu bản và quan sát tiêu bản

2 Cách làm tiêu bản

Bớc 1: chuẩn bị mẫu

thực vật : Mô phân sinh đầu rễ non ( chóp rễ)

Các rễ chính của hạt nảy mầm

Đỉnh sinh trởng của cây

Các lá non Các bao phấn non

Động vật : tế bào bạch cầu

tế bào tuỷ xơng

ú Tiêu chuẩn: tế bào dễ vỡ, NST có kích thớc lớn và dễ phân biệt với nhau

Bớc 2: Cố định mẫu ( Gồm các nội dung sau )

- Đổ dung dịch cố định vào lọ rồi thả mẫu ngập trong dung dịch cố định ngâm trong vài giờ

- Chọn thuốc cố định phù hợp với mục tiêu nghiên cứu

- Lợng dung dịch cố định nhiều gấp 50 -100 lợng mẫu

- Mẫu cố định phải tơi ( Cắ bỏ phần không cần thiết nếu mẫu có kích

th-ớc lớn)

- Rửa mẫu trong cồn 70% - 80% cho đến khi hết mùi axit axetic (Có thể giữ mẫu trong cồn 70% )

- Rửa mẫu trong nớc

Bớc 3: Th y phân mẫu: u

- Đun mẫu ơ nhiệt độ 600C trong HCl 1N, trong thơi gian 5 phút

Rửa mẫu lại trong nớc để loại trừ HCL

Bớc 4: Nhuộm tiêu bản trong thuốc nhuộm với thời gian 3 – 5 phút tuỳ loại mẫu ( nhuộm bằng cách nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản hoặc nhúng lam kính có tiêu bản vào thuốc nhuộm)

- Có thể rửa tiêu bản bằng nớc để loại bỏ thuốc nhuộm thừa

Bớc 5: Cho mẫu đã nhuộm lên lam kính , nhỏ vài giọt axit axetic 45%

hoặc cloranhiđrat, gạt bỏ các mô thừa, đạy lamen rồi ấn nhẹ lamen

dàn đều từ trong ra ngoài, tiêu bản đợc dàn mỏng

BÀI 3 HÌNH THÁI VÀ SỐ LƯỢNG NHIỄM SẮC THỂ

TRONG NGUYÊN PHÂN Ở THỰC VẬT

1 Mục đích, yêu cầu

- Nắm được quy trình và thực hành các thao tác làm tiêu bản ép quan sát hình thái, đếm số lượng NST trong nguyên phân ở tế bào thực vật

- Rèn luyện kỹ năng làm tiêu bản tạm thời, kỹ năng sử dụng kính hiển vi để quan sát tiêu bản NST

2 Chuẩn bị

• Hoá chất: Nước cất, cồn 100%, HCl 1N, dung dịch (3 cồn 100% : 1 axit axetic),

thuốc nhuộm Carmin

• Dụng cụ: Kính hiển vi quang học có độ phóng đại từ 100 đến 400 lần Cốc thuỷ

tinh, lọ thuỷ tinh nhỏ, đĩa đồng hồ, giấy thấm, ống nghiệm, đèn cồn, kéo nhỏ, dao lam, lam kính, lamen, bể đun ổn nhiệt, nhiệt kế

3 Nội dung

Nghiên cứu NST trong nguyên phân ở tế bào rễ hành.

- Chuẩn bị mẫu:

+ Chọn đối tượng: hành ta, hành tây

+ Trồng hành trên khay cát ẩm

- Cố định mẫu: Củ hành tây, hành ta, ngâm trong cát ẩm cho hành ra rễ Khi rễ dài

0,5-1,5cm cắt rễ đem đi cố định

mẫu: đun rễ

ở nhiệt độ

600C trong HCl 1N, trong thời gian 5 phút

bản ép quan sát NST.

Cắt rễ rửa bằng nước

Rửa bằng cồn 80 0

Củ hành với rễ dài

khoảng 0,5-1,0cm Ngâm rễ trong Carnoy (khoảng 2 - 4h) Giữ rễ trong cồn 70 0 và trữ ở 4 0 C

Hình 1 Phương pháp cố định mẫu ở rễ hành

Thu hoạch

- Mỗi SV làm được ít nhất 1 tiêu bản đạt yêu cầu, quan sát được các NST và xác định được số lượng NST của mẫu

- Vẽ lại kết quả quan sát được

Đánh giá kỹ năng thực hành của sinh viên thông q

BÀI 8 QUAN SÁT HÌNH THÁI NHIỄM SẮC THỂ KHỔNG LỒ

1 Mục đích, yêu cầu

- Thực hành quy trình và thực hành các thao tác mổ ấu trùng ruồi dấm và tách tuyến nước bọt để làm tiêu bản ép quan sát NST khổng lồ

- Rèn luyện kỹ năng làm tiêu bản tạm thời, kỹ năng sử dụng kính hiển vi để quan sát tiêu bản NST

2 Chuẩn bị

• Hoá chất: Nước cất, NaCl 0,6%, thuốc nhuộm Orcein.

• Dụng cụ: Kính hiển vi quang học có độ phóng đại từ 100 đến 400 lần Ống

nghiệm có đường kính 2,5 cm, đĩa đồng hồ, giấy thấm, đèn cồn, kéo nhỏ, dao lam, kim nhọn, kim mũi mác, lam kính, lamen

• Mẫu vật: ấu trùng ruồi dấm tuổi 3.

3 Nội dung

Nghiên cứu NST khổng lồ ở tuyến nước bọt ấu trùng ruồi giấm

• Mẫu vật: Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) nuôi để lấy ấu trùng

Rễ hành

trong cồn 70 0 Thuỷ phân trong HCl

1N ở 60 0 10-30 phút

Rửa mẫu bằng nước cất

Nhuộm Carmin 2%

trong 30 phút trong 10 phút

Hình 2 Quy trình làm tiêu bản tạm thời ở rễ hành

Cắt đầu rễ (1-2mm)

Nhỏ 1 giọt Axetic 45%

Đậy lamen

Cắt vài lát chuối chín, cho vào ống nghiệm, đặt gần vại dưa hoặc sọt rác, quan sát ruồi bay vào, khi có 4-6 con thì đậy nút bông Theo dõi ruồi phát triển và đẻ trứng, trứng nở

thành ấu trùng Khi ấu trùng dài 0,5 cm là được

• Mổ ấu trùng, tách tuyến nước bọt:

Lấy bút lông bắt ấu trùng ra cho vào đĩa đồng hồ

có nước cất để rửa sạch thức ăn, đặt ấu trùng lên lam kính, nhỏ 1 giọt NaCl 0,6%, dùng 2 kim nhọn giữ đầu và đuôi, xé rách thân ấu trùng, tìm và tách lấy tuyến nước bọt (xem hình sau): tuyến nước bọt của

ấu trùng ruồi dấm có 2 thùy trong suốt và nối với nhau bằng 1 ống chung

• Làm tiêu bản ép quan sát NST.

Khi đã tách được tuyến bước bọt, gạt sạch các phần thừa, nhỏ 1 giọt Orcein lên tuyến nước bọt, hơ qua ngọn lửa đèn cồn, đậy đĩa đồng hồ và nhuộm trong 10-15 phút Ép lamen và quan sát tiêu bản trên KHV

3 Thu hoạch

- Mỗi SV làm được 1 tiêu bản đạt yêu cầu, quan sát được các NST Giải thích sự hình thành NST khổng lồ và ý nghĩa của nó

phần miệng

Ống tiêu hoá

Tuyến nước bọt

Thể mỡ Đầu

Ống

nghiệm

Ruồi

Lát chuối chín Nút bông

- Vẽ lại kết quả quan sát được.

MỘT SỐ HÌNH ẢNH THAM KHẢO

(1) (2)

(3) (4)

(5) (6)

IV ph¬ng ph¸p th«ng kª X2

V sö dông thiÕt bÞ vµo bµi gi¶ng